一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法

摘要

本发明属于家畜分子标记育种技术领域，具体涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。本发明根据水牛RBP3基因的两个突变位点，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，设计出两对引物，对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物；最后对所得到的扩增产物进行酶切、分型，从而快速、准确地辨别杂交水牛的三种核型。本发明首次证明上述两个突变位点与杂交水牛染色体核型相关，并且可以利用这两个突变位点快速鉴别杂交水牛的染色体核型，可以作为杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。

背景技术

亚洲水牛包括河流型(River Buffalo)和沼泽型(Swamp Buffalo)两个亚种。河 流型水牛主要产于南亚地区，例如尼里-拉菲水牛(巴基斯坦)和摩拉水牛(印 度)，沼泽型水牛则以我国为最。水牛具有较强的抗病力和耐粗饲的特点，适 应湿热气候，非常适合我国南方地区饲养，南方地区鲜奶消费的缺口也可以由 水牛奶填补。水牛奶因口感独特，奶香味浓郁，其脂肪、蛋白质和钙、磷的含 量比普通牛奶高而备受到人们的青睐，从而激起了奶水牛业的兴起和快速发展。 这些年来，在国家产业政策刺激下，水牛奶业日益受到重视，在不久的将来， 奶水牛行业必将成为南方奶业的重要支柱。但是水牛属于单胎动物，繁殖力低， 与黄牛相比，水牛具有发情期晚、发情不明显、受胎率低及产后发情间隔时间 长等特点，整体繁殖力低(王根林，2006)。水牛产奶量与荷斯坦牛相比，仅为其 一半，沼泽型水牛的产奶量更低。在现代化养殖的条件下，仅靠自然繁殖是远 远不能满足需要的，因此一般都会引进河流型水牛进行杂交以提高水牛的繁殖 性能和产奶量。河流型水牛染色体数目是50(Dutt MK，Bhattacharya P. Chromosomes of the Indian water Buffalo.Nature，1952，27:1129-1129)，而沼泽 型水牛为48(Berardino DD，Iannuzzi L.Chromosome banding homologies in  Swamp and Murrah Buffalo.The Journal of Heredity，1981，72:183-188)。导致两 者染色体数目不同的原因是，沼泽型水牛最大的1号染色体，基因和形态上与 河流型水牛4和9号染色体极为相似，相当于河流型水牛第4号染色体短臂的 端粒和9号染色体的着丝粒串联融合，形成一条染色体(Berardino DD，Iannuzzi  L.Chromosome banding homologies in Swamp and Murrah Buffalo.The Journal of  Heredity，1981，72:183-188)。两个亚种之间会杂交产生染色体为49的后代， 这些后代之间是可育的，相互杂交会产生48、49和50三种不同染色体数的后 代。根据有关的研究表明，杂交水牛的繁殖性能比纯种有所降低，主要体现在 其核型数2n＝49的杂交水牛会产生异常配子，导致胚胎发育的不正常，最终导 致胚胎在早期便死亡，宏观上表现为情期配种受胎率和年受胎率分别降低12.3％ 和6.4％，产仔间隔长达97.6天(黄右军，尚江华，梁梦玫，张秀芳，黄芬香.河 流型水牛与沼泽型水牛杂交后代(2n＝49)染色体遗传与繁殖力的研究.遗传， 2003，25(2)：155-159)。若通过核型水平对水牛进行选择，那么对杂交水牛 群的整体繁殖能力将有显著的提升，辨别杂交水牛核型数也显得非常重要。

传统鉴定核型的方法是采用取外周血淋巴细胞培养一段时间后，加入秋水 仙素使细胞分裂停留在中期，再低渗固定，制作滴片，通过染色体照片的对比 分析对染色体数目进行分组，观测和描述组内各染色体形态和特征，进而确定 其染色体组型并阐明生物的染色体组成。但是该方法较为繁琐，周期长，费时 费力，成本也不低，检测大群体杂交水牛便非常麻烦，不符合现代化大规模养 殖的发展方向。然而快速检测杂交水牛核型的方法依旧没有相关文献证明已经 正在研究或者研究出来，甚至连这方面的探索也没有文献资料可供查询。哺乳 动物中，亚种间由于长时间的地理和生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变 和演化。在水牛的亚种杂交中，不同核型的杂交水牛在特定染色体上的基因会 有所区别，这些区别会体现在碱基序列上。因此本研究依据分子标记的应用和 杂交水牛核型分析，将二者联系起来，建立利用分子标记快速检测杂交水牛核 型的方法，该方法尚无相关文献发表或说明，属于创新型研究，可快速方便大 规模检测杂交水牛的核型，改良群体结构，从而提高繁殖和泌乳性能，加快杂 交水牛的品种改良速度。

