纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤

摘要

本发明涉及纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤，具体涉及纳米银与自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于制备抗肿瘤药物的用途及自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于促进纳米银对肿瘤细胞杀伤的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米银与自噬的抑制剂或者敲低/敲除自噬必须基因 表达的试剂用于制备抗肿瘤药物的用途。

背景技术

纳米银就是将粒径做到纳米级的金属银单质。纳米银由于其很好的杀 菌作用，被应用于医疗领域，比如抗菌类医药及医疗器械，抗菌塑料及橡 胶制品，抗菌纺织品及服装鞋袜等。纳米银还具有很多别的生物学效应， 比如抗真菌、抗病毒、消炎。作为为数不多的已经被应用于临床的纳米材 料，近年的细胞以及小鼠实验研究表明，纳米银还可能是一种潜在的抗肿 瘤药物。纳米银已经在多种癌细胞中被证实具有很强的细胞杀伤效果，包 括氧化压力、DNA损伤、细胞周期停滞、凋亡、坏死。

纳米银在动物模型中的抗肿瘤效果也得到了验证。在道尔顿淋巴腹水 瘤小鼠模型中，相对于没加纳米银处理组，纳米银对腹水中癌细胞进行杀 伤，很好的控制了腹水的体积，使得小鼠的体重还原至腹水瘤接种前的体 重。另外一项研究显示，纳米银对恶性黑色素瘤具有很好的杀伤效果，用 细胞穿膜肽TAT修饰纳米银以增加其穿透细胞的效果后，黑色素瘤的杀伤 效果得到了进一步的提升，与用阿霉素处理的抑瘤效果相似。不过不同的 是阿霉素处理组小鼠体重明显下降，而纳米银处理组小鼠的体重还有一定 程度的增加，显示了其更小的副作用。纳米银抗肿瘤的另外一个特点是抑 制肿瘤血管的生长，肿瘤血管的生成是肿瘤生长、侵润、转移过程中至关 重要的一步。在链唑霉素刺激诱导大鼠肿瘤模型中，可以见到明显的肿瘤 血管生成，纳米银处理后，新肿瘤血管生成的现象被抑制。

自噬是真核生物细胞内一种基本降解过程，当自噬发生时，双层膜包 裹细胞内非必要的或者功能失常的组分形成自噬体，自噬体与溶酶体融合 对内容物进行降解，这个过程具有很重要的生理以及病理学意义。自噬在 发育分化、癌症、神经退行性疾病、衰老、免疫等生理病理方面起着非常 重要的作用。自噬在肿瘤的发生发展过程中被认为起着促进肿瘤生长和抑 制肿瘤生长两方面的作用。

自噬在肿瘤发生过程中起着双刃剑的作用。一方面来讲，自噬可以增 强肿瘤细胞对压力(包括低氧环境、饥饿、一些治疗手段)的耐受。即使 在更长时间的压力下，自噬可以延长肿瘤细胞的生存时间，产生休眠的肿 瘤细胞，使其在生存条件变好之后能重新复活。由自噬带来的压力下存活、 休眠、重生等一系列效应可能是肿瘤治疗的一个阻碍。另一方面，正是由 于自噬可以减轻压力造成的损伤，这对抑制肿瘤的生长意义重大。因为通 过消除损坏的蛋白和细胞器，自噬可以避免基因组的损伤，基因组的损伤 往往会促进肿瘤发生。慢性细胞死亡和炎症反应都可能促进肿瘤的发生， 自噬能对这些损坏进行消除，从这方面讲自噬可以抑制肿瘤发生。但是如 果自噬被抑制，细胞内的平衡遭到破坏，这样更加会导致肿瘤的发生。肿 瘤细胞可以适应环境，并且对体内特定的压力产生更强的适应性，这就导 致肿瘤细胞更加难以被清除。自噬在这个过程中，通过维持新陈代谢状态 可能阻止肿瘤细胞演变为更加恶性的状态。所以尽管自噬可能会保护肿瘤 细胞的生存，但是作为补偿的是，自噬同时也可以对损伤进行消除。在自 噬被抑制的细胞里面，肿瘤存活率减少变得并不重要了，因为自噬的抑制 导致基因组损坏的增多和慢性炎症的增强，这些都会导致肿瘤的生长。所 以总的说来，自噬在肿瘤发生里面虽然起着两方面的作用，但是主要的作 用还是抑制肿瘤细胞的发生和恶化。

