血红铆钉菇多糖在制备抗酪氨酸酶抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了血红铆钉菇多糖在制备抗酪氨酸酶抑制剂中的应用。本发明发明人在中国东北小兴安岭，收集到14种常见的野生大型真菌。通过测试14种大型真菌多糖的抗酪氨酸酶活性，结果发现血红铆钉菇多糖对酪氨酸酶的抑制率为85％，IC

说明书

技术领域

本发明涉及血红铆钉菇多糖的新用途，特别涉及血红铆钉菇多糖在制备抗酪氨 酸酶抑制剂中的应用。还涉及血红铆钉菇多糖的提取方法。

背景技术

大型真菌(Macrofungi或Macromycetes)，是指那些能够形成肉眼可见的大型 子实体的真菌，它们多数属于真菌界的担子菌门(Basidiomycota)，其余的属于子 囊菌门(Ascomycota)。有性孢子产生在外部微小棒状结构的大型真菌隶属于担子 菌门；有性孢子产生在微小囊状结构的大型真菌隶属于子囊菌门。

大型真菌被认为是重要的天然资源，根据用途可以将大型真菌分为食用菌和药 用菌。大型真菌富含多糖、氨基酸、维生素等营养物质，被认为是低脂肪、高营养 的健康食品。一些大型真菌被发现了具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗糖尿病和降血 脂的作用，这些活性和大型真菌产生的多糖、不饱和脂肪酸、蛋白酶等活性成分相 关。大型真菌除了食用与药用外，还被应用在其它很多方面。例如，甲氧基丙烯酸 酯类杀菌剂的活性母核，最初就是在大型真菌中分离出来的。

大型真菌根据它的营养方式可以分为，寄生型大型真菌、腐生型大型真菌。主 要从活体生物，获取营养的大型真菌，被称为寄生型大型真菌；从非活体生物中， 获取营养的为腐生真菌。寄生菌中一部分真菌可以和寄主植物形成共生菌根，被称 为外生菌根型大型真菌。相比较而言，腐生菌较易人工培养，然后是寄生菌，菌根 菌较难人工培养。

我们国家幅员辽阔，被认为是生物多样性最丰富的国家之一，被记载的大型真 菌有3800种以上，其中伞菌类(如，蜜环菌)约有1600种，多孔菌类(如，云芝 菌)约1300种，腹菌(如，马勃菌)约300种，胶质类(如，木耳菌)约100种。自 古以来，中国人就有利用大型真菌的传统。食用菌方面：早在6000至7000年前我 们祖先就开始采食蘑菇了，文字记载的采食蘑菇的历史可以追溯至2000多年前， 中国已知的大型真菌近900种，其中有很多大型真菌被人工驯化培养，中国也是全 世界食用菌产量最高的国家，超过总量50％的食用菌产自中国。由于东西方饮食习 惯的差距很大，在许多国家认为是有毒的大型真菌，但在中国经过加工后就可以被 食用。自古以来，我国就有利用大型真菌入药的习俗，例如灵芝、冬虫夏草这些著 名的中药都属于大型真菌。

本发明的目的是通过分子鉴定技术与形态学鉴定技术相结合的方法鉴定收集 到的14种东北常见的野生大型真菌，调查这14种大型真菌的多种生物活性。通过 对14种野生大型真菌的研究，为进一步开发利用的这些真菌提供理论依据，使一 些闲置的、可再生的资源得到合理开发利用。

发明内容

本发明发明人在中国东北小兴安岭，收集到14种常见的野生大型真菌。首先对 这14种大型真菌进行鉴定，并且对它们的多糖含量、抗氧化、抗酪氨酸酶等活性 进行研究。通过形态学和分子生物学两种方法鉴定大型真菌，发现它们分别属于6 个科：其中多孔科4种、口蘑科3种、红菇科3种、环柄菇科3种、马勃科1种与 铆钉菇科1种。对这14种大型真菌的粗多糖进行了提取，然后对粗多糖提取物进 行了沉淀、脱脂与透析来进行纯化，获得了水溶性的纯化后的多糖。

