miR-361-5p作为内参miRNA在肿瘤诊断和监测中的应用

摘要

本发明涉及miR-361-5p的一种新用途，即，作为内参miRNA的应用。本发明还提供一种miRNA标准化定量的方法。本发明的优点在于，miR-361-5p在多数肿瘤及对照正常组织中表达最为稳定，最适合作为内参miRNA用于肿瘤miRNA的检测结果的标准化。本发明提供的内参miRNA、miRNA标准化定量的方法、定量检测miRNA的芯片或试剂盒可以使检测结果标准化，值得广泛推广。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是miR-361-5p作为内参miRNA在肿瘤诊断和监测中的应用。

背景技术

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20~25个核苷酸。miRNA参与各种各样的调节途径，在肿瘤生成、增殖、代谢、凋亡中都发挥着极为重要的作用，在肿瘤诊断和监测等方面也有着广阔的发展前景。

近年来已有多种方法被用于定量检测样本中的miRNA，如qRT-PCR、探针杂交和microarray等。上述方法会因为样本中miRNA的含量和质量、反应效率、以及试验操作等原因产生较大的误差，此时便需要采用内参miRNA对这些方法的检测结果进行标准化来消除这些误差，因此上述方法的准确性很大程度上取决于所采用的内参miRNA。并且在比较不同实验室及不同实验方法所取得的检测结果时，采用内参miRNA对结果进行标准化也十分重要。

理想的内参miRNA需要在不同样本中均保持稳定的高表达。但目前仍缺乏对内参miRNA的系统性评估与研究，内参miRNA的选择仍主要依据传统经验，而研究已表明目前常用的内参miRNA在不同情况下表达具有较大差异性，难以符合标准化的要求。因此，本领域迫切需要鉴定最佳内参的miRNA，以用于miRNA检测结果的标准化。本发明提供目前还未见报道的最佳内参miRNA。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供miR-361-5p的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：miR-361-5p作为内参miRNA的应用。

miR-361-5p作为内参miRNA在肿瘤诊断和监测中的应用。

一种miRNA标准化定量的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)测定样本中待测miRNA的绝对浓度；

(2)将步骤(1)获得的待测miRNA的绝对浓度与样本中内参miRNA的绝对浓度进行比较，从而获得待测miRNA的相对浓度，所述的内参miRNA为miR-361-5p或包含miR-361-5p的miRNA的组合。

在步骤(2)中，将目的miRNA的绝对浓度与样本中miR-361-5p的绝对浓度进行比较。

所述的样本为肿瘤组织、肿瘤患者血液、血浆、血清、体液、细胞或者其组合。

一种定量检测miRNA的芯片或试剂盒，所述的芯片或试剂盒特异性地检测miR-361-5p或包含miR-361-5p的miRNA组合。

本发明优点在于：

miR-361-5p在多数肿瘤及对照正常组织中表达最为稳定，最适合作为内参miRNA用于肿瘤miRNA的检测结果的标准化。本发明提供的内参miRNA、miRNA标准化定量的方法、定量检测miRNA的芯片或试剂盒可以使检测结果标准化，值得广泛推广。

附图说明

附图1是miR-361-5p在14种肿瘤中的表达情况。

附图2是miR-361-5p、其它部分miRNA和常用内参在肺鳞癌、肺腺癌和食管癌中的qRT-PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明涉及的miR-361-5p，对应序列为5’-uuaucagaaucuccagggguac-3’（如SEQ NO.1所示）。

实施例1 肿瘤miRNA表达数据分析

从TCGA数据库中获得肿瘤及正常对照组织的miRNA测序结果，共包含14种常见肿瘤的589例正常对照组织和5727例肿瘤组织样本数据，见表1。对mature miRNA和star miRNA进行分类，去掉颈环、前体和未注释的数据，并按照miRbase V21.0的MIMAT序列号整理mature miRNA和star miRNA，计算每种miRNA的表达量，以RPM值表示。