分子标记技术应用非常广泛，尤其在亚种的鉴别上，亚种间由于长时间的 地理和生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变和演化通过分子标记便可找出 这些差异，加以辨别。敖光辉等人利用SSR对籼粳稻亚种之间进行标记差异， 发现差异明显(敖光辉，王丽，魏琴，周黎军.釉粳稻亚种间分子标记差异分 析.安徽农业科学，2008，36(5):1778-1780)；张晓璐利用分子标记在虎亚种 识别中达到极高的准确率(张晓璐.虎亚种识别的分子遗传学技术的研究.[硕 士学位].哈尔滨：东北林业大学图书馆，2005)，可见分子标记在鉴别亚种方面 是非常方便准确，具有极大的优势。不同核型的杂交水牛在特定染色体(河流 型4和9号染色体，沼泽型1号染色体)的数量上有所区别，2n＝48核型的水牛 拥有两条沼泽型1号染色体，无河流型4和9号染色体；2n＝49核型的水牛拥有 一条沼泽型1号染色体，河流型4和9号染色体个一条；2n＝50核型的水牛无沼 泽型1号染色体，拥有两条河流型4和9号染色体。这些区别会导致位于这些 染色体上的基因序列，在不同核型杂交水牛上会有差异，利用分子标记方法， 可以找到不同核型之间基因序列的稳定性差异，从而辨别核型。经过大量的文 献查找，有如下基因位于以上3条染色体中：ACO2、ACTA1、CSF1R、CSF2、 CGN1、GAPDH、GLI、IFNG、IGF1、RBP3、LDHB、LYZ、TPI1、LDLR、 EEF2。其中，后两个在河流型水牛9号染色体上(Iannuzzi L，Cnriabbam，Via  A.A genetic physical map in river Buffalo(Bubalus bubalis，2n＝50).Caryologia， 1998，5:311-318；Nahas SE，Hondt HA，Soussa SF，Ghor AE，Hanssan AA. Assignment of new loci to river Buffalo chromosomes confirms the Nature of  chromosomes4and5.J.Anim.Breed.Genet，1999，116:21-28)。通过大量的试 验最终从RBP3基因上找到符合条件的突变位点，可以较为准确快速地辨别不同 核型的杂交水牛。

发明内容

本发明的目的在于建立一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的新方法。

通过优化外周血淋巴细胞培养方法获得杂交水牛的染色体数目，选取定位 于沼泽型水牛1号染色体上的RBP3基因进行扩增测序，找到特异性突变位点， 与染色体数目进行对比，通过凝胶的条带的区别来鉴别染色体数量的多少。

以黄牛的DNA为模板设计引物，得到可辨别核型的水牛RBP3基因的两个 突变位点，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。 RBP3-1的365bp处有一个A365-T365的碱基突变；在RBP3-2的442bp处有一 个G442-A442的碱基突变，两者可以辨别杂交水牛的三种核型。

设计了可以辨别核型的RBP3基因的两段DNA片段的引物对，所述的 RBP3-1引物对的正向引物为5’-GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3’(SEQ ID  NO：3)，反向引物为5’-TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3(SEQ ID NO： 4)；所述的RBP3-2引物对的正向引物为5’- AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3’(SEQ ID NO：5)，反向引物为5’- AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3’(SEQ ID NO：6)。

一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，包括以下步骤：

1)提取杂交水牛的总DNA；

2)根据水牛RBP3基因的两个突变位点的核苷酸序列，设计两组引物对 ——RBP3-1引物对和RBP3-2引物对，其中：

RBP3-1的正向引物为5’-GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3’，

RBP3-1的反向引物为5’-TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3’；

RBP3-2的正向引物为5’-AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3’，

RBP3-2的反向引物为5’-AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3’；

3)分别用步骤2)中的两组引物对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到 两种扩增产物；

4)分别对步骤3)所得到的两种扩增产物进行酶切、分型：RBP3-1引物对 的扩增产物选用Ecil内切酶，酶切条带中出现2条带确认为2N＝50核型；RBP3-2 引物对的扩增产物选用Drdl内切酶，酶切条带中出现1条带确认为2N＝48核型， 酶切条带中出现3条带确认为2N＝49核型。

步骤3)中的PCR扩增体系为：双蒸水8μL、Mix10μL、正向引物0.5μL、 反向引物0.5μL、杂交水牛DNA1μL。

步骤4)中所述的酶切，是将两种扩增产物5μL分别与双蒸水3.5μL、 10×Buffer1μL、10U/μL的内切酶0.5μL混匀后离心，37℃培养箱放置2-4h。

本发明的效果是：本发明可以快速、准确地鉴别杂交水牛染色体核型数， 可以作为杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