接下来，本发明通过三种方法测试了14种大型真菌多糖的抗氧化活性，对于清 除自由基ABTS^·+活性方面大型真菌的纯化后多糖PPS的活性为16.9至535.8μmol/g TEAC，在铁离子还原力方面纯化后多糖PPS的活性为0.23至5.94mmol Fe/g，在 亚铁离子螯合力方面纯化后多糖PPS的活性为0.70至484.61μmol Fe²⁺/g发现有6 种大型真菌多糖的抗氧化活性较强，而且这6种大型真菌都可以食用。这6种真菌 分别是龟裂马勃、乳突环柄菇、奥氏蜜环菌、高大环柄菇、紫丁香蘑和黄小蜜环菌。 最强的为龟裂马勃菌(Handkea utriformis)，它的清除自由基活性为535.8 μmol/gTEAC，还原力活性为5.94mmol Fe/g，金属螯合力为274.8μmol Fe²⁺/g，都 是位于14种大型真菌的前两位的。

本发明还测试了14种大型真菌多糖浓度在1mg/ml时对酪氨酸酶的抑制率，其 中龟裂马勃菌和血红铆钉菇(Chroogomphus rutilus)对酪氨酸酶的抑制率超过了 50％，分别为61％和85％，通过测试这两种大型真菌其它浓度的多糖对酪氨酸酶的 抑制率，得到它们的IC₅₀值能达到0.78mg/ml和0.46mg/ml，尤其是血红铆钉菇的 多糖的活性甚至接近于熊果苷IC₅₀值(0.43mg/ml)。进一步实验发现，血红铆钉菇 的应该属于复合型酪氨酸酶抑制剂。

故，在此研究的基础上，本发明提出了血红铆钉菇(C.rutilus)多糖在制备抗 酪氨酸酶抑制剂中的应用。

在本发明中，优选的，所述的血红铆钉菇多糖是通过以下方法提取得到的：

(1)将血红铆钉菇的子实体，在30-50℃条件下烘干，直到质量不再变化，用 粉碎机把烘干的子实体磨成粉；

(2)用丙酮将干燥的血红铆钉菇菌粉在20-30℃条件下浸提三次，每次2-4小 时，离心去上清，然后用沸水提取2-4个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液；

(3)将步骤(2)收集得到的上清液与乙醇按照1:4-6的体积比混合，在0-10℃ 下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；

(4)沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到血红铆钉菇多糖的粗提取物。

在本发明中，更优选的，所述方法还包括将得到血红铆钉菇多糖的粗提取物进 一步脱蛋白纯化、透析以及再次利用乙醇沉淀，具体操作为：

(1)将氯仿与正丁醇混合配制成Sevag试剂，然后将血红铆钉菇多糖的粗提取 物与Sevag试剂混合，搅拌，离心；溶液分三层，上层为多糖溶液，下层为有机试 剂，中间层为去除的蛋白层，收集上层的多糖溶液；

(2)将收集的多糖溶液按照步骤(1)方法重复处理，直到去除蛋白质；

(3)用去离子水进行透析，透析袋的截留分子量为3500道尔顿，去除小分子， 获得的纯化的多糖溶液，加入5倍体积的乙醇，在4℃下，使多糖沉淀，离心分离， 获得沉淀，获得的沉淀再用水溶解，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。

其中，优选的，所述的Sevag试剂是将氯仿与正丁醇按照体积比5:1混合配制 而成。

其中，优选的，将所述的血红铆钉菇多糖的粗提取物先溶解于少量水中，然后 与Sevag试剂按照体积比为5:1进行混合。

其中，优选的，在步骤(3)中，还包括将获得的沉淀再用水溶解，然后再次 加入5倍体积的乙醇，在4℃下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀，以更加充分 去除醇溶性物质，最后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。

本发明的提出填补了一些大型真菌多糖研究的空白，如血红铆钉菇具有很好的 抗酪氨酸酶活性，而龟裂马勃、乳突环柄菇和黄小蜜环菌的多糖以前很少见到报道。 本发明的提出为中国东北野生大型真菌的合理利用提供了基础。

附图说明

图1为实施例1中多糖制备的技术路线图；

图2为大型真菌多糖的3种抗氧化活性测定结果；

图3为大型真菌多糖(1mg/ml)的抗酪氨酸酶活性测定结果；

图4为血红铆钉菇纯化后多糖的抗酪氨酸酶活性的动力学分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应 当理解的是，以下所述的实施例，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非 对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人 员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的 保护范围内。

