基于G蛋白偶联受体的哺乳动物细胞定向引导方法

摘要

本发明提供了一种新型G蛋白偶联受体，该新型受体由引起定向迁移效应的第一G蛋白偶联受体、以及第二G蛋白偶联受体的结合功能域复合而成，其中第二G蛋白偶联受体的结合功能域取代第一G蛋白偶联受体的结合功能域。本发明还提供一种基于该新型G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法，包括：采用引起定向迁移效应的第一G蛋白偶联受体构建新型G蛋白偶联受体；以及将新型G蛋白偶联受体导入细胞，制备得到具有定向迁移效应的工程细胞。通过替换引起定向迁移效应的G蛋白偶联受体的结合功能域，从所制得的新型G蛋白偶联受体可特异性结合区别于趋化因子的配体，并在特异性结合后使细胞朝向该配体富集的地方做定向移动，从而介导细胞的定向引导过程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可控制细胞定向迁移的新型G蛋白偶联受体，本发明还 涉及一种基于该新型G蛋白偶联受体定向引导哺乳动物细胞移动的方法。

背景技术

G蛋白偶联受体是细胞表面受体最为多样的家族，介导无数胞外信号的细 胞应答。细胞的信号传导中，G蛋白偶联受体接受细胞外的信号，并通过G 蛋白的作用传递到相应的效应器蛋白，完成细胞对外界信号的应答。G蛋白是 三聚体GTP结合调节蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein）的简称， 位于质膜内胞浆一侧，主要作用是接受来自G蛋白偶联受体的信号，并传递 给效应器蛋白。G蛋白偶联受体家族包括多种与蛋白质类或肽类激素、局部介 质、神经递质和氨基酸或脂肪酸衍生物等配体识别与结合的受体，以及哺乳类 嗅觉受体、味觉受体和视觉的光激活受体（视紫红质）等。

所有的G蛋白偶联受体都含有7个疏水肽段形成的跨膜α螺旋区和相似 的三维结构，N端在细胞外侧，C端在细胞质侧。在细胞外侧的部分区段具有 特异的氨基酸序列，是G蛋白偶联受体结合特定配体的结合功能域；在细胞 质侧的部分区段具有效应特异性，可与G蛋白结合；中段有7个跨膜区，其 中螺旋5和6（图1）之间的胞内环状结构域对于受体与G蛋白之间的相互作 用具有重要的作用。其结合功能域结合特异性配体后，G蛋白偶联受体的特异 性效应区被激活，然后通过G蛋白把信号传递给相应的效应器蛋白，从而将 胞外信号转换为胞内信号，并使细胞做出相应应答。

趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP蛋白耦连的跨膜受体 （GPCR），通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上。趋化因子受体除了 具有一般G蛋白偶联受体的结构和功能特点外，还具有自身的特点。趋化因 子受体的结合功能域位于N端，与相应的趋化因子结合发生变构并将信号传 递给G蛋白，再由G蛋白激活多种信号分子，可调节细胞内的Ca²⁺浓度，诱 导细胞骨架蛋白的改变引起细胞趋化性，控制细胞向趋化因子富集的地方做定 向迁移。因此，趋化因子与其受体的相互作用控制着细胞在循环系统和组织器 官间定向移动。由于其N端结合功能性的结合特异性，趋化因子受体仅在匹 配的趋化因子作用下定向引导细胞，不能响应除趋化因子以外的配体。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中趋化因子受体这一G蛋 白偶联受体仅在趋化因子作用下介导细胞定向迁移的局限性，提供一种可在诸 如胰高血糖素的配体作用下介导细胞定向迁移的新型G蛋白偶联受体。基于 该G蛋白偶联受体，本发明还提供一种细胞定向引导方法。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种新型G 蛋白偶联受体，所述新型G蛋白偶联受体由引起定向迁移效应的第一G蛋白 偶联受体、以及第二G蛋白偶联受体的结合功能域复合而成，其中所述第二G 蛋白偶联受体的结合功能域取代所述第一G蛋白偶联受体的结合功能域。