相对于自噬在肿瘤发生过程中主要起抑制肿瘤的作用，自噬在肿瘤发 展过程中则主要起着促进肿瘤生长存活的作用。研究表明，自噬在癌细胞 中起着最主要的作用就是抵抗压力，这就保护了肿瘤的正常生长。在很多 种肿瘤细胞中，如果将自噬必需基因的表达敲低，则表现出细胞死亡的增 强。肿瘤细胞由于生长快需要很高的代谢速度，在体内模型中，自噬缺陷 的肿瘤细胞相对自噬正常的细胞，在遭遇压力的时候更容易死亡。在人胰 腺癌细胞系和肿瘤样本中都观察到了自噬水平升高的现象，自噬可以通过 维持细胞内能量的产生来保证肿瘤细胞的快速生长。另外，在癌细胞接受 化疗或者放疗的情况下，自噬效应可能帮助癌细胞进入休眠状态，这可能 是肿瘤复发以及肿瘤耐受的一个原因。并且现在已经有很多证据显示抑制 自噬可以增强抗癌药物的效果。当自噬处于一定的范围内，主要体现为促 进肿瘤细胞存活。但是也存在过度激活的自噬导致肿瘤细胞死亡的现象， 这也是一个可能的抑瘤机制。

很多纳米颗粒都已经被报道可以引起细胞自噬，比如稀土材料：如氧 化钐Sm₂O₃、氧化铕Eu₂O₃、氧化钆Gd₂O₃、氧化铽Tb₂O₃、氧化钇(Y₂O₃)、 氧化镧(La₂O₃)、氧化镱(Yb₂O₃)；量子点：羧基化的CdSe/ZnS QDs、 羧基化的CdTe QDs；碳基材料：水溶性纳米富勒烯C₆₀、内嵌钕原子的 C₆₀@Nd、COOH-CNT、C₆₀的羟基衍生物C₆₀OHx；另外还有不同粒径的 纳米金颗粒、磁性纳米颗粒、氧化锰颗粒等都被报道可以引起细胞自噬现 象。然而银纳米颗粒是否能引起细胞自噬，以及引起的纳米银引起的自噬 对细胞的存亡起着怎样的作用还没有报道。另外，纳米银在对肿瘤细胞的 杀伤过程中，自噬起着怎样的作用也没有报道。

发明内容

本发明的第一个方面提供纳米银与自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相 关基因表达的试剂用于制备抗肿瘤药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。

在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自 噬下游降解阻断剂，优选选自wortmannin、LY294002、3-MA、氯化铵、 bafilomycin A1，E64d和pepstatin A或其组合。所述自噬抑制剂均购自 Sigma Aldrich，USA(参见Mizushima N.et al.Methods in mammalian  autophagy research.Cell.2010Feb5；140(3):313-26)。

在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因选自Atg3、Atg5、 Beclin1、Atg7、Atg9a、Atg16L1、FIP200、和Ambra1或其组合(参见 Mizushima N.et al.Methods in mammalian autophagy research.Cell.2010 Feb5；140(3):313-26.)。

在一个优选的实施方案中，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂选 自siRNA、shRNA，和miRNA或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述纳米银可以具有不同形貌、粒径和表 面修饰，所述形貌包括球形，薄片状、立方体或其他多面体，所述粒径为 5-300纳米，所述表面修饰包括PVP、PEG或肽修饰等。

本发明的第二个方面提供自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表 达的试剂用于制备促进纳米银对肿瘤细胞杀伤的药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。