本发明实施例中所涉及的实验材料、试剂与仪器

1、试验材料

2011年的9月，在中国东北小兴安岭收集了14种东北常见的大型野生真菌。

2、试剂与仪器

试剂：丙酮、无水乙醇、氯仿、苯酚等分析纯，来自北京化学试剂公司。分子 鉴定用的蛋白酶K，Taq酶、dNTP等试剂来自北京天根生化科技有限公司。酪氨酸 酶等来自Sigma化学试剂有限公司。玻璃棒、三角瓶、烧杯、冷凝管，胶头滴管、 移液管、容量瓶、抽滤瓶、蓝盖瓶、西林瓶、玻璃干燥器、圆底烧瓶等玻璃器皿， 来自蜀牛玻璃仪器有限公司。旋转蒸发仪RE-52AA来自上海亚荣生化仪器厂。舒 美KQ-600DE数控超声波清洗仪，来自昆山市超声仪器有限公司。85-2恒温磁力搅 拌器来自海门麒麟医用仪器厂。98-1-C数字控温电热套与101-1AB鼓风干燥箱来自 天津市泰斯特仪器有限公司，冷冻干燥机，来自博医康实验仪器有限公司，SHB-III 循环水式多用真空泵来自南京文尔仪器设备有限公司。冷冻离心机，来自湖南湘仪 离心机仪器有限公司。各种量程的移液器，来自上海大龙医疗设备有限公司。电泳 设备来自北京六一仪器厂。PCR仪PCR System 9700，来自加拿大Applied Biosystems 公司。

实施例1大型真菌的分子鉴定

方法：

大型真菌的分子鉴定，利用PCR技术，选择通用引物扩增大型真菌的ITS (Internal Transcribed Spacer,ITS内部转录间隔区)序列，然后进行测序和比对来完 成的，具体步骤如下：

1.收集到的大型真菌在鼓风干燥箱内35℃下干燥。

2.10mL的1M浓度的pH为8.0的Tris-Hcl，加入20ml的0.5M浓度的pH为 8.0的EDTA，再加入5ml的5M浓度的NaCl，加无菌水定容至100ml，配置成 DNA提取缓冲液100ml(即，100mM Tris-HCl，100mM EDTA pH8.0，250mM  NaCl)。

3.取50mg大型真菌的子实体，在液氮中研磨成粉末，装入至1.5ml的离心管 中，加入500μl提取缓冲液，用涡旋振荡器混合、重悬。

4.加入125μl的10％的SDS，然后再加入12.5μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K， 37℃水浴1h。

5.12000rpm下，离心3min，用移液器取上清，弃沉淀。上清中加入500μl异 丙醇，混匀，室温下5至10min。

6.12000rpm下，离心5min，用移液器弃掉上清，沉淀用1ml的70％乙醇洗 一次，12000rpm下离心3min，用移液器弃掉上清。留沉淀，自然干燥，得到DNA 粗提物。

7.在DNA粗提物中加入500μl的TE，充分溶解DNA之后，进行酚仿抽提。 等体积Tris饱和酚抽提一次，12000rpm下离心5min取上清；等体积苯酚氯仿抽 提一次，12000rpm离心下5min取上清；等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心3min 取上清，去除杂质。

8.加入1/10体积的3M浓度的NaAc，2倍体积的无水乙醇混匀，冰浴30min 至1h沉淀DNA，12000rpm下离心5min，用移液器去上清。沉淀(也许不可见) 用70％乙醇1mL清洗一次(用枪头)，室温下干燥约10min。

9.30-50μl的TE溶解DNA，加入1至2μl的RNA酶，在37℃水浴1h。1.5μl 溴酚兰加5μL样品，进行电泳。

10.将总DNA稀释50倍，以真菌通用引物ITS1  (5’-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3’)与ITS4(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)为扩增引物对，进行PCR反应，扩增目标真菌 的ITS序列，反应体系如下：10倍缓冲液25μl，dNTP(10mM)1.0μl，引物1(10μM) 2.5μl，引物2(10μM)2.5μl，模板DNA(10ng/μL)1.0μl，Taq DNA聚合物(2.5u/μL) 0.5μl，无菌去离子水25μl。

11.混匀上述溶液，离心后，放入PCR仪。按下列设置进行反应：94℃下3min， 然后重复括号中的循环(循环：94℃下，1min；然后52℃下，1min；72℃下，2min) 30次，然后72℃下8min。

12.PCR完成后进行电泳检测扩增出的ITS序列，纯化目标序列。

13.纯化后的ITS序列利用引物ITS1和ITS4进行测序，测序结果利用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进 行比对。