在上述新型G蛋白偶联受体中，第一G蛋白偶联受体是趋化因子受体。

在上述新型G蛋白偶联受体中，趋化因子受体为CX3CR趋化因子受体。

根据其所结合的配体可将趋化因子受体分为四个亚家族：CXC类受体 （CXCR）、CC类受体（CCR）、C类受体（CR）和CX3C类受体（CX3CR）。 由以上叙述可知，本发明采用CX3CR作为研究对象。另外，胞外信号结合趋 化因子受体后，可由IP3-Ca²⁺信号通路产生钙活化，以此来检测趋化因子与受 体结合。

根据本发明的另一方面，提供一种基于新型G蛋白偶联受体的细胞定向 引导方法，该方法包括：采用引起定向迁移效应的第一G蛋白偶联受体与第 二G蛋白偶联受体的结合功能域构建的新型G蛋白偶联受体；以及将所述新 型G蛋白偶联受体导入细胞，制备得到具有定向迁移效应的工程细胞。

在上述基于新型G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法中，所述新型G蛋 白偶联受体由所述第一G蛋白偶联受体、以及第二G蛋白偶联受体的结合功 能域复合而成，其中由所述第二G蛋白偶联受体的结合功能域取代所述第一G 蛋白偶联受体的结合功能域。

在上述基于新型G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法中，采用基因重组 法构建所述新型G蛋白偶联受体。

在上述基于新型G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法中，采用基因重组 法构建所述新型G蛋白偶联受体包括以下步骤：

制备编码去除了结合功能域的第一G蛋白偶联受体的第一DNA序列A 和编码第二G蛋白偶联受体的结合功能域的DNA序列B；

把DNA序列B插入到DNA序列A的结合功能域部位，再装配到病毒载 体中构建得到能表达所述新型G蛋白偶联受体的感染型病毒颗粒。

采用所述感染型病毒颗粒感染细胞，制得具有定向迁移效应的工程细胞。

在上述基于新型G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法中，所述第一G蛋 白偶联受体为CX3CR趋化因子受体，所述第二G蛋白偶联受体为胰高血糖素 受体，所述病毒载体为腺病毒载体或慢病毒载体。

编码去除结合功能域的CX3CR趋化因子受体的DNA序列的引物序列为：

mCX3CR-5’端引物(P5):GAATTC ATCTTCCTGTCCGTCTTCTAC;

mCX3CR-3’端引物(P3):CTCGAG TCAGAGCAGGAGAGACCCATC;

编码胰高血糖素受体的结合功能域的DNA序列的引物序列为：

mGLCR-5’引物(P5):GCGGCCGC ATGCCCCTCACCCAGCTCCAC;

mGLCR-3’引物(P3):GAATTC GCCCACGGTGTACATCACCTG；

在上述基于G蛋白偶联受体的细胞定向引导方法中，所述方法还包括采 用胰高血糖素激活所述新型G蛋白偶联受体的结合功能域，使带有新型G蛋 白偶联受体的工程细胞沿着胰高血糖素的浓度梯度由低到高的方向移动。

实施本发明可以获得以下有益效果：本发明采用另一G蛋白偶联受体的 结合功能域替换引起定向迁移效应的G蛋白偶联受体的相同部位，从而使后 者可特异性结合前者的配体，并在特异性结合后使细胞朝向该配体富集的地方 做定向移动，从而介导细胞的定向引导过程，使细胞在指定区域执行功能。

附图说明

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：

图1是新型G蛋白偶联受体的改造示意图；

图2是对pSHUTTLE-IRES-hrGFP质粒进行PCR鉴定的结果；

图3是TCID₅₀测定重组腺病毒滴度检测结果。

具体实施方式

本发明采用两种G蛋白偶联受体（以下分别称为第一G蛋白偶联受体和 第二G蛋白偶联受体）构建特殊的新型G蛋白偶联受体，其中第一G蛋白偶 联受体可介导细胞定向迁移，并且其结合功能域被第二G蛋白偶联受体的结 合功能域取代，从而可被第二G蛋白偶联受体的配体特异性激活，使带有该 新型G蛋白偶联受体的细胞向该配体富集的方向移动。具有上述定向迁移特 性的细胞是本发明中可执行特殊功能的工程细胞。

