药物组合物、包含药物组合物的基体以及药物组合物的用途

摘要

本发明涉及药物组合物用于在感染部位局部治疗或预防组织感染的用途，所述药物组合物包含至少两种不同的A类抗生素或其可药用衍生物，或者A类抗生素以及至少一种B类抗生素或其可药用衍生物。A类包括主要在细胞内有活性的抗生素，其用作细菌RNA聚合酶抑制剂、促旋酶抑制剂或者细菌蛋白质合成抑制剂。B类包括主要在细胞外有活性的抗生素，其用作细菌细胞壁合成抑制剂或细菌蛋白质合成抑制剂，或者直接去稳定化或破裂细菌细胞壁。

说明书

本申请是中国专利申请200880100435.6的分案，后者是2008年7月23日提交的PCT申请PCT/EP2008/006046于2010年1月25日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及根据权利要求1前序的药物组合物的用途、根据权利要求11前序的药物组合物、根据权利要求16的用于治疗细胞外和/或细胞内微生物感染细胞的药物组合物以及根据权利要求22前序的包含药物组合物的基体。本发明还涉及根据权利要求27的抗生素用作抗表面上微生物的抗粘附剂的用途。

背景技术

骨和组织感染是整形外科和外科最为严重的问题，特别是由于不断增加的手术频率。尽管进行了治疗，但是所有骨感染中有30％仍然变为慢性。另外，已知许多病例在声称成功早期治疗之后感染复发。在3％的所有病例中，截肢是仅剩的唯一选择。用抗生素进行全身性治疗很困难，这是因为抗生素渗透骨的能力一般非常差，因此几乎不可能达到高到足以消除感染的浓度。

相比于全身性抗生素疗法，局部施用抗生素更适于治疗骨和其他组织感染，这是因为通过局部施用可以在治疗部位达到比全身性施用更高的抗生素浓度。成功进行局部抗生素疗法的先决条件是首先进行基本的外科治疗，包括对所有骨或组织坏死的清创以及对所有外来物质的清除。现有技术已知的局部抗生素载体有由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的骨水泥，由PMMA制成的珠粒，胶原纤维绒(fleece)和骨替代物。这些载体是市售的，其带有施加于其上的有限数目的抗生素：庆大霉素、妥布霉素、克林霉素、万古霉素和替考拉宁。

尽管利用上述抗生素的局部抗生素疗法已改善了骨和关节感染的治疗，但是这些疗法在很多病例(高达16％)中失败。然而，治疗失败经常最终导致必须进行截肢。

治疗失败的主要原因是a)对某些抗生素的抗性，b)抗生素对固着菌无效，c)位于细胞内的细菌以及d)诱导小菌落变体。在此情形下，b)项的无效是由于生物膜形成以及待清除细菌停止增殖造成的。另外，在此情形下，细胞内应当被理解为针对宿主(即所治疗的对象)的细胞。因此，如果细菌在宿主细胞内，则无法渗透到细胞内部的抗生素不能作用于待清除的细菌。

已知葡萄球菌(Staphylococci)有时可生存在白细胞内。另外，已知表现为所谓小菌落变体表型的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的菌株可以被角化细胞和内皮细胞内化，并可留在细胞内。据证实它们保持在细胞内的溶酶体内。正常表型的金黄色葡萄球菌也可被内皮细胞、成纤维细胞和角化细胞内化，并且可留在细胞内的溶酶体内。

据证实金黄色葡萄球菌分离物表现为两种方式：细胞毒性菌株生存在角化细胞和成纤维细胞内并由于细胞内分裂而对其宿主细胞产生显著的细胞毒性，而非细胞毒性菌株在角化细胞和成纤维细胞内被杀死，这表明摄入金黄色葡萄球菌代表了细胞自主宿主防御的一种重要机制(Krut，O.et al.，Infection and Immunity，2003，71：2716-2723)。

金黄色葡萄球菌还可被成骨细胞内化，但是成骨细胞不能杀死内化的非细胞毒性葡萄球菌，而是它们可在成骨细胞内滞留数日和数周而不增殖。在成骨细胞溶解后，葡萄球菌又可增殖。葡萄球菌以及其它可能的细菌在成骨细胞内的细胞内滞留以及它们在细胞内溶酶体内滞留的潜力可能在骨感染中起到特别的作用。这可能是引起骨感染慢性进展的原因。

尽管仍然没有确切地了解假单胞菌(pseudomonades)、链球菌(streptococci)和肠球菌(enterococci)是否可在成骨细胞中滞留，但是通常可表明这些细菌在细胞内的滞留。此细胞内滞留迄今为止仅仅被认为有可能与其它疾病的慢性进展相关，但是因为假单胞菌、链球菌和肠球菌是骨感染常见的病原体，所以它们的细胞内滞留可能是骨感染慢性进展的原因。

根据这一假设，可解释为何已声称成功治疗的骨感染可以在甚至数年后再次发作。在宿主细胞内，细菌被保护而不受到多种不能渗透细胞膜的抗生素(例如青霉素、糖肽)的作用。尽管浮游(漂浮)细菌引起的急性感染可使用这些抗生素治疗，但是细菌可留在细胞内并在从宿主细胞释放后引起再次感染。

在现有技术中，主要使用通常不能渗透宿主细胞细胞膜的氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素)局部治疗骨和软组织感染。另一方面，据报道氨基糖苷类可在成纤维细胞溶酶体中累积，但是由于溶酶体的低pH而没有活性。

因此，现有技术中用于骨和其它组织感染局部治疗的抗生素不适于成功治疗所有这些感染。特别地，仅含有庆大霉素的局部抗生素载体对表现出小菌落变体表型的细菌感染是无效的，并且甚至可诱导小菌落变体表型的形成。目前用于感染局部治疗的抗生素无一可清除位于细胞内的细菌。

WO 2006/064517公开了一种抗生素组合物，其包含抑制细菌蛋白质合成的第一抗生素和不抑制细菌蛋白质合成的第二抗生素。

US 5,217,493公开了一种可植入医疗装置，其涂覆有抗生物膜定殖的利福平和新生霉素或者利福平和米诺环素。

发明内容

在一个实施方案中，可提供治疗和预防细胞尤其是组织细胞的细胞外和细胞内感染的药物组合物、负载该组合物的基体以及施用该组合物和基体的方法。

还可减少微生物在不同基体表面的粘附率。

制备用于局部治疗和预防组织感染的药物或医疗装置的药物组合物是权利要求1的主题。

在本发明的一个实施方案中，所述局部治疗和预防在感染部位进行。所治疗的组织可以是例如软组织和/或骨组织，包括一般被称为“骨”的组织。根据权利要求1的特征，所述药物组合物包含至少两种不同的A类抗生素或者其可药用衍生物，或者A类抗生素和至少一种B类抗生素或者其各自的可药用衍生物。A类包括主要在细胞内有活性的抗生素，其用作细菌RNA聚合酶抑制剂、促旋酶抑制剂或者细菌蛋白质合成抑制剂。B类包括主要在细胞外有活性的抗生素，其用作细菌细胞壁合成抑制剂或细菌蛋白质合成抑制剂或者直接去稳定化或破裂细菌细胞壁。

在本说明书的情形下，组织感染被理解为微生物引起的组织细胞的细胞外和细胞内感染。

为了克服对所用抗生素的抗性，特别是在长期治疗中，可选择至少两种抗生素的组合。这样的组合还导致更高的效力。尽管一般而言可考虑仅使用细胞内有活性的抗生素，但是还可选择细胞内有活性的抗生素(A类)和细胞外有活性的抗生素(B类)的组合。尽管B类抗生素不是细胞内有活性的，但是它们可抑制抗性的形成，因为它们以杀菌方式作用于细胞外细菌，抗性仅在浮游的增殖细菌群中形成。因为B类细胞外有活性的抗生素显示出与A类抗生素不同的作用机制，所以平行抗性几乎不可能发生。