在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自 噬下游降解阻断剂，优选选自wortmannin、LY294002、3-MA、氯化铵、bafilomycin  A1，E64d和pepstatin A或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因选自Atg3、Atg5、Beclin1、 Atg7、Atg9a、Atg16L1、FIP200、和Ambra1或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂选 自siRNA、shRNA，和miRNA或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述纳米银可以具有不同形貌、粒径和表 面修饰，所述形貌包括球形，薄片状、立方体或其他多面体，所述粒径为 5-300纳米，所述表面修饰包括PVP、PEG或肽修饰等。

附图说明

图1纳米银扫描电镜分析：合成的纳米银的粒径为26.5±8.4nm；

图2纳米银DLS分析：动态光散射分析显示，纳米银的水合粒径为58.8± 1.7nm；

图3纳米银引起HeLa细胞自噬：

a与阳性对照雷帕霉素(Rap)相同，纳米银引起EGFP-LC3/HeLa细 胞内发生荧光点聚集；

b纳米银在EGFP-LC3/HeLa细胞中引起的自噬效应随时间增加而增 强；

c纳米银在HeLa细胞中引起的自噬效应随使用浓度加大而增强；

图4wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：

a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银处理造成Hela细胞活 性减弱20.91％；

b ANXA5-FITC PI流式分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银对Hela 细胞杀伤效果增强了29.37％；

c HO/PI染色统计：wortmannin抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤 效果增强了20.18％；

图5bafilomycin A1抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：

a MTT：BFA抑制自噬后，纳米银处理造成Hela细胞活性减弱25.01％；

b ANXA5-FITC PI流式分析：BFA抑制自噬后，纳米银对Hela细胞 杀伤效果增强了31.28％；

c HO/PI染色统计：BFA抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增 强了20.58％；

图6通过转染ATG5siRNA抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：

a HeLa细胞转染ATG5siRNA后，敲低了HeLa细胞中的ATG5表达 水平和自噬水平；

b MTT分析：转染ATG5siRNA后，纳米银处理造成Hela细胞活性 减弱了27.41％；

c ANXA5-FITC PI流式分析：转染ATG5siRNA后，纳米银对Hela 细胞杀伤效果增强了20.23％；

d HO/PI染色统计：转染ATG5siRNA后，纳米银对Hela细胞杀伤效 果增强了20.58％；

图7B16细胞中wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：

a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银处理造成B16细胞活性 减弱了28.54％；

b ANXA5-FITC PI流式分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银对B16 细胞杀伤效果增强了23.66％；

图8wortmannin抑制自噬促进纳米银对黑色素瘤的杀伤：

a纳米银或wortmannin处理，不会造成小鼠体重的减轻；

b给药过程中小鼠黑色素瘤体积变化；

c给药结束后小鼠瘤重统计显示，纳米银处理组中，小鼠瘤重减轻了 42.10％，wortmannin与纳米银共处理组瘤重则减轻了60.91％，这表明抑 制自噬后纳米银的抗肿瘤效果增强了18.81％。

具体实施方式

本发明通过以下技术方案实现。

实验方法

纳米银合成方法

我们用基于连续流技术的电化学法合成了PVP包裹的纳米银颗粒，具体方 法为，将纯的银棒进行抛光和清洗，然后安装在密封容器的盖子上，通电 电压为15V，反应过程中每分钟变化一次电极方向，反应温度为90℃。将 5毫克/毫升的PVP K30(30154484,Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd)溶液通过注射器以100毫升/小时的速度持续匀速注入容器，最后，将 收集到的银颗粒溶胶通过0.22微米的滤膜进行过滤即得到了所需的纳米 银颗粒。

纳米银表征

透射电镜分析：将分散于去离子水中的纳米银溶液滴到铜网的碳膜上，室 温干燥，无需染色，直接用透射电子显微镜(JEOL,Tokyo,Japan)进行观 察拍照。直接用拍得的图片进行纳米银粒径分析，通过Image J软件分析 超过800个纳米颗粒的粒径,统计后得到纳米银的平均粒径、标准差和大小 分布。

用Malvern ZetasizerNano检测仪(Malvern Instrument Ltd.,Worcestershire, UK)检测动态光散射以及zeta电势时，用去离子水配制纳米银溶液至30 μg/mL，室温进行检测。