为便于具体解释本发明，优选采用趋化因子受体作为引起定向迁移效应的 第一G蛋白偶联受体，采用胰高血糖素受体作为第二G蛋白偶联受体。胰高 血糖素受体的结合功能域能特异性的结合胰高血糖素，使细胞对胰高血糖素做 出应答。但强调的是，此处列举该具体示例并不是限制本发明仅可以此方式实 施。以下详细说明构建该新型G蛋白偶联受体并基于此介导细胞定向引导的 详细过程。

实施例一：基因重组法构建新型G蛋白偶联受体

该方法的总体思路为：克隆出胰高血糖素受体的结合功能域DNA序列（即 DNA序列B）、以及去除结合功能域的趋化因子受体的DNA序列（即DNA 序列A）；把编码胰高血糖素受体的结合功能域的DNA序列插入到趋化因子 受体的DNA序列的原结合功能域部位，随后插入到病毒载体（该实施例中采 用腺病毒载体）中构建可在细胞内表达特殊新型受体的感染型病毒颗粒；用此 感染型病毒颗粒在体外感染特定细胞，控制病毒在细胞内的基因表达，使细胞 表面带上特殊的受体，从而将细胞改造为可执行特殊功能的工程细胞。

基因克隆：

从小鼠的cDNA文库中扩增小鼠的胰高血糖素受体（mGLCR)的结合功能 域的DNA序列、以及小鼠的趋化因子受体（mCX3CR）的DNA序列（除去 对应于结合功能域的序列部分）。所得到的引物序列分别为：

mGLCR-5’：GCGGCCGCATGCCCCTCACCCAGCTCCAC；

mGLCR-3’：GAATTCGCCCACGGTGTACATCACCTG；

mCX3CR-5’：GAATTCATCTTCCTGTCCGTCTTCTAC；

mCX3CR-3’：CTCGAGTCAGAGCAGGAGAGACCCATC；

为方便后续腺病毒载体的装配，在mGLCR基因序列5’端引物设计添加 Not I酶切位点（GCGGCCGC），在mCX3CR基因序列3’端引物设计添加Xho  I酶切位点（CTCGAG），在mGLCR基因序列3’端以及mCX3CR基因序列5’ 端引物上设计添加EcoR I酶切位点（gaattc），以方便这两端序列的后续连接。 这些酶切位点的设计应与后续腺病毒穿梭质粒上多克隆位点的酶切位点相适 应，同时也要注意添加的酶切位点不应存在于要处理的DNA序列中。目前， 常见的腺病毒穿梭质粒有pSHUTTLE、pSHUTTLE-CMV、 pSHUTTLE-IRES-hrGFP-1和pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2等。本实施例采用的 是pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2腺病毒穿梭质粒。

PCR扩增上述两段DNA序列，琼脂糖凝胶电泳PCR产物，并进行胶回 收DNA，装入pMD18T载体中，转化DH5α细菌，筛选不同的细菌克隆，进 行测序。把所得序列与鼠基因组文库的序列进行比对，选择无错误的克隆进行 培养，提取分别包含mGLCR基因片段和mCX3CR基因片段的载体进行下一 步实验。

腺病毒质粒装配：

在pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2穿梭质粒中装配mGLCR基因片段和 mCX3CR基因片段。该过程可一步法进行，即把mGLCR基因片段和mCX3CR 基因片段同时装配进入pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2穿梭质粒中；也可分步进行， 即先后装入mCX3CR基因片段和mGLCR基因片段这两种基因片段。