待使用的药物组合物可包含其它已知的添加剂、分散剂、溶剂或载体物质等等。

为了实现对骨及其它组织感染治疗的良好结果，在一个实施方案中，至少一种所选的抗生素应满足至少一个下列标准：

a)其应渗透宿主细胞(即待治疗对象的细胞，待清除的细菌位于其中)的细胞膜；

b)其应能够到达所述宿主细胞的溶酶体内；

c)其应该在低pH下(特别是在溶酶体中的pH下，即约pH4至pH5)具有活性；

d)其应具有杀菌活性；

e)其应显示对非增殖细菌也具有杀菌活性。

在一个实施方案中，至少一种所选抗生素满足多个上述标准。在另一个实施方案中，满足所有这些标准。在另一个实施方案中，所选的所有抗生素均满足所有这些标准。

在一个实施方案中，用作细菌RNA聚合酶抑制剂的所述A类抗生素包括安沙霉素类，特别是利福霉素类。特别地，可选择利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明。含有利福平的药物组合物特别适于除去细胞内葡萄球菌，其显示出在局部施用药物组合物后3天内被除去。

在另一个实施方案中，用作促旋酶抑制剂的所述A类抗生素包括氟喹诺酮类。特别地，选择氟喹诺酮莫西沙星。

在一个实施方案中，用作细菌蛋白质合成抑制剂的所述A类抗生素包括链阳性菌素(streptogramin)等，例如喹奴普丁(quinupristin)或达福普汀(dalfopristin)。在一个实施方案中，使用喹奴普丁和达福普汀的组合。应当指出，所用的药物组合物可含有多于一种的每类抗生素(如果不使用B类抗生素，则多于两种A类抗生素)，因此总共多于两种抗生素。

在一个实施方案中，用作细菌细胞壁合成抑制剂或者直接去稳定化细胞壁和使其破裂的所述B类抗生素包括糖肽类、磷霉素和多肽类。在一个实施方案中，所选糖肽类抗生素是万古霉素和替考拉宁。在同一个或另一个实施方案中，所选多肽类抗生素是杆菌肽、多粘菌素B以及其它多粘菌素和达帕托霉素(daptomycin)。

在一个实施方案中，用作细菌蛋白质合成抑制剂的所述B类抗生素包括氨基糖苷类。在此情形下，特别地，可选择阿拜卡霉素(arbekacin)。

待用的示例性药物组合物包含利福霉素类和氨基糖苷类。另一种示例性药物组合物包含利福平和阿拜卡霉素；这些组合物基本上覆盖了所有待清除的细菌谱并且可有效对抗问题细菌，例如抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)或抗甲氧苯青霉素的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(MRSE)。这两类抗生素还可有效的抗非增殖(静息)细菌并且耐温(热稳定)，因此可将它们添加到由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)制成的骨水泥中，添加到PMMA珠链中以及添加到用于翻修手术的间隔物中。

待用的另一种药物组合物包含利福霉素和磷霉素。又一种药物组合物包含利福平和磷霉素；这些组合物也基本上覆盖了所有待清除的细菌谱并且有效对抗问题细菌，例如MRSA和MRSE。磷霉素另外具有可逆地结合羟基磷灰石的性质，因此甚至在从载体释放后在骨中比其它抗生素保留更长时间。另外，磷霉素是已知最小的抗生素，其极易扩散或渗透通过或进入骨组织。

待用的另一种药物组合物包含利福霉素和氟喹诺酮。又一种药物组合物包含利福平和莫西沙星。

另外一个目的是提供根据权利要求11的药物组合物。这样的药物组合物可用于在感染部位局部治疗和预防组织感染，从而该用途的另一些实施方案类似于上文所述的那些，在此对其进行完整引用。

这些药物组合物包含至少两种不同的A’类抗生素或其可药用衍生物，或者包含A’类抗生素以及B’类抗生素或其可药用衍生物。在该情况下，A’类包括主要细胞内有活性的抗生素安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明；氟喹诺酮类，特别是莫西沙星；链阳性菌素类，特别是喹奴普丁和/或达福普汀。B’类包括主要在细胞外有活性的抗生素糖肽类，特别是万古霉素或替考拉宁；磷霉素；多肽类，特别是杆菌肽、达帕托霉素或多粘菌素B；以及氨基糖苷类，特别是阿拜卡霉素。应当指出糖肽类不能是仅仅包含两种抗生素并且包含安沙霉素作为第一抗生素的药物组合物中的第二抗生素。

在一个实施方案中，所述药物组合物仅包含糖肽类、多肽类或磷霉素作为可能的B’类抗生素，而不使用氨基糖苷类作为B’类抗生素。在另一个实施方案中，不使用链阳性菌素被作为A’类抗生素。

在一个实施方案中，按照以下方式选择所述抗生素：所述药物组合物中的全部抗生素均不是或者均用作蛋白质合成抑制剂，即a)仅可使用不同的链阳性菌素或者链阳性菌素和氨基糖苷类，或者b)根本不使用链阳性菌素和氨基糖苷类。

在一个替代性实施方案中，所述药物组合物包含利福霉素和氨基糖苷类，特别是利福平和阿拜卡霉素。

在另一个实施方案中，所述药物组合物包含利福霉素和磷霉素，特别是利福平和磷霉素。

这样的组合物包含利福霉素和磷霉素(fosmycin)，其浓度为利福霉素在所治疗的部位达到0.005至100微克/毫升的浓度，优选0.006至80微克/毫升，最优选0.0075至20微克/毫升。磷霉素在所治疗的部位达到1至1000微克/毫升的浓度，优选5至800微克/毫升，最优选10至200微克/毫升。

在又一个实施方案中，所述药物组合物包含利福霉素和多肽类抗生素，特别是利福平和达帕托霉素。

这样的组合物包含利福霉素和达帕托霉素，其浓度为利福霉素在所治疗的部位达到0.005至100微克/毫升的浓度，优选0.006至80微克/毫升，最优选0.0075至20微克/毫升。达帕托霉素在所治疗的部位达到0.1至100微克/毫升的浓度，优选0.5至80微克/毫升，最优选1至20微克/毫升。

在另一个实施方案中，所述药物组合物包含利福霉素和氟喹诺酮，特别是利福平和莫西沙星。

根据权利要求15的用于治疗细胞外和/或细胞内微生物感染细胞和/或用于预防微生物感染细胞的药物组合物实现了本发明的一个目的，所述药物组合物包含至少一种用作细菌RNA聚合酶抑制剂的抗生素、至少一种影响细菌细胞壁或其合成的抗生素和/或至少一种用作促旋酶抑制剂的抗生素。

所述治疗优选局部或全身性进行。

有利地，将安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明用作细菌RNA聚合酶抑制剂。选择糖肽类特别是万古霉素或替考拉宁、磷霉素和多肽类特别是杆菌肽和达帕托霉素作为影响细菌细胞壁或其合成的抗生素。将氟喹诺酮特别是莫西沙星用作促旋酶抑制剂。

利福霉素以0.005至100微克/毫升，优选0.006至80微克/毫升，最优选0.0075至20微克/毫升的浓度使用。磷霉素以1至1000微克/毫升，优选5至800微克/毫升，最优选10至200微克/毫升的浓度使用。莫西沙星以0.1至500微克/毫升，优选0.5至200微克/毫升，最优选1至100微克/毫升的浓度使用。达帕托霉素以0.1至100微克/毫升，优选0.5至80微克/毫升，最优选1至20微克/毫升的浓度使用。在利福霉素、磷霉素、达帕托霉素和/或莫西沙星的组合中优选使用上述相同的浓度。