细胞培养以及EGFP-LC3/HeLa细胞系构建

细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad,CA)。在本研究中用到的细 胞(均来源于上海细胞库)均连续单层培养于含有10％FBS的DMEM培养 基中，培养条件为37℃，含5％CO₂。构建HeLa EGFP-LC3细胞系时，用 Lipofectamine2000转染pEGFP-LC3质粒(参见Y.Kabeya,et al.LC3,a  mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome  membranes after processing.EMBO J.2000Nov 1；19(21):5720-8.)到HeLa 细胞中，具体操作为：

1)分HeLa细胞于24孔板，1x10⁵个细胞/孔；

2)次日，将800ng质粒pEGFP-LC3溶于50μL双无培养基(无血清无抗 生素)中，2μLlipo2000溶于50μL双无培养基，轻轻混匀，室温静置5 分钟；

3)将两管轻轻混匀，室温放置20分钟；

4)转染细胞，转染前先将培养基换为100μL双无培养基；

5)转染后的细胞于培养箱培养6小时后换液；

6)转染24小时后，细胞传代于一个新的细胞培养板中，用添加了0.6mg/mL  G418(Promega,Madison,WI,USA)的DMEM培养基进行选择培养；

7)大约10天后，经过扩大培养就获得了在荧光显微镜下强烈表达绿色荧 光的细胞克隆。

EGFP-LC3点聚集形成分析

1)分EGFP-LC3HeLa细胞于24孔板，1x10⁵个细胞/孔；

2)当EGFP-LC3HeLa细胞长到约60％密度时，加纳米银或者阳性对照雷 帕霉素处理细胞；

3)处理到指定时间后拍照；

4)对图片中含有荧光点聚集的细胞比率进行统计分析。统计方法为，计 算含有至少5个EGFP-LC3点聚集的细胞在所有表达绿色荧光蛋白的细胞 (在我们构建的稳定表达EGFP-LC3的细胞中，100％的细胞表达绿色荧 光蛋白)中的比例。这个实验需要两个不同的实验者进行双盲实验。

Western blot蛋白印迹实验

1)细胞样品处理及制作电泳用样品：胰酶消化收集处理后的细胞，800xg 离心后去除上清，加入含有蛋白酶抑制剂(Sigma,P8340)的细胞裂解液 (1％Nonidet P-40(Beyotime,ST366),1％sodium deoxycholate(Pierce, #89905),25mMTris-HCl,150mMNaCl,pH7.6)于冰上裂解细胞，然后加 入等体积2x SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳 样品。

2)SDS-PAGE电泳：根据所需蛋白的大小配制合适浓度的SDS电泳凝胶， 待测样品等量上样后进行电泳分离(上层浓缩胶恒压80伏特，下层分离 胶恒压120伏特)。

3)转膜：SDS-PAGE电泳完成后进行转膜(若为硝酸纤维素膜则直接使 用，PVDF膜需要用甲醇激活才能使用)，350安培恒流90分钟，转膜过 程在冰水浴中进行。

4)封闭：转膜完成后，将载有蛋白的膜置于TBST缓冲液配置的5％脱脂 牛奶中，摇床室温封闭1小时。

5)一抗孵育：根据蛋白抗体的使用说明或预实验结果，配制合适浓度的 一抗，封闭后的转移膜室温孵育一抗3小时或4℃过夜。

6)洗涤一抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。

可以根据实验需要适当减少或增加洗涤次数。

7)二抗孵育：用一抗相对应的二抗室温摇床孵育膜40分钟到1小时。

8)洗涤二抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。

9)显色检验：膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒(Biological Industries, Beit Haemek,Israel)和柯达医用胶片进行显色检测。

MTT细胞活力分析

噻唑蓝(MTT)比色法检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。实验步骤为：

1)HeLa细胞培养于96孔板中，当细胞接近1x10⁴个细胞/孔的时候，加 纳米材料进行处理，每个组5个复孔。

2)加入5毫克/毫升的MTT至终浓度0.5mg/mL，于37℃细胞培养箱中培 养4小时。

3)小心吸去孔内培养基终止培养。

4)每孔加入150μL DMSO，置摇床上摇晃至结晶物充分溶解均匀，注意 液体不能溢出。

5)然后在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔吸光值(Elx800,BioTek, Winooski,VT,USA)。

