一种具有过氧化氢酶活性的酶及其编码基因

摘要

本发明的目的是提供一种具有过氧化氢酶活性的酶及其编码基因。本发明采用基因工程技术手段将该基因转化入黑曲霉(Aspergillus niger)中，构建得到了高效表达该酶的重组菌株，从而有利于实现该酶的工业化生产和广泛应用。本发明所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.0，能有效的催化过氧化氢分解生成水和氧气。利用本发明所述酶处理H2O2，15min时即将H2O2全部分解，性能优于市售产品，因此可广泛的运用于食品、纺织、医药、造纸等工业生产，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种具有过氧化氢酶活性的 酶及其编码基因。

背景技术

过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又称触酶(Catalase，简称CAT)，是一 类催化底物氧化还原反应的酶，其主要功能是催化过氧化氢分解成氧气和水。 CAT广泛分布于动物、植物组织中和绝大多数的好氧菌和少数的厌氧微生物中。 动物肝脏、红细胞、植物叶绿体以及放线菌、细菌、真菌也含有CAT，其中哺 乳动物组织中CAT含量差异较大，肝脏和结缔组织含量分别为最高和最低， CAT在上述细胞组织中主要是与细胞器如线粒体和过氧化物体结合的形式存 在，红细胞中则以可溶的状态存在。不同来源的CAT的性质差距较大，从动植 物和人体内获得的CAT的热稳定性较差；而微生物来源的CAT的稳定性相对 表现较好，此外，微生物还具有易培养、来源广、生产周期短且成本低等优点。

目前国内市场的过氧化氢酶主要来源动植物提取，而来自微生物细胞提取 的也较多。2001年廖文俊等从基因工程菌表达产物中分离纯化获得过氧化氢 酶。王凡强等从重组大肠杆菌培养后的菌体破碎液中，经热处理，硫酸铵分级 沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析、HiPrep16/10Phenyl疏水作用层析、 Superdex200HR10/30凝胶层析提取后得到电泳纯的过氧化氢酶。2005年张心 齐等从一株低度嗜盐嗜碱芽孢杆菌中纯化得到一种碱性过氧化氢酶。2009年 T·C·道奇K·M·霍夫曼等在里氏木霉中表达来自黑曲霉的catR基因，获得 与黑曲霉中catR表达相比提高的过氧化氢酶产量(中国专利号101960006)。2011 年Chen；Jian等通过在芽孢杆菌发酵中补加六偏磷酸钠使得发酵液过氧化氢酶 活性达19700U/mL(美国专利号8,722,364)。2013年屈玲等对幽门螺杆菌的过 氧化氢酶进行重组表达和纯化，经亲和层析的重组蛋白纯度约为85％。因此， 微生物过氧化氢酶必将成为过氧化氢酶工业化发展的重要方向，利用基因工程 技术手段开发出新型活性高的过氧化氢酶菌株具有重要的应用价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有过氧化氢酶活性的酶及其编码基因。本发明 采用基因工程技术手段将该酶的编码基因转化入黑曲霉(Aspergillus niger)中， 构建得到了高效表达该酶的重组菌株，从而有利于实现该酶的工业化生产和广 泛应用。

本发明一方面提供了一种基因，所述的基因编码如下的酶：

1)其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的， 具有1)中酶的活性，由1)所衍生的酶。

上述的基因是从粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)中分离的。

上述基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明提供了一种表达载体，其包含上述基因的核苷酸序列。

本发明提供了一种表达宿主细胞，其携带有上述的表达载体。

上述表达宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)。

本发明还提供了一种酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

上述酶在降解过氧化氢中的应用。

本发明所述酶具有过氧化氢酶活性，其最适作用温度为60℃，最适作用pH 为6.0，能有效的催化H₂O₂分解生成水和氧气。利用本发明的酶处理H₂O₂，15min 时即将H₂O₂全部分解；而对照组所述市售过氧化氢酶，在20min时才将H₂O₂全 部分解，且其在5min，10min，15min时对H₂O₂的分解效果均低于本发明所述 过氧化氢酶。本发明的酶性能优于市售产品，因此可广泛的运用于食品、纺织、 医药、造纸等工业生产，应用前景广阔。

附图说明

图1：本发明构建的重组表达质粒pGm-2092图谱。

图2：阳性转化子黑曲霉ZL-3发酵液上清SDS-PAGE电泳图，其中箭头所 指87.2KD处的蛋白条带即为本发明的酶。

图3：本发明分离的酶作用温度-酶活曲线图。

图4：本发明分离的酶作用pH-酶活曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限 于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆 布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解 和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1：基因的克隆

以粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)全基因组DNA为模板进行PCR扩增， 其中PCR过程所用到的引物分别为：

正向引物：

5′-GTTAATTAAAGGATGCCTGAGCACACACTCTCCCCCC-3′；

反向引物：

5′-TGCTCTAGACTAGTGTACGTTGTTCTGCTTGCGG-3′；

其中下划线处分别表示Pac1、Xbal两个限制性内切酶的酶切位点。

PCR扩增条件为：98℃30s；98℃10s；72℃1.5min30个循环；72℃10min， 所用的DNA聚合酶为Phusion DNA聚合酶；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩 增产物。

用Pac1和Xba1两种限制性内切酶分别对PCR产物以及载体pGm进行酶 切；运用胶纯化试剂盒对这两种酶切产物进行纯化，并用T₄DNA连接酶连接 上述两个酶切产物；将连接后的产物转化大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素进行选 择。为确保正确，对若干个转化子进行菌落PCR并进行测序。

测序结果显示，上述PCR扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；其编 码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；多个克隆的测序结果都一致。

经NCBI Blast比对发现，SEQ ID NO：1与来源于Pseudogymnoascus  destructans的过氧化氢酶同源性最高，为64％，与来源于Beauveria bassiana的 过氧化氢酶同源性为63％。因此表明本发明应是一个编码过氧化氢酶的新等位 基因。

使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中提取 重组质粒，命名为pGm-2092(质粒图谱见图1)。

实施例2重组质粒转化黑曲霉G1菌株及验证

吸取黑曲霉(Aspergillus niger)G1孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培 养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养 基中，在30℃、200rpm的条件培养14～16h。

用无菌的Miracloth滤布收集菌体，并用solution A冲洗一次，在无菌条件 下用棉签将其转移到40ml的裂解液中，在30℃、200rpm条件下裂解两个小时， 用显微镜观察原生质体的形成情况。

用无菌的Miracloth滤布过滤上述裂解液，用两个50ml无菌离心管收集原 生质体并用solution B冲洗定容使每管大约25ml。在2000rpm条件下离心5min 弃去上清，用20ml solution B对沉淀再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL solution B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上 清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数 目在1×10⁷个/mL左右。

在冰上向预先冷却的15ml离心管中加入100μL上述原生质体、10μL重组 质粒pGm-2092、12.5μL solution C冰浴20min。与此同时将预先配制好的上层试 管MMSA融化并置于55℃水浴中。

取出冰浴中的15ml离心管，向其加入1ml solution C、2ml solution B并混 匀后作为混合液。

向3个融化的上层MMSA试管中的每一个中加入1ml上述混合液混匀并立 即倒于MMSA平板中，将此平板在30℃培养箱中培养7-10d直到长出转化子。

将长出的转化子菌株接入到二次筛选培养基中培养直至长出黑色菌落；提 取菌落的基因组DNA，并按照实施例1所述PCR反应条件进行PCR扩增；通 过胶回收与测序验证，验证结果正确的菌株即为阳性转化子，将其中一株阳性 转化子命名为黑曲霉ZL-3(Aspergillus niger ZL-3)。

Solution A：2.5mL1M K₂HPO₄，2.5mL1M KH₂PO₄，48.156g MgSO₄，加 入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

Solution B：5mL1M Tris(pH7.5)，2.77g CaCl₂，109.32g山梨醇，加入dlH₂O 至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

Solution C：250g PEG4000，2.77g CaCl₂，5mL1M Tris(pH7.5)，加入dlH₂O 至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

裂解液：将0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma) 溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

MMSA平板：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52g  KH₂PO₄，218.5g山梨醇，1ml微量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH₂O至终体 积972.5mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40％ 葡萄糖和2.5mL20％MgSO₄。

MMSA上层琼脂试管：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl， 1.52g KH₂PO₄，218.5g山梨醇，1ml微量元素(见下)，10g低熔点琼脂糖，加 入dlH₂O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40％葡萄糖和2.5mL20％MgSO₄，之后立即 分装于无菌试管中，每管10mL。

微量元素：在250mL dlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·₇H₂O，0.4 g CuSO₄·5H₂O，0.15g MnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L，用0.22μm的 微孔滤膜过滤除菌。

CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入 dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH₂O 至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

二筛培养基：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH₂PO₄，1ml微量元素，20g琼脂，加入dlH₂O至终体积972.5mL，高压蒸汽 灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40％葡萄糖和2.5mL20％ MgSO₄。