所述药物组合物对于受感染细胞例如成骨细胞、白细胞、红细胞、角化细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肌细胞和/或内皮细胞尤其有效。

此外，所述药物组合物可有效对抗由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌引起的微生物感染，优选由葡萄球菌类型，最优选由金黄色葡萄球菌引起的微生物感染。

在一个实施方案中，所用的药物组合物还包含生物膜形成抑制剂。至少部分地减少或抑制微生物尤其是细菌在表面上粘附，或者具有减少或抑制细菌在表面上积累以在该表面上形成生物膜之能力的所有物质均被认为是生物膜形成抑制剂。

在一个实施方案中，水杨酸或其药物活性衍生物或盐被用作生物膜形成抑制剂。特别地，可使用水杨酸和氨基糖苷的组合。水杨酸增强了氨基糖苷类抗细菌的微生物活性，尤其是针对大肠杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)：水杨酸盐以质子化形式进入细胞，由此增加了细胞的膜电位。这从而使得氨基糖苷类容易被摄入到细胞内。

甚至水杨酸自身也显示出对细菌的作用。在水杨酸盐存在时有荚膜的肺炎克雷伯菌的生长导致荚膜多糖合成减少。荚膜物质的损失使得肺炎克雷伯菌的细胞表面暴露于宿主防御机制，由此缩短了清除感染所需的时间。水杨酸降低了细菌粘附在表面上以及形成生物膜的能力。尽管水杨酸不提供100％的抗生物膜形成的保护，但是它增强了抗生素的作用。

乙酰水杨酸和/或其主要的代谢产物水杨酸显示出确定的体外和体内对微生物毒力表型的影响。细菌毒力因子帮助介导细菌在宿主机体中的感染。已经提出有下列作用：在实验性感染性心内膜炎中减少对相关生物基体的粘附，减少荚膜产生，减缓生物膜形成以及减少植被生长、植被内细菌增殖和血行播散。水杨酸还正向调节包括多个抗生素抗性基因座在内的特定基因座的翻译。另外，它还诱导胞浆蛋白；并增加喹诺酮抗性。

在水杨酸盐存在下生长后，大肠杆菌中一些类型菌毛的合成(例如定殖因子抗原、P菌毛和1型菌毛)减少。因为菌毛在大肠杆菌对上皮表面的粘附中起重要作用，所以水杨酸盐处理可能预防由一些有菌毛大肠杆菌菌株引起的感染。水杨酸盐还限制大肠杆菌对硅胶导管的粘附。

细菌的趋化作用是通过调节鞭毛旋转来调节的。此旋转在逆时针方向时导致沿直线轨迹游动，在顺时针方向时导致翻滚。水杨酸盐作为化学排斥物被大肠杆菌的tsr基因产物所识别。此识别导致可运动的大肠杆菌长时间翻滚，最终导致细胞从水杨酸盐移开。大肠杆菌的集群行为也被水杨酸盐以浓度依赖性方式抑制。在水杨酸盐存在下大肠杆菌中鞭毛自身的产生生长抑制。这是由抑制鞭毛蛋白的产生所介导的，此蛋白单体构成了鞭毛。还推测水杨酸盐对大肠杆菌中鞭毛合成和运动性的抑制是由于OmpF合成减少造成的，OmpF可能是鞭毛组装所需的。

生物膜由微生物和包裹在微生物来源的多糖基质中的其它物质组成。在水杨酸盐存在下绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的生长减少了生物膜形成所需的细胞外多糖的产生。生物膜形成的减少降低了这些生物粘附在隐形眼镜和医用聚合物上的能力。在表皮葡萄球菌中形成生物膜的组分是细胞外粘液，其由多糖、磷壁酸和蛋白质的复杂混合物构成。在表皮葡萄球菌中粘液相关蛋白质和磷壁酸的产生被水杨酸所抑制。

在金黄色葡萄球菌的情况下，水杨酸缓和两种不同的毒力表型，其对于基质结合即结合纤维蛋白原和纤连蛋白以及α-溶血素活性来说非常相关。这些作用尤其与水杨酸介导的各种结构基因表达减少有关，即fnbA、fnbB和hla。除了抑制基质蛋白质结合和细胞裂解特性之外，在水杨酸存在时胞外酶和蛋白A的产生也增加。这些发现增加了水杨酸通过一个或多个全局调节网络而不是一般基因转录的降低来发挥其抗微生物作用的可能性。全局调节因子sarA及全局调节因子agr被水杨酸减弱，这与hla和fnbA基因体外表达降低是一致的。应当指出，金黄色葡萄球菌毒力参数不是完全被水杨酸所抑制，而是以药物浓度依赖性方式降低，最多降低约50％。

在一个实施方案中，待治疗的感染组织是急性或慢性感染的组织。还可治疗兼有急性和慢性感染，即急性感染叠加慢性感染。

通过提供根据权利要求21的用于医疗目的的基体也实现了此目的。所述基体在局部治疗和预防组织感染时优选用作药物组合物的载体。在另一个实施方案中，所述基体还可在外科清创术中切除感染组织之后局部用作添加物。

在一个实施方案中，可以用待使用的药物组合物浸透所述基体。在另一个实施方案中，所述药物组合物可以分散在所述基体的基础材料中。在另一个实施方案中，所述药物组合物可以与所述基础材料一起聚合。因此，可用所述药物组合物涂敷所述基体，和/或将所述药物组合物掺入所述基体中。

在一个优选的实施方案中，所述基体在施加所述药物组合物之前进行特殊处理，例如喷砂或羟基磷灰石涂敷。

本说明书的范围内还包括由其中存在所述药物组合物(例如以分散形式存在)的载体材料制成的涂层。这些载体材料可包括聚交酯。然后，将具有分散药物组合物的载体材料作为涂层施加在所述基体上，或者直接施加在后者表面上，或者施加在已经存在于其表面或另一个层上的层。

在一个实施方案中，所述基体包括纤维绒(fleece)、织物、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯共聚物、可吸收聚合物、聚乙烯、金属或金属合金(例如Ti₆Al₄V合金或其它钛合金)、陶瓷、骨水泥(尤其是由聚合物材料制成或者由磷酸钙制成)和/或骨替代物。因此，PMMA珠链主要由甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯的共聚物以及甘氨酸组成，作为局部抗生素载体施用的具体药物组合物是可能的基体。另外，骨水泥可意欲用于隔离物以及用于翻修手术。

在PMMA珠链的情况下，可采用下列的使用方式：首先将药物组合物分散于PMMA基础材料中。将粉末加热到180摄氏度，并通过注射模塑法填充成型。所述药物组合物被分布在整个基础材料中，其可以从PMMA珠的内部部分扩散到表面，在表面它可以与存在于PMMA珠链周围的细菌相互作用。所述PMMA珠链可包含0.1-10wt％，优选0.5-8wt％，最优选1-5wt％的抗生素。

在另一个实施方案中，特别是在翻修手术的情况下，所述基体是可植入假体，其中各实例包括人工关节以及尤其是膝、髋、肩、肘假体以及脊椎植入物。此外，所有的外伤手术植入物(如螺钉、板等)均可用作基体。所述基体涂层的每平方厘米基体表面积可包含10-1000微克/平方厘米、优选20-500微克/平方厘米、最优选50-300微克/平方厘米的抗生素。

在一个实施方案中，所述纤维绒或织物包含天然或合成纤维，其可以是可生物降解的，其中聚交酯(polylactide)(聚乳酸)是示例性材料。在另一个实施方案中，所述纤维绒或织物包含胶原，其中所述纤维绒可基本上由胶原组成。在后者的情况下，所述胶原纤维绒也是完全可生物降解的。所述纤维绒的每平方厘米纤维绒可包含0.01-10毫克/平方厘米、优选0.1-8毫克/平方厘米、最优选0.5-5毫克/平方厘米的抗生素。