细胞凋亡检测

检测原理：ANXA5选择性结合磷酯酰丝氨酸。正常情况下，磷酯酰丝氨 酸主要分布在细胞膜内侧，在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会 把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)(购自碧云天生物技术研究所)则 是利用了这一原理，用FITC标记的重组人ANXA5直接地检测到磷酯酰 丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI) 可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。 对于坏死细胞，由于细胞膜已经不完整，Annexin V-FITC可以进入到细胞 质内，与细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而使坏死细胞也呈现绿色荧 光。

实验步骤：

1)把处理后的细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次， 加入适量胰酶消化细胞。消化好后加入之前收集的细胞培养液，终止消化， 这样可以保证收集到已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞。

2)将收集到的细胞1000xg离心5分钟，弃上清，用PBS轻轻重悬细胞 并计数。

3)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin  V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

4)加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

5)加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。

6)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，孵育过程中可以重悬细胞2-3次， 随后置于冰浴中。

7)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧 光。

细胞死亡检测

Hoechst33342是一种可以穿透活细胞细胞膜的蓝色荧光染料。PI不可以 透过活细胞的细胞膜，只能透过破损的细胞膜从而对核染色呈现红色荧 光，所以可以指示死细胞。简单说来，用培养基配制10mM Hoechst33342 和10mM PI混合液，于37℃恒温培养箱染色20分钟，然后在荧光显微镜 下拍照。每组统计600个细胞，PI阳性的细胞在Hoechst阳性细胞中所占 的比例则为细胞死亡率。这个实验需要两个作者进行双盲检测。

siRNA转染细胞实验

ATG5siRNA(由4条siRNAs按照相同质量比混合使用，以下为各自的序 列：Sense 5'-GGA AUA UCC UGC AGA AGA ATT-3'(SEQ ID No：1), Anti-sense 5'-UUC UUC UGC AGG AUA UUC CTT-3'(SEQ ID  No：2)；Sense 5'-CAU CUG AGC UAC CCG GAU ATT-3'(SEQ ID No： 3),Anti-sense 5'-UAU CCG GGU AGC UCA GAU GTT-3'(SEQ ID No：4)； Sense 5'-GAC AAG AAG ACA UUA GUG ATT-3'(SEQ ID No：5),Anti-sense 5'-UCA CUA AUG UCU UCU UGU CTT-3'(SEQ ID No：6)；Sense 5'-CAA  UUG GUU UGC UAU UUG ATT-3'(SEQ ID No：7),Anti-sense 5'-UCA AAU  AGC AAA CCA AUU GTT-3'(SEQ ID No：8))，和阴性对照siRNA(序列 信息为：Sense 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'(SEQ ID No：9), Antisense 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'(SEQ ID No：10))购自 上海吉玛生物科技公司。实验步骤为：待24孔板中细胞55％到65％细胞 密度时，每孔转染20nM siRNA，RNAimax(Invitrogen,13778-075)用作转 染试剂，转染操作为：将20nM siRNA溶于100μL opti-MEM培养基中， 2μL RNAimax溶于100μL opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5 分钟；将两管轻轻混匀，室温放置20分钟，24孔板中预先加入300μL含 10％FBS的DMEM培养基，将混合物转染细胞。24小时后换液。转染36 到48小时后，可加纳米银进行处理。

荷瘤鼠构建以及给药

首先我们构建了小鼠动物模型，我们购买了16只6-8周的SPF级的 C57BL/6雄鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，剃掉其左侧 腋下的毛，然后将1x 10⁶个重悬于100微升无菌PBS中的B16细胞注入 左侧腋下。4天后，就构建成功了带直径为4-6毫米的B16皮下肿瘤的小 鼠模型。将小鼠随机分为4个组：对照组、wortmannin组、纳米银组、纳 米银加wortmannin组，每组4只鼠。从接种B16细胞开始的第五天开始 给药：wortmannin组每天注射25nmol/kg wortmannin；纳米银组每天注射 1.5mg/kg纳米银；纳米银加wortmannin组每天注射1.5mg/kg纳米银加 上25nmol/kg wortmannin；对照组则为等量的生理盐水。每天给药一次， 均为在位给药。每天测量小鼠体重和肿瘤的直径，连续给药8天后，牺牲 小鼠，剥取皮下肿瘤并进行称重统计。

