一种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应用

摘要

本发明公开了一种嗜热酯酶及其在降解PAEs（邻苯二甲酸酯）中的用途。该酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在含水介质中，在该酯酶或其融合蛋白的催化下，邻苯二甲酸酯进行水解反应，形成邻苯二甲单酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。本发明的酯酶能够将塑化剂初步降解。该酶对中低浓度的变性剂和有机溶剂具有一定抗性，热稳定性优越，并且显示了对多种PAEs底物的降解功能，该酶是文献中报道的唯一一个从嗜热微生物中克隆得到的，其优良的性能使其在PAEs的纯酶法降解中有着良好的应用前景。本发明无害化降解PAEs，降解反应稳定性好，反应条件粗放，反应速度快。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种嗜热酯酶及其在降解 PAEs中的应用。

背景技术

各种各样的化学合成物质在人类的生活中起着至关重要的作用，它们改 善了人们的生活，推动了人类社会文明的发展。但同时它们也污染了我们的 地球，给我们的生存环境带来了极大的压力。还有一些化合物，它们对于环 境的危害是经过多年的科学实验才验证的，此时，其在自然界中的蓄积范围 和蓄积量已经达到了严重的地步。邻苯二甲酸酯（PAEs）类又称酞酸酯类， 是大约30种化合物的总称，在生活中广泛使用，主要作为塑料制品的塑化 剂，它在很低浓度时即具有生殖毒性，且它进入环境后，不易迅速降解，可 在环境中蓄积和通过生物链富集，PAEs已成为全球最普遍的污染物之一。

目前一致认为，PAEs降解最有效的途径是微生物介导的生物降解，围 绕PAEs的生物降解性研究主要应集中在三个方面：一是研究不同生物的降 解代谢途径，二是分子机制的研究，关注负责催化反应的酶系、相关基因或 操纵子结构。三是筛选适合和驯化的特异菌种及适宜的生物酶。

酯水解酶在PAEs的无害化降解中起着重要的作用，有一些具有初步催 化功能的微生物被分离出来，但负责相关反应的酶却仅有数个得到表征。这 些酶都是从生态环境单一的中温微生物中分离得到的，稳定性差，实际应用 价值不大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种邻苯二甲酸酯的生物酶降解法， 该方法可以快速降解邻苯二甲酸酯，并且反应条件粗放，可以在高温下进行， 在酶变性剂、有机溶剂、金属离子等污染物的存在下，邻苯二甲酸酯还是可 以快速的彻底降解。

本发明人发现了一种可以快速彻底降解邻苯二甲酸酯的酯酶，并且该酯 酶热稳定性高，对酶变性剂、有机溶剂、金属离子耐受性好，催化活性高， 从而可以将邻苯二甲酸酯快速彻底降解成邻苯二甲酸和相应的醇。

本发明的技术方案之一是：一种分离的酯酶，其特征在于，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的技术方案之二是：一种酯酶融合蛋白，其特征在于，所述的酯 酶融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酯酶添加一肽段后的融合 蛋白，所述的肽段是表达亲和层析标签His-tag。

本发明的技术方案之三是：一种分离的编码所述的酯酶的核酸，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的技术方案之四是：一种包含所述的核酸的重组表达载体。

本发明的技术方案之五是：一种重组表达转化体，其特征在于，该重组 转化体包含所述的重组表达载体。

本发明的技术方案之六是：一种邻苯二甲酸酯的生物酶降解法，其特征 在于，包括以下步骤，在含水介质中，在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的 酯酶或其融合蛋白的催化下，邻苯二甲酸酯进行水解反应，形成邻苯二甲单 酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。

本发明中，所述的酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其是来源于 嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）的酯酶。

本发明中，所述的酯酶可以从嗜酸硫化芽孢杆菌中分离获得，也可以从 重组表达该酯酶的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。

本发明中，较佳的，所述的酯酶由包括以下步骤的方法制备而得：培养 含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酯酶的核酸的表达载体的大肠 杆菌，从发酵液中得到重组酯酶。

本发明中，所述的编码编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酯酶的核 酸可以从嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No. 2所示的核酸的重组载体中或者重组表达转化提中分离获得，也可以全人工 合成获得。

本发明中，如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID  No.2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中相 应的酯酶基因序列。本发明的酯酶的编码核苷酸序列也可以是编码序列表中 SEQ ID No.2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。较佳的，所述的编 码SEQ ID No.2的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述的多聚核苷酸的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列 之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变， 但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至 用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