此外，描述了用药物组合物局部治疗对象的方法，所述药物组合物包含：

-至少两种不同的A类抗生素或其可药用衍生物，或者

-A类抗生素和至少一种B类抗生素或其可药用衍生物，其中

A类包括细胞内有活性的抗生素，其用作

-细菌RNA聚合酶抑制剂，

-促旋酶抑制剂，或

-细菌蛋白质合成抑制剂，和

B类包括细胞外有活性的抗生素，其

-用作细菌细胞壁合成抑制剂，

-用作细菌蛋白质合成抑制剂，或

-通过直接去稳定化细菌细胞壁或使其破裂而起作用。

此方法尤其可用于治疗所述对象的组织感染，其中所述组织可以是例如软组织和/或骨组织和/或骨。这些感染可以是由外科手术引起的，特别是由与将植入物植入人体或非人体内相关的手术引起的。因此，所述治疗可用于人体或非人体。

关于此方面的其它实施方案，参考上述说明，其类似地适用于所述方法，特别是与待使用的基体以及待选择的抗生素有关的方法。

另一个目的通过使用用作抗表面上微生物的抗粘附剂的组合来实现，所述组合包含至少一种用作细菌RNA聚合酶抑制剂的抗生素和至少一种影响细菌细胞壁或其合成的抗生素。

所述细菌RNA聚合酶抑制剂优选选自安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明。

所述影响细菌细胞壁或其合成的抗生素优选选自糖肽类特别是万古霉素或替考拉宁、磷霉素和多肽类特别是杆菌肽或达帕托霉素。优选的组合包含利福霉素和磷霉素。

在另一个实施方案中，所述微生物是革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌，优选葡萄球菌类型，最优选金黄色葡萄球菌。

至少一种细菌RNA聚合酶抑制剂和至少一种影响细菌细胞壁或其合成的抗生素的组合优选粘附于或涂覆在表面之上，所述表面由金属(优选钛、钢或金属合金)、陶瓷以及骨水泥或羟基磷灰石制成。

当涂覆于基体上时，所述组合可包含利福霉素和磷霉素，其浓度分别为10至1000微克/平方厘米，优选20至500微克/平方厘米，最优选50至200微克/平方厘米。

有利地，所述抗粘附作用还伴有对围绕所涂覆表面之组织的杀菌效果。

通过下列附图和实施例进一步详细说明实施方案的实例。

附图说明

附图显示：

图1是金黄色葡萄球菌ATTC6538P在成骨细胞MG63细胞培养物上清中的CFU；

图2是金黄色葡萄球菌BAA44在成骨细胞MG63细胞培养物上清中的CFU；

图3a是在用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染后，然后在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加利福平到细胞培养物上清中，成骨细胞MG63的代谢活性；

图3b是在用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染后，然后在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素到细胞培养物上清中，成骨细胞MG63的代谢活性；

图3c是在用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染后，然后在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素、利福平及其组合到细胞培养物上清中，成骨细胞MG63的代谢活性；

图3d是在用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染后，然后在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加含有10微克/毫升磷霉素以及0.006-0.0075微克/毫升利福平的混合物到细胞培养物上清中，成骨细胞MG63的代谢活性；

图3e是在用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染后，然后在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加莫西沙星到细胞培养物上清中，成骨细胞MG63的代谢活性；

图4a是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4b是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加利福平到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4c是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加含有50微克/毫升磷霉素以及2.5-40微克/毫升利福平的混合物到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4d是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加含有25-400微克/毫升磷霉素以及2.5微克/毫升利福平的混合物到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4e是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素、利福平以及含有50微克/毫升磷霉素和10微克/毫升利福平的混合物到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4f是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素、利福平以及含有25微克/毫升磷霉素以及2.5微克/毫升利福平的混合物到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图4g是在用溶葡萄球菌素处理以除去细胞外细菌后添加磷霉素、利福平以及含有50微克/毫升磷霉素以及20微克/毫升利福平的混合物到成骨细胞MG63细胞培养物上清中之后，位于成骨细胞MG63中的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图5a是在万古霉素或利福平/磷霉素涂覆的钛盘上孵育金黄色葡萄球菌1.5小时后，每个钛盘的金黄色葡萄球菌ATTC6538P的CFU，所述钛盘在孵育前洗一次或三次；

图5b是在利福平/磷霉素涂覆的钛盘上孵育表皮葡萄球菌2小时后，每个钛盘上表皮葡萄球菌ATTC35984的CFU，所述钛盘在孵育前洗两次；

图5c是在万古霉素或利福平/磷霉素涂覆的钛盘上孵育金黄色葡萄球菌1.5小时后，每个钛盘的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU，所述钛盘在孵育前洗一或两次；

图5d是在基本培养基中万古霉素或利福平/磷霉素涂覆的钛盘上孵育金黄色葡萄球菌过夜后，钛盘上或上清中金黄色葡萄球菌BAA44的CFU；

图6是在金黄色葡萄球菌BAA44与抗生素一起孵育过夜后，在成骨细胞MG63细胞中居于细胞内或者粘附于成骨细胞MG63细胞上的金黄色葡萄球菌BAA44的CFU。

具体实施方式

1.利福平和磷霉素或其组合用于治疗细胞外感染的用途

1.1.利福平和磷霉素或其组合用于治疗金黄色葡萄球菌金黄亚种Rosenbach(ATTC6538P)感染的成骨细胞MG63细胞外感染的用途

在感染前24小时，用细胞脱离介质Accutase使成骨细胞MG63细胞脱离。使用Neubauer计数板测定细胞数。将细胞接种在未涂敷的24孔板上，细胞密度为在含10％FCS(胎牛血清)、1％Glutamax-I和1％丙酮酸钠的1毫升DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基)中1.5×10⁴个细胞/平方厘米，在37摄氏度和5％CO₂下孵育。

通过用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染5毫升Caso-Bouillon培养基来制备金黄色葡萄球菌ATTC6538P过夜培养物。在37摄氏度下将该培养物摇动(450U/分钟)孵育过夜。将100微升过夜培养物转移到5毫升Caso Boulillon培养基中，并在感染之前于37摄氏度下摇动(450U/分钟)孵育2小时。

用移液器从孔中移出成骨细胞MG63的细胞培养物上清。将1毫升含有1×10⁶金黄色葡萄球菌ATTC6538P细胞的培养液加入到各个孔中。用金黄色葡萄球菌ATTC6538P孵育两个24孔板。组合的成骨细胞和细菌在37摄氏度和5％CO₂气氛下孵育1.5小时。使用显微镜确定细菌的存在。

1.5小时后，除去上清，用无添加剂的37摄氏度的温DMEM小心清洗孔两次。如果在清洗步骤中没有过多的细胞脱落的话，进行显微镜检查。在清洗过程中，仅仅漂浮的细胞被除去，可见大量粘附于细胞和细胞培养塑料的细菌。然后，将1毫升细胞培养完全培养基添加到含有下述抗生素的每个孔中：

-100微克/毫升庆大霉素

-1微克/毫升利福平

-100微克/毫升磷霉素二钠

-1微克/毫升利福平+100微克/毫升磷霉素二钠

-1微克/毫升利福平+100微克/毫升庆大霉素

没有使用不含抗生素的阴性对照，这是因为在不存在抗生素时旺盛的细菌生长会损伤成骨细胞。

孵育24小时后，将100微升细胞培养物上清在Caso琼脂板(酪蛋白胨大豆胨肉汤)上直接划线，例如在利福平、磷霉素、利福平/磷霉素和利福平/庆大霉素的情况下，或者在适当稀释(例如对于庆大霉素而言1∶100稀释)后，在37摄氏度下孵育过夜。将每组两个孔的上清划线。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