14.结合形态学观察，鉴定大型真菌，提交测序结果至 http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站的GenBank中，获得DNA序列登录号(Accession  Number)。

结果：

大型真菌的分子鉴定结果如下表1所示：

表1大型真菌的分子鉴定结果表

表1展现了菌种鉴定的结果。鉴定首先通过形态学特点，鉴定野生大型真菌。然 后，通过分子生物学方法近一步验证鉴定结果。在通过ITS序列比对过程中发现， 其中13种大型真菌与GenBank中的真菌ITS序列的相似性超过了96％，其中有5种大 型真菌的相似性达到了100％。只有第十号大型真菌它的相似性为93％，比较低，但 通过形态学比较，基本可以确认其为红菇属真菌，不排除它是一个红菇属的新菌种， 再进一步新结果出来之前，暂时用与之相似性最高的Russula persicina来对其进行命 名。根据我们的鉴定结果，14种真菌分为6个科，其中多孔菌科(Polyporaceae)的 有4种，口蘑科(Tricholomataceae)的有3种、红菇科(Russulaceae)的有3种、 环柄菇科(Lepiotaceae)的有3种、马勃科(Lycoperdaceae)的有1种与铆钉菇科 (Gomphidiaceae)的有1种。其中红菇科的红菇属(Russula)有3种，多孔菌科的 (Daedaleopsis)，口蘑科的环柄菇属(Macrolepiota)的有2种，其它7种菌分别来自 不同的属。

实施例2提取物的制备

方法：

1、血红铆钉菇多糖提取物的制备

(1)将森林里采集的血红铆钉菇的子实体，在40℃条件下烘干，直到质量不 再变化，用粉碎机把烘干的蘑菇磨成粉。

(2)用丙酮将干燥的血红铆钉菇菌粉在25℃条件下浸提三次，每次3小时， 离心去上清，沉淀用沸水提取3个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液；

(3)将收集得到的上清液与乙醇按照1:5的体积比混合，在4℃下，使多糖沉 淀。离心分离，获得沉淀。

(4)沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到多糖的粗提取物(Crude  Polysaccharide，CPS)。

(5)用Sevag试剂，脱蛋白：

将5倍体积氯仿与1倍体积的正丁醇混合配置成Sevag试剂，然后将得到多糖 的粗提取物先溶解于少量水中，然后与Sevag试剂按照体积比为5:1进行混合(5 倍体积的提取物样品与1倍体积的Sevag试剂混合)，搅拌，离心。溶液分三层，上 层为多糖溶液，下层为有机试剂，中间层为去除的蛋白层，收集上层多糖溶液；

(6)将收集的上层多糖溶液按照步骤(5)重复处理，直到去除蛋白质(在260 nm处没有蛋白质吸收)。

(7)用去离子水进行透析(采用透析袋的截留分子量为3500道尔顿)，去除 小分子。获得的纯化的多糖溶液，加入5倍体积量的乙醇，4℃获得沉淀，再用水 溶解，然后再次加入5倍体积的乙醇，在4℃下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉 淀，以更加充分去除醇溶性物质，最后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的 纯化后的多糖(Partially purified PS,PPS)。

2、多糖的碳水化合物量的测定

用蒽酮试验来测定CPS和PPS中多糖的碳水化合物量(Yemm EW and Willis AJ, The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.Biochem J 57:508 (1954).)，用葡萄糖做标准曲线，蒽酮溶液的配置方案是将0.2g的蒽酮溶解在22ml 的水中，再加入78ml的硫酸。取0.5ml的蒽酮溶液加入0.1ml的多糖样品溶液。 混合液在沸水中加热10min，然后再冷却到室内温度。用一个不加样品的空白作为 对照，在620nm处测定吸光度值。在多糖的制备和含量分析中，设置了三个生物 学重复。

3、按照上述方法(流程图如图1所示)分别进行了其余13个大型真菌多糖的 提取及多糖的碳水化合物量的测定。

结果：

表2展现了14种大型真菌，纯化后的多糖提取物PPS的碳水化合物的含量。 纯化后的PPS的碳水化合物的普遍比粗多糖CPS显著低10％至70％，这可能是在 透析中除去了分子量低的寡糖和单糖引起的。碳水化合物含量最高的为桦褶孔菌(L. betulina)大约147mg/g，最低的为龟裂马勃(H.utriformis)低于4mg/g。根据表2 的结果，没有发现粗多糖CPS或纯化后多糖PPS碳水化合物含量与科属之间有明确 的关系，即并未发现某科真菌或某属真菌的多糖含量明显高于其它科或属。