图1：是本发明的技术流程示意图。

图2：是水牛RBP3基因一个片段RBP3-1的DNA序列、突变位点及引物。

图3：是水牛RBP3基因另一个片段RBP3-2的DNA序列、突变位点及引 物。

图4：是RBP3-1的365bp处A365-T365的碱基突变。

图5：是三种核型的RBP3-1酶切电泳图谱。

图6：是RBP3-2的442bp处G442-A442的碱基突变。

图7：是三种核型的RBP3-2酶切电泳图谱。

图8：是2N＝48杂交水牛染色体核型。

图9：是2N＝49杂交水牛染色体核型。

图10：是2N＝50杂交水牛染色体核型。

具体实施方式

实施例1

(一)RBP3基因两段DNA序列PCR扩增

1.引物设计

用黄牛RBP3基因作模板序列，设计引物对，根据SEQ ID NO：1所述RBP3-1 的正向引物为5’-GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3’，反向引物为 5’-TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3；根据SEQ ID NO：2所述RBP3-2的 正向引物为5’-AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3’，反向引物为5’- AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3’。用普通PCR方法扩增杂交水牛 RBP3基因的两段DNA片段，PCR产物纯化和测序，通过序列分析获得如序列 表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述的序列；在RBP3-1的365bp处有一个 A365-T365的碱基突变；在RBP3-2的442bp处有一个G442-A442的碱基突变。 可辨别杂交水牛的不同核型。

2.PCR产物的纯化和测序

PCR扩增：

1)SEQ ID NO:1

20μL体系：双蒸水8μL、Mix10μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、杂 交水牛DNA1μL。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，55.2℃退火40s， 72℃延伸40s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃保持5min。共51个样本， PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

2)SEQ ID NO:2

20μL体系：双蒸水8μL、Mix10μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、杂 交水牛DNA1μL。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s， 72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃保持5min。共51个样本， PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。送公司测序。

(二)PCR-RFLP诊断方法建立

RFLP检测：

1)SEQ ID NO:1

10μL酶切体系：双蒸水3.5μL、10×Buffer1μL、限制性内切酶Ecil0.5μL (10U/μL)、PCR产物5μL。将样品混匀后离心，37℃培养箱放置2-4h。2％琼脂 糖凝胶电泳检测酶切结果。

扩增杂交水牛基因组DNA得到了1008bp左右大小的特异性扩增片段，序 列分析结果表明在365bp处存在A365-T365突变。该基因突变位点由两个等位 基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，A是形成酶切位点的等位 基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中TT型为未发生酶切的纯合型(电 泳检测时只有1008bp一条DNA带)，AA型为发生酶切的纯合型(电泳检测时 出现642bp和365bp两条DNA带)，TC为杂合型(电泳检测时出现1008bp、 642bp和365bp三条DNA带)。

2)SEQ ID NO:2

10μL酶切体系：双蒸水3.5μL、10×Buffer1μL、限制性内切酶Drdl0.5μL (10U/μL)、PCR产物5μL。将样品混匀后离心，37℃培养箱放置2-4h。2％琼脂 糖凝胶电泳检测酶切结果。

扩增杂交水牛基因组DNA得到了747bp左右大小的特异性扩增片段，序列 分析结果表明在442bp处存在G442-A442突变.该基因突变位点由两个等位基 因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因，G是形成酶切位点的等位基 因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中AA型为未发生酶切的纯合型(电 泳检测时只有747bp一条DNA带)，GG型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出 442bp和305bp两条DNA带)，AG为杂合型(电泳检测时出现747bp、442bp 和305bp三条DNA带)。

水牛RBP3基因的两个突变位点可以辨别杂交水牛的核型，对51头杂交水 牛进行酶切分型，核型数由传统的核型分析方法所得，得到的数据如下：

表1不同核型的酶切条带统计(个体数)

^*表示差异显著，^**表示差异极显著

不同核型的酶切条带差异比较大，2个酶切位点的卡方检验均极显著，说明 不同核型之间的酶切条带是显著不同的，酶切条带是可以作为辨别不同核型的 依据。

RBP3-1的酶切条带中，核型数为48的杂交水牛没有被酶切，但是1条酶 切条带中2n＝48核型得比例只占52.94％；2条酶切条带中2n＝50核型比例达 90.91％，但无法做到100％准确。

RBP3-2的酶切条带中，只有核型数为48的杂交水牛没有被酶切，1条酶切 条带全为2n＝48核型，比例100％；2条酶切条带中2n＝48核型比例65％；3条 酶切条带全为2n＝49核型，比例100％。因此，酶切条带为1条和3条的个体可 以确定为核型数为2n＝48和2n＝49的杂交水牛。

综上，可依据RBP3-1的酶切条带(条带为2的是2n＝50核型)辨别2n＝50 核型的水牛，依据RBP3-2的酶切条带辨别核型2n＝48的杂交水牛(条带为1)， 2n＝49核型的杂交水牛(条带为3)，从而辨别三种核型。