测定了上清的CFU(菌落形成单位)，并在图1中显示。

图1清楚地显示位于成骨细胞MG63培养上清中的金黄色葡萄球菌ATTC6538P对除庆大霉素外的不同抗生素的敏感性。尽管所用浓度高于对此金黄色葡萄球菌菌株所测的MIC值(最小抑菌浓度)，但是使用该抗生素处理并不能完全除去该细菌。这是由于细菌定居于细胞或者细胞培养塑料制品的表面，其导致对抗生素的敏感性降低。这模拟了体内的情况，在体内葡萄球菌容易结合细胞外基质和异物。利福平、磷霉素以及利福平/庆大霉素的组合的作用是中等的，而利福平/磷霉素的组合显示出强的协同作用。

1.2.利福平和磷霉素或其组合用于治疗金黄色葡萄球菌金黄亚种(BAA44)感染的成骨细胞MG63的细胞外感染的用途

用金黄色葡萄球菌BAA44(具有抗多种抗生素的额外抗性的MRSA菌株)感染成骨细胞MG63的实验设置基本上与上述相同。

使用下列抗生素：

-100微克/毫升万古霉素

-10微克/毫升利福平

-100微克/毫升磷霉素

-10微克/毫升利福平+100微克/毫升磷霉素

-10微克/毫升利福平+100微克/毫升万古霉素。

孵育24小时后，将100微升细胞培养物上清在Caso琼脂板(酪蛋白胨大豆胨肉汤)上直接划线，例如在万古霉素、利福平/磷霉素和利福平/万古霉素情况下，或者在适当稀释(例如对于利福平和磷霉素而言1∶100稀释)后，在37摄氏度下孵育过夜。将每组两个孔的上清划线。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

测定了上清的CFU(菌落形成单位)，并在图2中显示。

图2清楚地显示位于成骨细胞MG63细胞培养上清中的金黄色葡萄球菌BAA44对于不同抗生素的敏感性。应指出，需要将CFU调整为对数值。

所用浓度的利福平如预期几乎不显示任何效力，因为金黄色葡萄球菌BAA44是利福平抗性菌株。另外，磷霉素的抗生素作用相对较小。然而，利福平/磷霉素的组合显示对细胞外金黄色葡萄球菌BAA44的强协同作用，由于单一化合物的作用微弱，这是出乎意料且未预期到的。

组合的利福平/磷霉素的作用甚至比万古霉素的作用还要好一些，万古霉素是治疗MRSA感染的最重要抗生素之一。万古霉素和利福平的组合也显示出轻微的协同作用。值得注意的是用于此实验的万古霉素浓度非常高，以增强万古霉素的否则很弱杀菌作用。100微克/毫升浓度的万古霉素不能使用静脉内施用来实现。

2.不同抗生素即利福平和磷霉素或其组合用于治疗细胞内感染的用途

2.1.不同抗生素即利福平和磷霉素或其组合用于治疗金黄色葡萄球菌金黄亚种Rosenbach(ATTC6538P)感染的成骨细胞MG63的细胞内感染的用途

测定用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染的成骨细胞MG63的细胞内感染的实验设置基本上与上述相同。

但是，为了除去细胞外金黄色葡萄球菌ATTC6538P，在感染后添加抗生素前用溶葡萄球菌素处理每一细胞培养物。

为此目的，从每个孔中取出细菌悬液，用含有10％FCS的温DMEM清洗细胞一次。向每个孔中加入250微升25微克/毫升的溶葡萄球菌素溶液。将细胞在37摄氏度孵育10分钟。之后，可用显微镜观察到没有细胞外细菌。完全除去溶葡萄球菌素溶液，用1毫升温DMEM清洗细胞一次。然后，加入具有下列成分的抗生素溶液：

-100微克/毫升万古霉素

-100微克/毫升庆大霉素

-0.01至100微克/毫升利福平

-10-1000微克/毫升磷霉素

-1微克/毫升利福平+100微克/毫升磷霉素

-1微克/毫升利福平+100微克/毫升庆大霉素

-1至100微克/毫升莫西沙星

将感染细胞在37摄氏度和CO₂气氛下孵育24小时。

为了测定感染后成骨细胞MG63的代谢活性，除去细胞上清并将1毫升新鲜的温细胞培养基加入到每个孔中。之后，向每个孔中添加200微升MTT溶液(3[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴)。将培养物在37摄氏度5％CO2气氛下孵育2小时。除去细胞培养物上清，用1毫升异丙醇溶解由于代谢活性形成的甲臜。将200微升每种悬液转移到96孔微量滴定板中，用ELISA读取仪(Tecan)测定540纳米处的吸光度。

540nm处的吸光度是成骨细胞MG63细胞代谢活性的指示剂。细胞毒性金黄色葡萄球菌ATTC6538P在成骨细胞MG63中的细胞内增殖导致感染细胞的死亡。消光值越低，细胞代谢活性就越低，因此金黄色葡萄球菌ATTC6538P对细胞的感染就越强。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

图3a-d显示了不同抗生素对成骨细胞MG63的代谢活性的影响。

万古霉素不能渗透到细胞内，因此不影响金黄色葡萄球菌在成骨细胞内部的细胞内增殖。因此，成骨细胞的代谢活性由于金黄色葡萄球菌ATTC6538P的感染而大大降低(图3a-d)。庆大霉素也一样。尽管如此，庆大霉素与利福平的组合中代谢活性高于单独的利福平(未显示数据)。

另一方面，利福平能够显著减少金黄色葡萄球菌ATTC6538P引起的细胞死亡(图3a)。低浓度(0.006微克/毫升)已经足以增加代谢活性。

磷霉素也影响金黄色葡萄球菌ATTC6538P的细胞内增殖，由此影响受感染成骨细胞的代谢活性(图3b)。10微克/毫升磷霉素仅仅轻微地增加代谢活性，而100微克/毫升具有最大的作用，几乎使代谢活性翻倍。此结果是出乎意料的，因为迄今为止尚不知道磷霉素能够渗透到细胞内。仅仅知道磷霉素可渗透到嗜中性粒细胞内。

利福平和磷霉素的组合还导致代谢活性的增加(图3d)，甚至显示协同作用(图3c)。

施用1至100微克/毫升莫西沙星也可抑制金黄色葡萄球菌ATTC6538P的细胞内生长，因此代谢活性增加多达两倍以上(图3e)。

2.2.利福平、磷霉素或其组合用于治疗金黄色葡萄球菌金黄亚种(BAA44)感染的成骨细胞MG63的细胞内感染的用途

测定用金黄色葡萄球菌BAA44感染的成骨细胞MG63的细胞内感染的实验设置基本上与上述金黄色葡萄球菌ATTC6538P的相同。

因为非细胞毒性金黄色葡萄球菌BAA44留在成骨细胞中，不像细胞毒性菌株金黄色葡萄球菌ATTC6538P一样在细胞内分裂，因此金黄色葡萄球菌BAA44定位于细胞内部不导致成骨细胞的细胞死亡。因此，金黄色葡萄球菌BAA44对成骨细胞MG63的细胞内感染不是根据细胞的代谢活性测定的，而是通过细胞裂解以及细胞内CFU计数来测定的。