表2粗多糖和纯化后多糖的碳水化合物含量

平均值±SD(n＝3)以及同一栏中不同字母(a-i)标注的平均值表示差异显著 (p<0.05).*CPS表示多糖的粗提取物**PPS表示水溶性的纯化后的多糖。

实施例3抗氧化活性的测定

抗氧化活性通过自由基清除力、还原力与金属螯合力三种方法进行测量。纯化 后的多糖PPS被提前溶于水中，配置成浓度为4mg/ml的溶液。所有抗氧化实验都设 有三个生物学重复。

方法：

1、清除自由基活性

自由基清除实验是一种抗氧化实验，本发明是通过清除ABTS 【2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS】自由基，测量颜色变 化实验来完成(Re R,Pellegrini N,Proteggente A,Pannala A,Yang M,Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol Med 26:1231-1237(1999).Shao P,Chen XX and Sun P.Chemical  characterization,antioxidant and antitumor activity of sulfated polysaccharide from  Sargassum horneri.Carbohyd Polym 105:260-269(2014).)。自由基ABTS^·+的生成，通 过利用过硫酸钾(Potassium persulfate，K2S2O8)氧化ABTS来完成的。本实验中， 终浓度为7.4mM的ABTS溶液与终浓度为2.45mM的过硫酸钾室温下反应16h， 获得蓝绿色溶液。取20μl的ABTS^·+溶液被加入到多糖样品中，用水稀释至在734 nm吸收值为0.70(±0.02)，混合液培养2h，然后读取并记录734nm下的吸收值。 奎诺二甲基丙烯酸酯【(S)-(2)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic  acid，trolox】，即水溶性的维生素E的类似物，作为阳性对照，并把多糖样品的抗 氧化活性换算成等量的trolox的抗氧化活性，即TEACμmol trolox/g(Trolox  Equivalent Antioxidant Capacity，TEAC)。

2、还原力活性

还原力的测量通过铁离子还原的抗氧化力FRAP实验(Ferric Reducing  Antioxidant Power，FRAP)(Benzie IFF and Strain JJ,The ferric reducing ability of  plasma as a measure of“antioxidant power”:the FRAP assay.Analytical Biochemistry  239:70-76(1996).Yap YHY,Tan NH,Fung SY,Aziz AA.,Tan CS and Ng ST,Nutrient  composition,antioxidant properties,and anti-proliferative activity of Lignosus rhinoceros  Cooke sclerotium.J Sci Food Agr 93:2945-2952(2013).)，使Fe(TPTZ)₂³⁺还原成 Fe(TPTZ)₂²⁺，后者具有深蓝色，在593nm有吸收峰。FRAP试剂现用现配，实验前， 将浓度为10mM的TPTZ【2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine】溶液加到浓度为40mM 的HCl溶液中去配成溶液一，溶液二为浓度20mM的FeCl₃·6H₂O，溶液三的pH为 3.6，浓度为300mM的乙酸缓冲液，溶液一、溶液二与溶液三，按照1:1:10的比例 混合，在37℃温浴，待用。取样品30μl与90μl的水混合，然后加入900μl的FRAP 试剂反应2h，然后在595nm测量吸光值。用FeSO4建立标准曲线，活性表示单位 为μmol FeSO₄/g sample。

3、金属螯合力活性

金属螯合力抗氧化实验，通过测量亚铁离子的螯合力来完成的(Decker EA and  Welch B,Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food.J Agri Food Chem  38:674–677(1990).Liu W,Wang H,Yao W,Gao X and Yu L,Effects of Sulfation on the  Physicochemical and Functional Properties of a Water-Insoluble Polysaccharide  Preparation from Ganoderma lucidum.J Agr Food Chem 58:3336-3341(2010).)，选用乙 二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)作为阳性对照。取200μl 的样品与740μl的去离子水混合与然后与20μl的浓度为2mM氯化亚铁反应1分 钟，与40μl浓度为5mM菲啰嗪(Ferrozine)反应20min，在562nm下测量吸收 值，用μmol Fe²⁺/g来表示样品的螯合能力。