实施例1：电化学法合成水溶性纳米银颗粒

我们用基于连续流技术的电化学法合成了PVP包裹的纳米银颗粒，通过扫 描电镜(图1)分析得知，我们合成的纳米银的粒径为26.5±8.4nm。动态光 散射分析(图2)显示，纳米银的水合粒径为58.8±1.7nm，多分散指数为 0.29±0.04。纳米银在水中的zeta电势为-12.9±1.1mV。

实施例2：纳米银处理引起细胞内自噬

我们构建了稳定转染EGFP-LC3的HeLa细胞系，当自噬发生时，便可以 看到细胞内有绿色荧光点聚集(图3a)。在24孔板中，当EGFP-LC3/HeLa 细胞长到约60％密度时，加入10微克/毫升的纳米银处理细胞，分别于0、 2、4、6、8、10、12小时拍照，并对含有荧光点聚集的细胞比率进行统计 分析，我们发现随着时间的增加，含有荧光点聚集的细胞的比例就越大， 表明引起的细胞自噬就越强(图3b)。在24孔板中，当HeLa细胞长到约 60％密度时，加不同浓度(0、5、10、15、20微克/毫升)的纳米银处理 细胞24小时，然后用细胞裂解液裂解细胞收样，通过western blotting进 行检测，我们发现随着纳米银使用浓度的增加，引起的自噬效果增强(图 3c)。

实施例3：wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤

在24孔板中，当HeLa细胞密度长到约60％时，我们分别用浓度为1μM 的wortmannin(购自Sigma-Aldrich)、10微克/毫升纳米银、1μM的 wortmannin加上10微克/毫升纳米银共处理细胞24小时，然后通过MTT、 Annexin A5(ANXA5)-FITC PI流式分析、HO/PI染色分析三种方法对细 胞凋亡情况进行检测。MTT结果显示1μM的wortmannin与10微克/毫升 纳米银共处理与单用纳米银处理相比，细胞活性减弱了20.91％， wortmannin单处理对细胞活性没有影响(图4a)。ANXA5-FITC PI流式分 析(图4b)，与MTT分析结果一致，wortmannin将纳米银导致的细胞死 亡(位于右下和右上区域的细胞的相对比例，右下代表早期凋亡细胞，右 上代表凋亡晚期的细胞以及坏死的细胞，下文均同)增加了29.37％。接下 来我们用到了Hoechst(HO)/PI染色分析，由于PI不可以透过活细胞的 细胞膜，只能透过破损的细胞膜而对核染色，所以可以指示死细胞，从图 中可以看出，wortmannin将纳米银导致的细胞死亡增加了20.18％， wortmannin单处理对细胞死亡没有影响(图4c)。

实施例4：bafilomycin A1抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤

我们还尝试了别的自噬抑制剂来检测抑制自噬对纳米银处理下细胞命运 的影响。与上面实验方法相同，我们使用了一种自噬下游的抑制剂100nM  bafilomycin A1(BFA)(购自Sigma-Aldrich)与10微克/毫升的纳米银共处 理，通过MTT、ANXA5–FITC PI流式分析、HO/PI染色分析三种方法对 细胞凋亡情况进行检测，均取得了同wortmannin处理相似的结果。MTT 分析结果显示BFA与纳米银共处理与单用纳米银处理相比，细胞活性减 弱了25.01％(图5a)。ANXA5–FITC PI流式分析与MTT分析结果一致， BFA将纳米银导致的细胞死亡增加了31.28％(图5b)。最后，HO/PI染色 分析显示，与单用纳米银处理相比，BFA与纳米银共处理细胞死亡增加了 20.58％(图5c)。