加入含有下列成分的抗生素溶液：

-100微克/毫升万古霉素

-2.5至40微克/毫升利福平

-25-400微克/毫升磷霉素

-以及下文给出的不同比例的其混合物。

将感染细胞在37摄氏度5％CO₂气氛下与抗生素一起孵育24小时。

然后，用pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)清洗细胞一次，之后用1毫升林格氏溶液中的0.1％Triton X100进行裂解。将裂解液超声处理5分钟。用移液器充分重新混悬裂解液。仅处理一块24孔板，另一块板保存于4摄氏度下，以使得裂解液中细菌生长最小化。将100微升未稀释的裂解液在Caso琼脂板上划线，在37摄氏度下孵育过夜，计数菌落。

图4a-4g显示每孔的CFU值，其作为成骨细胞MG63的细胞内金黄色葡萄球菌BAA44感染程度的指示剂。CFU值越低，成骨细胞的金黄色葡萄球菌BAA44感染率就越低。这与所添加抗生素的效力相关。由于金黄色葡萄球菌BAA44的细胞内生长弱，抗生素的抗菌作用造成CFU减少。

浓度在50-400微克/毫升的磷霉素显示对细胞内定位的金黄色葡萄球菌BAA44感染率的良好效力(图4a)。出乎意料地，磷霉素的作用可以在允许静脉内施用的浓度下实现(血清中100-400微克/毫升，优选132-297微克/毫升)。由于其优异的组织渗透性，还可在骨中实现高磷霉素浓度。因此，磷霉素成功地用于治疗骨髓炎。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

尽管金黄色葡萄球菌BAA44是利福平抗性株，但利福平显示出良好的细胞内效力(图4b)。

利福平和磷霉素清楚地显示在多种浓度比例下的协同作用(图4c-g)。

甚至在抗利福平的金黄色葡萄球菌BAA44的情况下，所施用浓度也足以允许对骨感染进行全身性治疗。因此，利福霉素和磷霉素的组合适于治疗骨髓炎，并且还可全身性施用。

3.利福平和磷霉素的组合用作医疗基体表面上抗粘附剂的用途

3.1.金黄色葡萄球菌金黄亚种Rosenbach(ATTC6538P)在涂覆有利福平和磷霉素的钛基体上的粘附

通过用金黄色葡萄球菌ATTC6538P感染5毫升Caso-Bouillon培养基来制备金黄色葡萄球菌ATTC6538P过夜培养物。在37摄氏度下将该培养物摇动(450U/分钟)孵育过夜。将100微升过夜培养物转移到5毫升Caso Boulillon培养基中，在37摄氏度下摇动(450U/分钟)孵育2小时。通过光度法测定细菌密度。在测定之前在Caso Bouillon中将细菌悬液1∶2稀释。将含有10％FCS的在Caso Boullion中密度为1x10⁵CFU/ml的细菌悬液用于粘附实验。

不同的是，使用经涂敷的2厘米钛盘作为样品：

-喷砂的钛盘作为阴性对照，

-喷砂并涂覆了200微克/平方厘米万古霉素的钛盘，

-同时涂覆50微克/平方厘米利福平和200微克/平方厘米磷霉素钙的钛盘，

-在第一步骤中用50微克/平方厘米利福平涂覆，第二步骤中用200微克/平方厘米磷霉素钙涂覆的钛盘，以及

-在第一步骤中用200微克/平方厘米磷霉素钙涂覆，第二步骤中用50微克/平方厘米利福平涂覆的钛盘。

在涂覆之后，用PBS清洗钛盘一次或三次。在室温下用5毫升PBS孵育涂覆的和未涂覆的钛盘5分钟。将此再重复二次。在第三次中，在室温下孵育钛盘1小时。在除去PBS溶液之前，翻转或旋转钛盘，以增加抗生素的脱离。随后，将钛盘转移进无菌12孔板。

将不同的钛样品与2毫升细菌悬液在37摄氏度下不摇动孵育1.5小时。

之后，除去细菌悬液，用2.5毫升PBS清洗盘三次。最后一次清洗之后，将各个盘置于10毫升无菌林格氏溶液中。同时检测每组中的仅仅一个盘，而将其它盘保存于4摄氏度下。将林格氏溶液中的钛盘超声10分钟，以使得粘附的细菌脱离。稀释包含脱离细菌的悬液(1∶10、1∶100)，在Caso琼脂板上划线。琼脂板在37摄氏度下过夜孵育，第二天对菌落计数。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

图5a显示与细菌孵育1.5小时后每个钛盘的金黄色葡萄球菌ATTC6538P的CFU。万古霉素仅在一个清洗步骤后具有抗粘附作用，而在三个清洗步骤后不显示任何抗粘附作用。事实上，粘附于涂覆万古霉素的盘上的金黄色葡萄球菌细胞数目等于未涂覆的盘。但是，利福平和磷霉素的组合显示强的抗粘附作用。该作用仅仅轻微地依赖于清洗步骤数。显然，相比于万古霉素，通过几个清洗步骤不大可能将利福平/磷霉素涂层从钛表面上完全除去。

用利福平和磷霉素涂覆盘的顺序--共同涂覆，先利福平后磷霉素；先磷霉素后利福平--似乎不影响其作用(图5a)。

3.2.表皮葡萄球菌ATTC35984在涂覆有利福平和磷霉素的组合的钛基体上的粘附

其实验设置基本上与金黄色葡萄球菌ATTC6538P相同。

不同的是，使用经涂敷的2厘米钛盘作为样品：

-钛盘(喷砂的)作为阴性对照，

-在第一步骤中用50微克/平方厘米利福平涂覆，第二步骤中用200微克/平方厘米磷霉素钙涂覆的钛盘，以及

-在第一步骤中用200微克/平方厘米磷霉素钙涂覆，第二步骤中用50微克/平方厘米利福平涂覆的钛盘。

在与表皮葡萄球菌一起孵育之前，用5毫升PBS清洗经涂敷的钛盘三次。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

表皮葡萄球菌的实验结果(图5b)支持了在金黄色葡萄球菌ATTC6538P的情况下所发现的结果。表皮葡萄球菌ATTC35984在未涂覆钛上的粘附低于金黄色葡萄球菌ATTC6538P的粘附。这可能与表皮葡萄球菌优先粘附塑料或羟基磷灰石而较少粘附于钛有关。尽管在与细菌孵育之前将钛盘清洗三次，但利福平和磷霉素的组合仍显示强的抗粘附作用。

3.3.金黄色葡萄球菌BAA44在涂覆有利福平和磷霉素的组合的钛基体上的粘附

其实验设置基本上与上文所述金黄色葡萄球菌ATTC6538P的相同。

使用下列经涂敷的2厘米钛盘作为样品：

-喷砂的钛盘作为阴性对照，

-涂覆了200微克/平方厘米万古霉素的钛盘，

-喷砂并且在第一步骤中用50微克/平方厘米利福平涂覆，在第二步骤中用200微克/平方厘米磷霉素钙涂覆的钛盘。

在与金黄色葡萄球菌BAA44一起孵育1.5小时之前，用5毫升PBS清洗经涂敷的钛盘一次或两次。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

图5c显示在与金黄色葡萄球菌BAA44孵育后盘上的CFU。万古霉素仅在盘被清洗一次时才减少金黄色葡萄球菌BAA44的粘附：在两个清洗步骤之后，所有万古霉素似乎都被除去，观察到细菌粘附没有减少。尽管金黄色葡萄球菌BAA44有利福平抗性，但组合利福平/磷霉素具有强的抗粘附作用，如果所述盘在与细菌孵育之前被清洗两次而不是一次的话，则该作用仅仅稍微降低。

3.4.涂覆有利福平和磷霉素的钛基体抗金黄色葡萄球菌BAA44的杀菌活性

通过用金黄色葡萄球菌BAA44感染5毫升Caso-Bouillon培养基来制备金黄色葡萄球菌BAA44的过夜培养物。将所述培养物在37摄氏度下摇动(450U/分钟)孵育过夜。将100微升过夜培养物转移到5毫升Caso Boulillon培养基中，在37摄氏度下摇动(450U/分钟)孵育2小时，然后与钛盘一起孵育。通过光度法测定细菌密度。