结果：

表3与图2展现了14种大型真菌纯化后多糖PPS的3种抗氧化活性的实验结 果。图2左，展现的清除ABTS自由基活性，活性单位是TEAC(Ttrolox Equivalent  Antioxidant Capacity)；图2中，展现的是不同的抗氧化活性结果展现了不同的结果。 对于清除自由基ABTS^·+活性方面大型真菌的纯化后多糖PPS的活性为16.9-535.8 μmol/g TEAC，在铁离子还原力方面纯化后多糖PPS的活性为0.23至5.94mmol  Fe/g，在亚铁离子螯合力方面纯化后多糖PPS的活性为0.70至484.61μmol Fe²⁺/g。 总体上说，来自多孔菌科和红菇科真菌的多糖抗氧化活性较强。有4种大型真菌龟 裂马勃、乳突环柄菇、奥氏蜜环菌和高大环柄菇的纯化后的多糖PPS在任何三种抗 氧化实验中都是位于前六位的。另外紫丁香蘑具有第二高的金属还原力(4.65mmol  Fe/g)，黄小蜜环菌具有最强的金属螯合能力(484.6μmol Fe²⁺/g)，上述这六种蘑菇， 即真菌龟裂马勃、乳突环柄菇、奥氏蜜环菌、高大环柄菇、紫丁香蘑和黄小蜜环菌， 具有较强的抗氧化活性。在14种大型真菌中龟裂马勃的纯化后的多糖PPS抗氧化 活性最强。龟裂马勃菌的其它提取物(非多糖提取物或非水提取物)曾被报道过具 有抗氧化活性或其它活性，本研究是首次发现了龟裂马勃纯化后的多糖具有较强的 抗氧化活性(自由基清除力、还原力和离子螯合力)。除了龟裂马勃外，其它5种 具有较强抗氧化活性的大型真菌乳突环柄菇、奥氏蜜环菌、高大环柄菇、紫丁香蘑 和黄小蜜环菌的多糖抗氧化活性，也是首次被发现。事实上，对于龟裂马勃、乳突 环柄菇和黄小蜜环菌的多糖的研究都非常少，更未见其活性的研究，但根据我们的 结果这三种大型真菌的多糖具有良好的抗氧化活性，同时它们又都是食用菌，很有 作为抗氧化剂开发的潜力。

表3大型真菌多糖的抗氧化活性

平均值±标准差(n＝3)以及同一栏中不同字母(a-n)标注的平均值表示差异显著 (p<0.05)。*TEAC指总抗氧化能力；**阳性对照：水溶性维生素E用于ABTS和 FRAP，EDTA是用于黑色金属螯合剂对酪氨酸酶抑制试验。

实施例4抗酪氨酸酶活性的测定

方法：

多糖样品的抗酪氨酸酶活性的测定，通过分光光度计测量来自大型真菌的抑制 酪氨酸酶活性的变化来完成的(Baurin N,Arnoult E,Scior T,Do QT and Bernard P, Preliminary screening of some tropical plants for anti-tyrosinase activity.J  Ethnopharmacol 82:155–158(2002).Chien C,Tsai M,Chen C,Chang S and Tseng C, Effects on tyrosinase activity by the extracts of Ganoderma lucidum and related  mushrooms.Mycopathol 166:117–120(2008).Chiari ME,Joray MB,Ruiz G,Palacios  SM and Carpinella MC,Tyrosinase inhibitory activity of native plants from central  Argentina:Isolation of an active principle from Lithrea molleoides.Food Chem  120:10–14(2010).Yu P and Sun H,Purification of a fucoidan from kelp polysaccharide  and its inhibitory kinetics for tyrosinase.Carbohyd Polym 99:278-283(2014).)。用pH 为6.8的、浓度为200mM的磷酸缓冲液将酪氨酸酶配置成浓度400U/ml的溶液。 取50μl的酪氨酸酶溶液与200μl的磷酸缓冲液混合，然后加入250μl的多糖样品 溶液，使多糖样品的终浓度为1mg/mL或其它工作浓度。将混合液在25℃下反应 90min，期间伴随缓慢搅拌。然后加入500μl的浓度为0.03％的L-酪氨酸(或者是 其它工作浓度L-酪氨酸)，立即在475nm下测量吸收值，计算多巴色素形成的量， 为测量酪氨酸酶活性记录20min的吸收值变化。记录不同时间给出的475nm的光 吸收值，将未加入多糖样品的作为对照(抑制率为0％)，熊果苷作为阳性对照， 计算抗酪氨酸酶活性。实验中，设置了三个生物学重复。通过线性回归，计算抑制 中浓度(Inhibition Concentration，IC₅₀)，即化合物酪氨酸酶抑制率为50％的浓度 值。纯化后的多糖PPS抑制酪氨酸酶的动力学通过Lineweaver-Burk曲线进行分析。

