利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～70℃进行转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成；本发明所述含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸的制备方法， 特别涉及一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法。

(二)背景技术

1-氰基环己基乙酸是合成加巴喷丁的关键中间体，目前主要用化学法 生产，反应条件苛刻，产生的废气须大量碱液吸收，步骤较多，收率较低。

腈水解酶能够实现有机腈化合物的一步区域选择性水解合成对应的 有机羧酸。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且 具有比较高的区域选择性和立体选择性。近年来，利用腈水解酶进行氰基 水解合成有机羧酸已经成为研究的热点，大量文献、专利报道了利用腈水 解酶的区域选择性在有机羧酸合成中的应用。

Zhu等人报道了来自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的 腈水解酶bll6402(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)， 发现此腈水解酶可以催化各种双腈，对部分双腈(包括1-氰基环己基乙 腈及其类似物)具有较高的区域选择性。

Sophie Bergeron等人报道了一株腈水解酶BD9570(来自Diversa) (Sophie Bergeron,Organic Process Research & Development 2006,10, 661-665)，此腈水解酶可以催化3-羟基戊二腈合成阿托伐他汀侧链关键 手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸，具有较高的区域选择性和立体选择 性。

Zhiyi Xie等人报道了一株来自于Arabidopsis thaliana的腈水解酶 AtNit1(Zhiyi Xie,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,41, 75–80)，该腈水解酶可以催化异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体 (3S)-3-氰基-5-甲基己酸，具有很高的区域选择性和立体选择性。

John E.Gavagan等人报道了一株来源于Acidovorax facilis 72W腈水 解酶(John E.Gavagan,J.Org.Chem.,1998,63,4792-4801)，该脂肪族腈 水解酶对于α,ω-双腈具有较好的区域选择性。专利US2005009157 A1也 报道了该腈水解酶可以催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰 基环己基乙酸。

专利US2005009157 A1还报道了商品化腈水解酶NIT-104，NIT-105， NIT-106(来自Biocatalytics Inc.)以及来自菌株Bacillus sphaericus的腈 水解酶对于1-氰基环己基乙腈具有区域选择性活力。

Carmela Bengis-Garber等人报道了菌株Rhodococcus rhodochrous  N.C.I.B.11216中的腈水解酶对于α,ω-双腈的催化具有区域选择性。且该 菌株的区域选择性与底物α,ω-双腈的碳链长度以及培养时所用的诱导剂 有关。(Carmela Bengis-Garber,Appl Microbiol Biotechnol(1989)32:11-16)

Chandrani Mukherjee等人报道了一株来自于Synechocystis sp.Strain  PCC6803的腈水解酶(Chandrani Mukherjee,Eur.J.Org.Chem.2006, 5238–5242)，该腈水解酶催化各种α,ω-双腈，其区域选择性与α,ω-双腈 的碳链长度有很大的关系。随着碳链长度的增加，该腈水解酶的区域选择 性逐渐下降。

迄今为止，有关对1-氰基环己基乙腈具有区域选择性催化活力的腈 水解酶报道较少，主要来自Acidovorax facilis 72W，Bradyrhizobium  japonicum USDA110，Bacillus sphaericus以及商品化腈水解酶NIT-104、 NIT-105、NIT-106。但是这些腈水解酶催化1-氰基环己基乙酸存在催化活 性较低和催化剂用量较大的问题。所以筛选新型生物催化剂，开发高效加 巴喷丁关键中间体酶法合成工艺，建立绿色经济的加巴喷丁合成新工艺具 有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的在于解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基 环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本 较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。

本发明提供一种水解1-氰基环己基乙腈的区域选择性腈水解酶，该 酶在催化上述反应时具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境 友好。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法， 所述方法为：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离 心，以湿菌体作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为 3.0～10.0的缓冲液为反应介质(优选pH值为7的磷酸缓冲液)，在25～70 ℃(优选35℃)进行转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸 的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述含重组腈 水解酶基因的工程菌由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。 所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，优选100mmol/L，所述湿菌体的质量 终浓度为10～100g/L，优选50g/L。

进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工 程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm 培养10～12小时，获得种子液；随即将种子液以体积浓度2％的接种量接 种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养 至培养液的OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG， 28℃、150rpm诱导培养10小时，将培养液离心，取沉淀水洗，获得湿菌 体即为催化剂；所述LB液体培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母 提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7。

本发明所述1-氰基环己基乙酸分离纯化的方法通常为：转化结束后， 转化液内加入7～8mL、10.5M的NaOH溶液(使产物较好溶解，提高回 收率)，调pH至8.5-9.0，离心(9000rpm，10min)，取上清液。往上清 液中按体积比1:1比例加入乙醇水溶液(含水量5％体积浓度)(去除菌体 破碎产生的核酸，蛋白质等)，抽滤。取滤液，减压蒸馏(温度控制在50 ℃以下)。馏出酒精后的剩余液体内加入5‰的HC-767针剂用活性炭吸附 杂质，抽滤。滤液内加盐酸调pH至2.5左右，静置，抽滤，将漏斗内含 有单酸的滤液回收烘干(35℃以下)，即获得产物1-氰基环己基乙酸。