将基本培养基(PBS，0.2％氯化铵、0.2％硫酸钠、0.25％葡萄糖、1％Caso Bouillon、50微克/毫升6-磷酸葡萄糖)中密度为1×10⁴CFU/ml的细菌悬液用于粘附测定。使用基本培养基替代Caso Bouillon以使得细菌生长最小化。

不同的是，使用经涂敷的2厘米钛盘作为样品：

-钛盘(喷砂的)作为阴性对照，

-涂覆了200微克/平方厘米万古霉素的钛盘(喷砂)，

-在第一步骤中用300微克/平方厘米磷霉素钙涂覆，第二步骤中用70微克/平方厘米利福平涂覆的钛盘。

在涂覆之后，用2.5毫升PBS在室温下清洗钛盘三次。

将不同的钛样品与2毫升细菌悬液在37摄氏度下不摇动孵育15.5小时。

随后，分析上清中以及钛盘上粘附的细菌的CFU。在PBS中1∶10稀释上清，将100微升稀释物在Caso琼脂板上划线。用2.5毫升PBS清洗钛盘四次，以除去未粘附的细菌。最后一次清洗之后，将每个盘置于10毫升无菌林格氏溶液中。同时检测每组中的仅仅一个盘，而将其它盘保存于4摄氏度下。将林格氏溶液中的钛盘超声10分钟，以使得粘附的细菌脱离。稀释包含脱离细菌的悬液(1∶10、1∶100、1∶1000)，在Caso琼脂板上划线。将琼脂板在37摄氏度下孵育过夜，第二天对菌落计数。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

所述结果如图5d所示。在阴性对照中使用基本培养基减少了细菌生长，然而上清中细菌CFU在孵育期间增加了十倍。出乎意料地，可发现比上清中更多的CFU粘附于未涂覆的盘上。

相对于未涂覆对照，万古霉素略微减少了细胞培养物上清中的细菌生长，但是细菌的粘附减少的更多。然而，万古霉素不显示任何杀菌作用，在万古霉素涂覆的钛样品上可发现多于50000的CFU。

尽管在粘附测定前将钛盘清洗三次，但磷霉素/利福平组合仍显示出对利福平抗性株BAA44明显的杀菌活性。在上清中没有检测到CFU，少于100CFU粘附于钛表面。这相当于与未涂覆的钛相比细菌粘附减少了86000倍，与万古霉素涂覆相比减少了470倍。

预计不含有载体基体(例如聚合物基体)的可溶性抗生素涂层在植入后通过溶解到组织液中展现其效力。然后，通过在定植前杀伤漂浮细菌以及由于溶解的抗生素的效力而导致的细菌增殖减少来阻碍对植入体或假体的定植。在几个清洗步骤之后，留在所述盘上并由此可在上清中获得的利福平和磷霉素的量仍足够高，显示出在上清中的抗菌效力。因此，利福平/磷霉素涂层在植入期间与组织液和血液接触时是足够稳定的，仍可有效防止细菌粘附到植入物表面及周围组织上。此性质对于葡萄球菌感染来说尤其重要，因为葡萄球菌并非仅粘附于植入物，还粘附于组织的细胞外基质。

4.利福平和达帕托霉素或其组合用于治疗金黄色葡萄球菌金黄亚种(BAA44)急性感染的成骨细胞MG63的用途

在感染前24小时，用细胞脱离介质Accutase使成骨细胞MG63细胞脱离。使用Neubauer计数板测定细胞数。将细胞接种在未涂敷的24孔板上，细胞密度为含10％FCS(胎牛血清)、1％Glutamax-I和1％丙酮酸钠的1毫升DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基)中1.5×10⁴细胞/平方厘米，在37摄氏度和5％CO₂下孵育。

通过用金黄色葡萄球菌BAA44感染5毫升Caso-Bouillon培养基来制备金黄色葡萄球菌BAA44的过夜培养物。所述培养物在37摄氏度下摇动(450U/分钟)孵育过夜。将100微升过夜培养物转移到5毫升Caso Boulillon培养基中并在感染之前在37摄氏度下摇动孵育(450U/分钟)2小时。

用移液器从孔中移出成骨细胞MG63的细胞培养物上清。将1毫升含有1×106金黄色葡萄球菌BAA44CFU的液体加入到还含有具有下列成分的抗生素的每个孔中：

-50微克/毫升万古霉素

-2.5微克/毫升利福平

-1.25-10微克/毫升达帕托霉素

-以及下文给出的不同比例的其混合物。

将组合的成骨细胞、细菌和抗生素组合物在37摄氏度5％CO₂气氛下孵育18小时。

然后，用pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)清洗细胞一次，之后用1毫升林格氏溶液中的0.1％Triton X100进行裂解。用移液器充分重新混悬裂解液。仅处理一块24孔板，其它板保存于4摄氏度下，以使得裂解液中细菌生长最小化。在PBS中1∶10稀释裂解液，将100微升稀释的裂解液在Caso琼脂板上划线，在37摄氏度下孵育过夜，对菌落计数。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

因为细胞在感染后没有用溶葡萄球菌素处理，所以每个孔的CFU值(图6)是细胞内感染成骨细胞MG63以及金黄色葡萄球菌BAA44细胞外粘附于成骨细胞MG63的程度的指示剂。CFU值越低，成骨细胞的金黄色葡萄球菌BAA44感染率就越低。这与所添加抗生素的效力相关。

因为菌株是利福平抗性的，所以2.5微克利福平的作用小于万古霉素和达帕托霉素，但是有效地阻止了具有漂浮金黄色葡萄球菌BAA44的MG63细胞的过度生长(未显示数据)。

单独的达帕托霉素在1.25微克/毫升和2.5微克/毫升已显示出良好的效力，而5微克/毫升和10微克/毫升可完全消除感染。

尽管利福平单独是无效的，但是2.5微克/毫升利福平和1.25微克/毫升或2.5微克/毫升的达帕托霉素的组合分别在消除所有细胞内和细胞外粘附的细菌上是协同作用的。

因为万古霉素仅有弱的杀菌作用，所以在本实验中使用了非常高浓度的万古霉素以增加其效力。此浓度无法通过静脉内施用万古霉素而达到。但是，数百个金黄色葡萄球菌可以通过侵入成骨细胞逃过万古霉素，此现象在体内尤其是骨感染治疗中有重大意义。

达帕托霉素与类似万古霉素的糖肽类的快速杀菌作用不同，其杀菌活性是浓度依赖性的。因此，5和10微克/毫升的高浓度可在细菌能够侵入成骨细胞之前消除所有细菌。

局部应用利福平和达帕托霉素可有效治疗急性骨感染。达帕托霉素在高浓度下非常有效地消除所有细胞外细菌，因此防止感染新的成骨细胞，而利福平能够根除细胞内感染的成骨细胞。

5.用于医疗目的的经涂覆或浸渍的基体

利福平在甲醇中稀释为30-40mg/ml的浓度。磷霉素钙混悬于超纯水中，浓度为100-140微克/毫升。未使用其它的添加剂。使用墨喷或喷涂方法用抗生素溶液直接涂覆具有不同表面改性(喷砂、多孔涂覆或羟基磷灰石涂覆)的钛内用假体。可以首先用利福平涂覆表面，然后用磷霉素钙，以相反的顺序或者使用两种抗生素同时涂覆。所得涂覆层密度是50-70微克/平方厘米利福平和300-350微克/平方厘米磷霉素。