平均值、标准差和IC₅₀值，通过Microsoft Excel 2010进行计算。单因素方差分 析(One way analysis of variance，LSD test，P<0.05)通过SPSS version 13.0(Statistical  Package for Social Sciences)进行计算。

结果：

天然产物被认是抗酪氨酸酶类化合物的良好资源，一方面它们可以用来治疗酪 氨酸酶导致的疾病，另一方面可以被作为美白剂(Kim YJ and Uyama H,Tyrosinase  inhibitors from natural and synthetic sources:structure,inhibition mechanism and  perspective for the future.Cell Mol Life Sci 62:1707-1723(2005).Chang ST,An updated  review of tyrosinase Inhibitors.Int J Mol Sci 10:2440–2475(2009).Smit N,Vicanova J  and Pavel S,The Hunt for Natural Skin Whitening Agents.Int J Mol Sci 10:5326-5349 (2009).Ismaya WR,Rozeboom HJ,Weijn A,Mes JJ,Fusetti F,Wichers HJ and Dijkstra  BW,Crystal Structure of Agaricus bisporus Mushroom Tyrosinase:Identity of the  Tetramer Subunits and Interaction with Tropolone.Biochem 50:5477-5486(2011).)。表4 和图3展现了14种野生大型真菌纯化后的多糖PPS在浓度为的1mg/ml时，抗酪 氨酸酶的实验结果。根据表4可发现，龟裂马勃菌与血红铆钉菇具有最强的抗酪氨 酸酶活性，它们在1mg/ml时对酪氨酸酶的抑制率可以分别达到61％和85％，而其 它12种大型真菌的在1mg/ml时对酪氨酸酶的抑制率都在40％以下。进一步实验， 测得龟裂马勃菌的纯化后多糖PPS对酪氨酸酶的抑制中浓度，即IC₅₀值能达到0.78 mg/ml，血红铆钉菇的活性更强，即IC₅₀值能达到0.46mg/ml。本实验的阳性对照， 熊果苷，在1mg/ml时对酪氨酸酶的活性是86.5％，它的IC₅₀值为0.43mg/ml。由 此可见，血红铆钉菇的抗酪氨酸酶的活性较强，接近于熊果苷的活性。进一步的实 验我们测试了不同浓度的血红铆钉菇的纯化后多糖PPS酪氨酸酶催化速率的影响， 绘制成Lineweaver-Burk曲线，展现于图4中。分析发现血红铆钉菇的纯化后多糖 PPS应该属于混合型(竞争与非竞争混合)酪氨酸酶抑制剂。抗酪氨酸酶的活性结 果与先前的报道，Chien等(Chien C,Tsai M,Chen C,Chang S and Tseng C,Effects on  tyrosinase activity by the extracts of Ganoderma lucidum and related mushrooms. Mycopathol 166:117–120(2008).)和Chiari等(Chiari ME,Joray MB,Ruiz G,Palacios  SM and Carpinella MC,Tyrosinase inhibitory activity of native plants from central  Argentina:Isolation of an active principle from Lithrea molleoides.Food Chem  120:10–14(2010).)报道了四种大型真菌赤灵芝(G.lucidum)、牛樟芝(Antrodia  camphorata)、姬松茸(Agaricus brasiliensis)和蛹虫草(Cordyceps militaris)水提 物的抗酪氨酸酶的活性，赤灵芝的水提物在浓度为1mg/ml时展现了更强的活性， 抑制率达到80％，其它菌的水提物在浓度为1mg/ml时抑制率低于50％，赤灵芝的 水提物的IC₅₀值达到0.35mg/ml，比血红铆钉菇的纯化后多糖PPS略低。血红铆钉 菇多糖的抗氧化活性曾经被报道过，但血红铆钉菇多糖的抗酪氨酸酶活性之前未被 报道过，这是首次发现血红铆钉菇的抗酪氨酸酶活性。

表4大型真菌多糖的抗酪氨酸酶活性(1mg/ml)

平均值±标准差(n＝3)以及同一栏中不同字母(a-k)标注的平均值表示差异显著 (p<0.05)。