表1分析所纳入的14种常见肿瘤及相应正常组织和肿瘤组织样本数量

随后参照其它对内参基因的研究，基于以下的标准鉴定每种肿瘤类型中最稳定高表达的miRNA：

(1)Mean(N) > 100 且Mean(T) > 100；

(2)CV(N) < 0.5且CV(T) <0.5；

(3)Mean(N) / Mean(T) <1.3且Mean(T) / Mean(N) <1.3。

此处，Mean表示某种miRNA在正常或肿瘤组织中的平均表达量，CV表示某种miRNA在正常或肿瘤组织中表达量的变异系数，(N)表示正常组织，(T)表示肿瘤组织。

每种肿瘤类型中符合上述标准的miRNA见表2，这些miRNA在该肿瘤类型中稳定高表达，适合作为该种肿瘤的内参miRNA用于肿瘤研究和应用。

表2 14种常见肿瘤中符合标准的适合作为内参的miRNA

其中miR-361-5p在9种常见的肿瘤类型中符合上述标准，在所有miRNA中最多，见表3。因此，可以认为miR-361-5p在大多数肿瘤中稳定高表达，最适合作为内参miRNA用于大多数肿瘤的研究和应用。miR-361-5p在所有类型肿瘤中表达情况见附图1。附图1中“*”表示miR-361-5p在这些类型的肿瘤中稳定高表达，适合作为内参miRNA。

表3 miRNA适合作为内参的肿瘤类型数目

实施例2 miR-361-5p与其它miRNA以及常用内参miRNA在肺鳞癌、腺癌和食管癌中的比较

采用qRT-PCR的方式，检测miR-361-5p以及let-7i-5p、let-7a-5p、miR-28-5p、miR-99b-5p和常用内参miRNA U6、RNU6B、RNU48、miR-101-3p和miR-151a-5p等在肺鳞癌、腺癌和食管癌中的表达情况。其中包含肺鳞癌组织40例及正常对照组织20例，肺腺癌组织40例及正常对照组织20例，食管癌组织40例和正常组织20例。随后采用geNorm和NormFinder分析检测结果，比较这些miRNA及常用内参的稳定性。具体步骤如下：

(1)提取组织样本中的miRNA；

(2)采用qRT-PCR检测上述miRNA和常用内参的表达；

(3)采用geNorm和NormFinder分析检测结果。

其中，步骤(1)采用天根公司所提供的商品化miRcute miRNA 提取分离试剂盒所提取。步骤(2)首先采用天根公司所提供的商品化miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录。随后采用天根公司所提供的miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒在Life Technology公司所提供的7500HT 荧光定量PCR仪上进行检测。步骤(2)所用的引物均由天根公司合成提供。

各miRNA及常用内参的检测结果见附图2，geNorm和NormFinder分析结果见表4。结果可见miR-361-5p在肺鳞癌、腺癌和食管癌组织中均非常稳定，较其它miRNA和常用内参具有优势。

表4 miR-361-5p、其它部分miRNA和常用内参在肺鳞癌、肺腺癌和食管癌中的稳定程度排名

实施例3 miRNA标准化定量的方法

一种miRNA标准化定量的方法，包括以下步骤：

(1)测定样本中待测miRNA的绝对浓度；

(2)将步骤(1)获得的待测miRNA的绝对浓度与样本中内参miRNA的绝对浓度进行比较，从而获得待测miRNA的相对浓度，所述的内参miRNA为miR-361-5p或包含miR-361-5p的miRNA的组合。

在步骤(2)中，将目的miRNA的绝对浓度与样本中miR-361-5p的绝对浓度进行比较。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  复旦大学附属中山医院

<120>  miR-361-5p作为内参miRNA在肿瘤诊断和监测中的应用

<130>  /

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  22

<212>  RNA

<213>  智人(Homo sapiens)

<400>  1

uuaucagaau cuccaggggu ac                                              22