在纤维绒的生产过程中将利福平、磷霉素二钠以及磷霉素钙掺入到胶原纤维绒中。以溶解于酸性缓冲液中的形式添加利福平和磷霉素二钠，而磷霉素钙以水悬液形式添加。最终浓度是0.1-0.2毫克利福平/平方厘米胶原纤维绒，0.5毫克-2毫克磷霉素/平方厘米胶原纤维绒，而磷霉素二钠和磷霉素钙可以以相对于磷霉素终浓度的不同比例分布。

将利福平和磷霉素二钠与基于PMMA的两种不同聚合物、二氧化锆和甘氨酸相混合。以总重量的0.5-1.5％的量添加利福平，而以总重量的2.5-7.5％的量添加磷霉素二钠。将聚合物/抗生素混合物加热到160-180摄氏度，直接通过注射模塑法在金属线上制备PMMA珠。

本领域技术人员应当了解的是上文给出的描述只是许多替代方案中的一种可能性。

根据上述教导可具有实施本发明的多种修改和变化，因此其落入权利要求的保护范围内。

以下部分对应于母案申请的权利要求：

1.一种药物组合物在制备用于局部治疗和预防组织感染的药物或医疗装置中的用途，所述药物组合物包含：

-至少两种不同的A类抗生素或其可药用衍生物或盐，或者

-A类抗生素和至少一种B类抗生素或其可药用衍生物或盐，其中

A类包括主要在细胞内有活性的抗生素，其用作

-细菌RNA聚合酶抑制剂，

-促旋酶抑制剂，或

-细菌蛋白质合成抑制剂，和

B类包括主要在细胞外有活性的抗生素，其

-用作细菌细胞壁合成抑制剂，

-用作细菌蛋白质合成抑制剂，或

-通过直接去稳定化细菌细胞壁或使其破裂而起作用。

2.根据项1的用途，其特征在于用作细菌RNA聚合酶抑制剂的所述A类抗生素包括安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明。

3.根据项1或2的用途，其特征在于影响细菌细胞壁或其合成的所述B类抗生素包括糖肽类特别是万古霉素或替考拉宁、磷霉素和多肽类特别是杆菌肽和达帕托霉素。

4.根据前述项中任一项的用途，其特征在于其包含利福霉素和磷霉素，特别是利福平和磷霉素。

5.根据前述项中任一项的用途，其特征在于所述药物组合物还包含生物膜形成抑制剂，特别是水杨酸或其可药用衍生物或盐。

6.根据前述项中任一项的用途，其特征在于待治疗的受感染组织被急性或慢性感染。

7.根据前述项中任一项的用途，其特征在于将基体用作所述药物组合物的载体。

8.根据项7的用途，其特征在于所述基体包括纤维绒、织物、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯的共聚物、可生物降解聚合物、聚乙烯、金属、陶瓷、骨水泥和/或骨替代物。

9.根据项8的用途，其特征在于所述纤维绒或织物包括天然或合成纤维，特别是聚交酯和/或胶原。

10.根据项7至9中任一项的用途，其特征在于所述基体包括可植入假体，特别是髋假体、肩假体、肘假体、膝假体或者脊椎植入物或外伤手术植入物。

11.药物组合物，其包含

-至少两种不同的A’类抗生素或其可药用衍生物或盐，或者

-A’类抗生素和至少一种B’类抗生素或其可药用衍生物或盐，其中

A’类包括

-安沙霉素类，特别是利福霉素类例如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明，

-氟喹诺酮类，特别是莫西沙星，

-链阳性菌素类，特别是喹奴普丁和/或达福普汀，以及

B’类包括

-糖肽类，特别是万古霉素或替考拉宁，

-磷霉素，

-多肽类，特别是杆菌肽、多粘菌素B、其它多粘菌素和达帕托霉素，

-氨基糖苷类，特别是阿拜卡霉素，

其中

-糖肽类不能是仅仅包含两种抗生素并且包含安沙霉素作为第一抗生素的药物组合物中的第二抗生素。

12.根据项11的药物组合物，其包含至少一种利福霉素和磷霉素。

13.根据项12的药物组合物，其包含利福霉素和磷霉素，其浓度为在待治疗部位利福霉素达到0.005至100微克/毫升、优选0.006至80微克/毫升、最优选0.0075至10微克/毫升的浓度，在待治疗部位磷霉素达到1至1000微克/毫升、优选5至800微克/毫升、最优选10至200微克/毫升的浓度。

14.根据项11的药物组合物，其包含至少一种利福霉素以及达帕托霉素。

15.根据项14的药物组合物，其包含利福霉素和达帕托霉素，其浓度为在待治疗部位利福霉素达到0.005至100微克/毫升、优选0.006至80微克/毫升、最优选0.0075至20微克/毫升的浓度，在待治疗部位达帕托霉素达到0.1至100微克/毫升、优选0.5至80微克/毫升、最优选1至20微克/毫升的浓度。

16.用于治疗细胞外和/或细胞内微生物感染细胞和/或用于预防微生物感染细胞的药物组合物，其包含至少一种用作细菌RNA聚合酶抑制剂的抗生素、至少一种影响细菌细胞壁或其合成的抗生素，和/或至少一种用作促旋酶抑制剂的抗生素。

17.根据项16的药物组合物，其包含用作细菌RNA聚合酶抑制剂的安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明。

18.根据项16和17的药物组合物，其包含用作影响细菌细胞壁或其合成的抗生素的糖肽类，特别是万古霉素或替考拉宁，磷霉素和多肽类，特别是杆菌肽和达帕托霉素。

19.根据项16至18的药物组合物，其包含作为促旋酶抑制剂的氟喹诺酮，特别是莫西沙星。

20.根据项16至19的药物组合物，其特征在于所述受感染细胞是成骨细胞、白细胞、红细胞、角化细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肌细胞和/或内皮细胞。

21.根据项16至20的药物组合物，其特征在于所述微生物感染由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌引起，优选由葡萄球菌(Staphyloccoci)类型，最优选由金黄色葡萄球菌(Staphyloccoci aureus)引起。

22.用于医疗目的的基体，其包含根据项11至21中任一项的药物组合物。

23.根据项22的基体，其特征在于其被设置和提供用于作为对象急性或慢性组织感染的局部抗生素疗法的药物组合物载体。

24.根据项22-23中任一项的基体，其特征在于它包括纤维绒、织物、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯的共聚物、可生物降解的聚合物、聚乙烯、金属、陶瓷、骨水泥和/或骨替代物。

25.根据项24的基体，其特征在于所述纤维绒或所述织物包括天然或合成纤维，特别是聚交酯和/或胶原。

26.根据项22至25中任一项的基体，其特征在于它包括可植入假体，特别是髋假体、肩假体、肘假体、膝假体或者脊椎植入物或外伤手术植入物。

27.涂覆有根据项11至21中任一项的药物组合物的植入物。

28.至少一种用作细菌RNA聚合酶抑制剂的抗生素和至少一种影响细菌细胞壁或其合成的抗生素的组合用作抗表面上微生物的抗粘附剂的用途。

29.根据项28的用途，其特征在于所述细菌RNA聚合酶抑制剂选自安沙霉素类，特别是利福霉素类如利福平、利福布丁、利福喷丁或利福昔明。

30.根据项28或29的用途，其特征在于所述影响细菌细胞壁或其合成的抗生素选自糖肽类特别是万古霉素或替考拉宁、磷霉素和多肽类特别是杆菌肽和达帕托霉素。

31.根据项28至30的用途，其特征在于所述微生物是革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌，优选葡萄球菌类型，最优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)。

32.根据权利要求28至31中任一项的用途，其特征在于所述表面由金属优选钛、钢或金属合金，陶瓷，骨水泥或羟基磷灰石制成。