实施例5：通过ATG5基因敲减抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤

接下来，我们还用到了一个更为专一的抑制自噬的方法—转染自噬相关基 因ATG5siRNA，用来检测抑制自噬对纳米银处理下细胞命运的影响。当 24孔板里面的HeLa细胞长到约55％-65％密度后，利用RNAimax转染20 nMATG5siRNA或者对照siRNA，转染36小时后收样通过western blotting 检测ATG5siRNA对细胞自噬敲减的效果。我们发现我们成功的敲减了细 胞内本底的自噬水平(图6a)。这个时候利用10微克/毫升的纳米银处理 转染ATG5siRNA的细胞24小时，与用10微克/毫升的纳米银处理的转染 对照siRNA的细胞相比，ATG5siRNA处理过的细胞对纳米银处理表现得 更加敏感，通过MTT、ANXA5-FITC PI流式分析、HO/PI染色分析三种 方法对细胞凋亡情况进行检测。MTT结果显示转染ATG5特异性siRNA 的细胞中，纳米银引起的细胞活性减弱了27.41％(图6b)。ANXA5–FITC  PI流式分析显示，与转染对照siRNA的细胞相比，自噬水平降低的细胞 中纳米银导致的细胞凋亡与坏死增加了20.23％(图6c)。最后，Hoechst/PI 染色分析显示，纳米银处理后，转染ATG5特异性siRNA的细胞比转染对 照siRNA细胞死亡增加了20.58％(图6d)。但是转染ATG5特异性siRNA 组并没观察到明显的细胞凋亡或坏死。

总的说来，实施例1-5证明了，无论是利用自噬泡形成抑制剂，还是自噬 下游降解阻断剂，或者使用ATG5敲低的方法来阻断自噬，都使得纳米银 对细胞的毒性增加。这就表明纳米银引起的细胞自噬起着保护细胞的作 用。

实施例6：B16细胞中wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤

为了在一个恶性程度很强的肿瘤模型—B16黑色素模型中检验我们的 结果，我们首先探究了在B16细胞中纳米银的效果。在24孔板中，当B16 细胞密度长到约60％时，我们用1μM的自噬抑制剂wortmannin、50微克 /毫升的纳米银、1μM的自噬抑制剂wortmannin加上50微克/毫升的纳米 银分别处理细胞24小时，然后利用MTT和ANXA5–FITC PI流式分析对 细胞凋亡情况进行检测。MTT分析结果显示，1μM的自噬抑制剂 wortmannin与50μg/mL的纳米银共处理组比纳米银单处理组细胞活性减 弱了28.54％(图7a)。ANXA5-FITC PI流式分析显示，wortmannin将纳 米银导致的B16细胞凋亡和坏死增加了23.66％(图7b)。这和在HeLa细 胞中取得的结果是类似的。这表明在B16细胞中，纳米银引起的自噬也起 着保护性细胞的作用。

实施例7：wortmannin抑制自噬促进纳米银对黑色素瘤的杀伤

在B16细胞实验的基础上，我们开展了动物实验。首先我们构建了荷瘤小 鼠动物模型，带直径为4-6毫米的B16皮下肿瘤的小鼠模型构建成功后。 将小鼠随机分为4个组：对照组、wortmannin组、纳米银组、纳米银加 wortmannin组，每组4只鼠。从接种B16细胞开始的第五天开始给药： wortmannin组每天注射25nmol/kg wortmannin；纳米银组每天注射1.5 mg/kg纳米银；纳米银加wortmannin组每天注射1.5mg/kg纳米银加上25 nmol/kg wortmannin；对照组则为等量的生理盐水。每天给药一次，均为 在位给药。每天测量小鼠体重和肿瘤的直径，连续给药8天后，牺牲小鼠， 剥取皮下肿瘤并进行称重统计。统计显示，纳米银处理组中，小鼠瘤重减 轻了42.10％，wortmannin与纳米银共处理组瘤重则减轻了60.91％，这表 明抑制自噬后纳米银的抗肿瘤效果增强了18.81％，同样，wortmannin单 处理组没有明显的抗肿瘤效果(图8)。