本发明所述生物催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的反 应方程为：

本发明所述含腈水解酶基因的工程菌的构建方法为：利用蛋白质 (PDB)和(NCBI)数据库对腈水解酶基因序列进行筛选，以紫红红球 菌K22(Rhodococcus rhodochrous K22)的腈水解酶基因(GeneBank  accession no.D12583)序列为基础，依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码 子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了SEQ ID NO.2 所示的腈水解酶基因RkN，该基因编码的腈水解酶的氨基酸序列为SEQ  ID NO.1所示。然后将上述腈水解酶基因转入载体中构建重组表达载体 pET28b(+)–RkN，再用重组表达载体转化宿主菌(优选大肠杆菌BL21 (DE3))，构建含腈水解酶基因的工程菌。

经过序列比对，Rhodococcus rhodochrous K22腈水解酶与已有报道对 于1-氰基环己基乙腈具有催化活力的腈水解酶—Acidovorax facilis 72W 腈水解酶(GeneBank accession no.ABD98457)和Bradyrhizobium  japonicum USDA110的腈水解酶bll6402(GeneBank accession no. BAC51667)同源性分别为68.15％和40.31％。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种微 生物催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的方法，本发明所述 含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和很高的催化活 力(比酶活达到4800U/g)，生产过程对环境友好；解决了传统的化学法 水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中反应条件苛刻、反 应需要大量的有机溶剂、成本较高、收率较低，环境污染较为严重的问题。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

以下实施例所用主要实验材料来源为：

大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体 pET-28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ购自 Fermentas公司，T4 DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司； 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品。DNA Marker 和染色剂Gold View购自TaKaRa公司；Axygen DNA凝胶回收试剂盒、 质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。

实施例1：腈水解酶基因的合成

利用蛋白质PDB和NCBI数据库对腈水解酶基因序列进行筛选，得 到一个腈水解酶基因(GeneBank accession no.D12583)。该腈水解酶来源 于紫红红球菌K22(Rhodococcus rhodochrous K22)，根据Rhodococcus  rhodochrous K22腈水解酶的序列(GeneBank accession no.D12583)，依 据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，根据表达载体pET28b(+)的特 点设计了酶切位点Nco Ⅰ、Xho Ⅰ，通过基因工程的常规操作以全合成的 方法合成了该段腈水解酶基因RkN(SEQ ID NO.2所示)，编码酶的氨基 酸序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：腈水解酶基因表达载体及其重组转化子的构建

合成的腈水解酶基因RkN与pET28b(+)都分别用Nco I和Xho I 进行双酶切，大约酶切6h后，回收酶切产物，利用T4连接酶在16℃下 连接16小时，得到重组表达质粒pET28b(+)-RkN。将表达载体pET28b (+)-RkN转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(终 浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出菌落(黄 白色圆形菌落)。随机挑取单克隆，培养后提取质粒进行测序，测序结果 表明得到阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN。

实施例3：腈水解酶的表达

实施例2中得到的重组转化子E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN接 种到LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10-12小时，然后按体积浓度 2％的接种量接种至含有卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB液体培养基进 行扩大培养，37℃，150rpm培养至培养液的OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃，150rpm 诱导培养10小时。培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次得到湿菌 体。

实施例4：腈水解酶活力验证

对实施例3中得到的湿菌体进行静息细胞催化反应，以验证腈水解酶 对于1-氰基环己基乙腈的活力。

实验方法：称取0.5g湿菌体(终浓度50g/L)悬浮于10mL磷酸氢二 钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入0.296g1-氰基环己基 乙腈(终浓度200mM)，35℃恒温水浴反应30min。反应完成后，取1mL 反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高效液相色谱(C18柱) 分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相为缓冲液(0.58g磷酸 二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈 ＝76∶24，柱温为40℃。同样条件下，以E.coli BL21(DE3)空载体和未诱 导的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN以及含有Acidovorax facilis 72W 腈水解酶的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-AcN为对照，结果如表1所示。 酶活定义为：在一定条件下，每分钟催化底物生产1μmol产物所需的酶 量定义为一个活力单位，记为U。

表1：腈水解酶RkN活力验证结果

实施例5：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化100mM 1-氰 基环己基乙腈。

实验方法：称取0.5g湿菌体(实施例3制备，终浓度50g/L)悬浮于 10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入 0.148g1-氰基环己基乙腈(终浓度100mM)，35℃恒温水浴反应4小时。 反应完成后，取1mL反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高 效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相 为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸 调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24，柱温为40℃。结果：产物1-氰基环己 基乙酸的浓度为99mM，产率为99％。

实施例6：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化200mM 1-氰 基环己基乙腈

实验方法：称取0.5g湿菌体(实施例3制备，终浓度50g/L)悬浮于 10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入 0.296g1-氰基环己基乙腈(终浓度200mM)，35℃恒温水浴反应30min。 反应完成后，取1mL反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高 效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相 为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸 调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24，柱温为40℃。

结果如下：产物1-氰基环己基乙酸的浓度为192mM，产率为96％。

实施例7：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化500mM 1-氰 基环己基乙腈

实验方法：称取实施例3方法制备的10g湿菌体(终浓度100g/L) 悬浮于100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)， 加入7.4g1-氰基环己基乙腈(终浓度500mM)，35℃恒温水浴反应12小 时。反应液使用2倍体积的乙酸乙酯萃取，弃去有机相。水相加入醋酸酸 化，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取。有机相35℃烘干，得到1-氰基环 己基乙酸。

结果如下：得到产物1-氰基环己基乙酸6.75g，产率为91.2％。