具体地，把提取的两种分别包含mGLCR基因片段和mCX3CR基因片段 的载体、以及pSHUTTLE载体，按照表1的反应体系配制酶切反应物，37℃ 反应2.0h。

表1腺病毒质粒装配的反应体系

序号 质粒 体积（μl） H2O（μl） 10×缓冲液（μl） 内切酶（μl/μl） 1 pMD-18T-mGLCR 5.0 3.0 1.0 Not I/EcoR I,0.5/0.5 2 pMD-18T-mCX3CR 5.0 3.0 1.0 EcoR I/Xho I,0.5/0.5 3 pSHUTTLE-IRES-hrGFP 5.0 3.0 1.0 Not I/Xho I,0.5/0.5

对酶切反应物进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收特征的目的DNA条带（使 用MN公司的胶回收DNA试剂盒），检测各个组分回收DNA的量，按照 mGLCR:mCX3CR:pSHUTTLE-IRES-hrGFP=20:20:1～10的比例配制连接体系 (使用相应的连接酶系统)，于11～17℃连接1～6h，转化（电转化或化学转化） DH5α等大肠杆菌，涂布于含有卡那霉素的LB培养平板上，37℃过夜培养。 挑取单菌落接种于含有卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养至饱和，收集 菌体，提取质粒（使用市售的质粒提取试剂盒或传统方法）。使用PCR、限制 酶酶切或序列分析等方法，鉴定目的序列按照mGLCR-mCX3CR序列首尾相 接等正确的方式装配到pSHUTTLE-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点的正确位 置。使用PCR方法进行鉴定，具体方法：5’端引物使用mGLCR-5’端引物(P5)， 3’端引物使用mCX3CR-3’端引物(P3)，具体序列见下面。

mGLCR-5’端引物(P5):GCGGCCGCATGCCCCTCACCCAGCTCCAC；

mCX3CR-3’端引物(P3):CTCGAG TCAGAGCAGGAGAGACCCATC;

若首尾连接正确，则使用上述引物能扩增出约1400bp的特征条带（见图 2）。该图中分子量从下至上分别为100、250、500、750、1000、2000；1、2 为测试带，其中1为连接成功组，2为对照组。

把提取到的含有目的序列的pSHUTTLE-IRES-hrGFP质粒用PME I内切酶 线性化，使用碱性磷酸酶去除DNA末端的磷酸以防止自身连接，电转化（或 化学转化）到BL5183菌株中（含有重组酶以及预先导入的腺病毒重组大质粒 AdEasy plasmid DNA）。涂布于含有卡那霉素的LB培养平板上，37℃培养24h， 平板上长出大、中、小3种菌落，小菌落中的腺病毒载体最有可能发生重组。 挑取10个小的单菌落，分别接种于含有卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床 培养至饱和，分别收集菌体，提取质粒（使用市售的质粒提取试剂盒或传统方 法）。质粒用Pac I酶切鉴定，选择酶切后能形成2条带的质粒（大带分子量大 于15000（MARKER）、小带大约3000左右）的质粒，电转化（化学转化）到 适合大分子量的质粒生长的感受态的DH5α（不含重组酶）中，挑取单菌落， 接种到含有卡那霉素的LB培养液中培养至菌饱和，保种并提取质粒，PCR结 合Pac I酶切鉴定上述各个质粒。把含有合格质粒的菌液接种至100～500ml LB 培养液中培养至饱和，使用中、大提质粒试剂盒提取重组质粒。

腺病毒载体的细胞内装配：

把经过中、大提的重组质粒经过Pac I酶切，琼脂糖凝胶电泳酶切质粒， 并使用胶回收试剂盒回收质粒约5.0μg，转染AD293细胞（使用常规转染方法）， 并使用chloroquine加压处理细胞，37℃CO₂培养箱中培养7天，细胞发生病 变效应，提示病毒组装成功，提取病毒，多次感染新的AD293细胞，直至感 染时间稳定。一般感染4～5代就能得到稳定的病毒颗粒；具体地，通过病毒滴 度测试及感染效价测试确定何时可得到稳定的病毒颗粒。