实施例3阳性转化子菌株的发酵验证

挑取阳性转化子黑曲霉ZL-3，接种于20ml TSB发酵培养基中，在30℃， 200rpm的条件下培养5d；所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000g条件下 离心10min，收集上清液；将上清液在浓度为10％的SDS-PAGE胶上进行电泳 分析。结果如图2所示，箭头所指87.2kDa处有一清晰的蛋白条带，与本发明所 述酶的理论分子量大小一致，从而说明所述酶在黑曲霉ZL-3中得到有效表达。

TSB发酵培养基：12g NaNO₃，0.5g KCl，1.5g KH₂PO₄，2.05g MgSO₄·7H₂O， 3.5g NaH₂PO₄·H₂O，45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，1g吐温80，1mL微 量元素(见下)，加入dlH₂O至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用 0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的40％麦芽糖。

微量元素：在250mL dlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·₇H₂O， 0.4g CuSO₄·5H₂O，0.15g MnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L，用0.22μm的 微孔滤膜过滤除菌。

实施例4过氧化氢酶活性测定

1、测定方法：紫外分光光度法

2、测定的原理：过氧化氢在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过 氧化氢，使溶液的吸光度(A₂₄₀)随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速 度可测出过氧化氢酶的活性。

3、测定过程：将紫外分光光度计通电后预热30min，在吸收波长240nm处 机械调零后用磷酸盐缓冲液调零。用5ml的移液管准确移取2.9ml底物溶液至 1cm石英比色皿中，用50-250ul的微量移液器移取100ul待测样品，加入上述石 英比色皿中，摇匀后立即在吸收波长240nm处测A值，每隔5s记录一个A值， 测定时间为30s.在Excel中将吸光度对时间做一次方程曲线，选取曲线方程斜率 K的绝对值计算酶活。控制K值在0.0031-0.0020之间，若K不在此区域内，需 将样品重新稀释到合适倍数测定。

4、酶活力计算：

酶活力(IU/ml或IU/g)＝N×K×4.13×10⁴

式中：

N-稀释倍数，

K-吸光度变化的曲线的斜率的绝对值，

采用上述方法测得重组菌株黑曲霉ZL-3发酵上清液的酶活高达 640.15U/mL，也说明了本发明所述酶具有过氧化氢酶活性。

实施例5酶学性质分析

1、最适作用温度

以NaH₂PO₄-Na₂HPO₄为缓冲溶液(pH7.0)，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、 70℃、80℃条件下测定上述黑曲霉ZL-3发酵液上清的酶活，作温度-酶活曲线(图 3)。从图3可以看出，本发明所述酶的最适作用温度为60℃。

2、最适作用pH

以pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液分别稀 释上述黑曲霉ZL-3发酵液上清，并在60℃条件下测定上清的酶活，作pH-酶活 曲线(图4)。从图4可以看出，本发明所述酶的最适作用pH为6.0。

实施例6本发明所述酶的实际应用

1、试剂：

1)用NaH₂PO₄-Na₂HPO₄为缓冲溶液(pH7.0)配制浓度为200mg/L H₂O₂1L；

3)本发明所述酶1000U/mL。

2、仪器：

容量瓶等玻璃仪器；BL-310A精密电子天平；DragonMed标准移液器 100～1000ul；5～50ul；DMI-010钻石牌数字式石英电子秒表。

3、测定方法：

1)测定原理：

过氧化氢酶能够分解H₂O₂生成氧气和水，将酶与H₂O₂作用一段时间后， 用H₂O₂试纸测试残余的H₂O₂量，残余量越小说明过氧化氢酶的效果越好。

2)具体测定：

量取100mL H₂O₂溶液(200mg/L)，40℃水浴，预热5min；然后加入0.5mL 本发明所述酶(1000U/mL)，立即计时(加液时开始计算时间)；加完酶液后， 搅拌均匀，即得待测液；分别于5min、10min、15min、20min时，将H₂O₂试纸 (默克)浸于待测液中，1sec后取出，15sec后读数。同时以市售过氧化氢酶产 品作为对照组，稀释至1000U/mL，在相同添加量的情况下，与本发明所述酶进 行效果比较。具体结果如表1所示：

表1过氧化氢酶对H₂O₂浓度的影响

从表1的结果可以看出，利用本发明所述酶处理H₂O₂，15min时即将H₂O₂全部分解；而对照组所述市售过氧化氢酶，在20min时才将H₂O₂全部分解，且 其在5min，10min，15min时对H₂O₂的分解效果均低于本发明所述酶。从而说 明本发明所述酶能有效分解H₂O₂，且效果要优于市售产品，应用前景广泛。

本发明所述酶具有过氧化氢酶活性，能有效催化过氧化氢分解生成水和氧 气，因此可广泛运用于食品、纺织、医药、造纸等领域中去除生产过程中的过 氧化氢，比传统的方法更高效，节能，环保。