采用PCR技术测定病毒滴度：用紫外分光光度法等核酸浓度测定法准确 测定包含目的DNA序列的mGLCR-mCX3CR(或单独的mGLCR和mCX3CR) 的纯化质粒的浓度，然后根据分子量及阿弗加德罗常数来计算每毫升的分子 数，计算并配制每毫升含分子数为10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²的梯度浓 度作为校准品。把此系列浓度的校准品与病毒样品同时进行PCR（或荧光定 量PCR），由于无论是在校准品分子中还是在病毒颗粒中，每个分子中都只含 有一个目的DNA序列，这样就可以用校准品的分子数来计算病毒样品的颗粒 数，最终计算样品病毒的滴度。

按照上述方法测定的病毒滴度达到10⁹以上就可以从培养细胞中提取病毒 颗粒了，使用密度梯度离心等方法来纯化病毒颗粒，混合一批，检测病毒质量， -80℃保存备用。此病毒颗粒中即包含有首尾相连的mGLCR-mCX3CR基因， 感染细胞后可以在细胞表面形成新的细胞受体。为完全反映病毒的感染能力， 以下进一步采用TCID₅₀法测定病毒的感染效价。

采用TCID₅₀法测定腺病毒的感染效价：提前一天以1×10⁵的细胞密度把 AD293细胞铺96孔培养板，取0.1ml待测病毒原液以10^-1～10^-10的梯度用 DMEM5%FBS稀释，共10个稀释度，每个稀释度重复8孔，每孔接种100ul 量的病毒稀释液。第11、12孔细胞中加入100ul的DMEM5%FBS培养液作 为对照，同样重复8孔。接种后，放入37℃5%CO₂培养箱继续培养。10天 后在显微镜下观察各孔的细胞病变情况。以法计算重组病毒感染效 价：

效价T=10^1+d(s-0.5)

其中d=log10=1,s=阳性比率之和。根据下图2中各计算结果可以看出， 各试验组（即使用病毒稀释液的孔）效价达到10^-8以上，本发明的病毒原液在 所示稀释浓度下可很好地感染细胞，对细胞进行改造。实验结果见图3，根据 图3，d=1,s=1+1+1+1+1+1+1+3/8+1/8+0=7.5计算：T=10^1+d(s-0.5)=10^{1+1×(7.5-0.5)}=10⁸

感染工程细胞：

使用腺病毒感染细胞COS-7细胞，2天后观察细胞具有明显的荧光信号， 应用Ca²⁺染料染细胞30min，使用2.0μl的1.0μg/ml的胰高血糖素刺激细胞， 共聚焦显微镜观察到明显的Ca²⁺升高信号，而对照升高不明显。使用孔径为 3.0μm的TRANSWELL小室做细胞趋化性实验，把COS-7细胞培养在 TRANSWELL小室膜的一侧并使用本发明制备的腺病毒感染2天（通过观测 荧光信号指示细胞表达改造的受体），在膜的另一侧加入终浓度为25nmol/L胰 高血糖素作为诱导物，37℃培养4h，相对于改造前的COS-7细胞，本发明经 腺病毒感染的细胞更多地通过膜孔转移。通过这两个实验可以验证运用本发明 制备的受体可以接受胰高血糖素作为配体的刺激或诱导细胞发生趋化因子受 体的相关效应。

以上通过具体实例详细说明了如何构建新型G蛋白偶联受体以介导工程 细胞的定向迁移：通过把趋化因子受体的结合功能域替换成另一种G蛋白偶 联受体（例如胰高血糖素受体）的结合功能域，制得的新型G蛋白偶联受体 具有新的结合功能域，结合区别于趋化因子的配体后能将信号传递给效应功能 域，产生向该配体的富集区域运动的新细胞应答，从而将趋化因子受体可介导 的定向迁移性质应用到其他配体上。由于G蛋白偶联受体具有相似的结构， 本专利的方法可适应于所有的G蛋白偶联受体，这在实例中得到较好验证。