其中，所述的多聚核苷酸的同系物还指一种具有在标准条件下能够与嗜酸 硫化芽孢杆菌基因组中相应的酯酶基因序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序 列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行： Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(Current  Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一 个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中 进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20 的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的 溶液。杂交温度为50～70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。 清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt% SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt% SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后， 就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA 分子。

本发明所述的表达载体可通过本领域常规方法将本发明的编码氨基酸 序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所 述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒（大肠杆菌中合适载体 有pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、 pHS2、pMBL等）、粘粒（pHZ132）、噬菌体或病毒载体（反转录病毒载体， 腺病毒载体）等所述质粒代表一小部分的可能质粒，其他质粒为技术人员公 知。本发明所述重组载体较佳地采用pET28a质粒。较佳地，可通过下述方 法制得本发明的重组表达载体：将上游引物:5’- GGAATTCCATATGCCACTTGATCCGCGGGTTGAAC-3’，下游引物:5’- CCCAAGCTTTCATGGCTCTTCAAACCGGGTTCTTATA-3’，模板为嗜酸硫化芽孢杆菌基因组 进行PCR扩增所得的扩增产物和表达载体pET28a用限制性内切酶Nde I和 Hind III双酶切，形成互补的粘性末端，生成含有本发明的酯酶编码核酸片段 的重组表达载体pET28a-10332。

本发明中，所述的含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶的核 酸的表达载体的大肠杆菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主大肠 杆菌中制得。所述的大肠杆菌优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃 希氏菌(E.coli)DH5α，更优选(E.coli)BL21(DE3)。将本发明前述重组表达载 体pET28a-10332通过常规转化方法，转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本 发明优选的基因工程菌株，即表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332。

其中，所述的表达转化体由常规方法培养，较佳的培养方法包括以下步 骤：以1%的接种量将表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332接入LB发酵液 中，37℃、200rpm下培养至菌体OD₆₀₀达到0.4～0.6之间时加入终浓度为1 mM的IPTG继续在25～37℃、160～220rpm，诱导表达12h之后，即可。

本发明由发酵液中获得表达产物——氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示 的酯酶。较佳的将发酵液固液分离取湿菌体，破碎细胞后，取上清液，用表 达序列标签亲和层析分离纯化得到SEQ ID NO.1所示的酯酶。

本发明中，所述的融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶添 加一肽段后的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有酯酶活性即可。所述的添 加的一肽段可以是本领域常规的肽段，优选表达亲和层析标签（如His-tag） 或者外分泌信号肽。所述的表达亲和层析标签His-tag是本领域常规，较佳 的是6个组氨酸。

本发明中，所述的邻苯二甲酸酯是如式（Ⅰ）所示的化合物。邻苯二甲 酸酯在本发明所述的酯酶的催化作用下水解，先形成如式（Ⅱ）所示的邻苯 二甲酸单酯，再形成如式（Ⅲ）所示的邻苯二甲酸。

其中，R₁和R₂分别或同时代表C2-C10烷基，更佳的是C2-C10直链烷基， 最佳的是C2-C6直链烷基。

其中，所述含水介质为常规的水溶液，较佳的为常规的缓冲液，更佳的 为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠缓冲液或者硼酸-硼砂缓冲液，更佳 的为磷酸缓冲液；较佳地所述的含水介质还含有有机溶剂；所述的有机溶剂 优选溶解邻苯二甲酸酯的有机溶剂，如DMSO；优选地，所述有机溶剂和含 水介质的体积比为1:1000-1:9，更优选1:9。

本发明的方法中，所述的底物邻苯二甲酸酯浓度优选为1～500mmol/L。 考虑到反应的效率，底物浓度更优选10mmol/L。在反应时分批添加底物， 可以提高生产效率。反应所生成的产物可以在反应结束后分离，也可以通过 原位分离的方法不断地将产物移走。

本发明的方法中，所使用的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶或其 融合蛋白的用量较佳的为1～36000U/L，更佳的为20300U/L。

本发明的方法中，所述水解反应的反应温度可以是20-70℃，优选37- 60℃，最优选50℃。

本发明的方法中，所述水解反应的反应时间是常规，一般到反应至反应 完全为止，优选1分钟-24小时。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明从嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）基因组中克隆 基因，构建具有表达功能的质粒，导入大肠杆菌BL21中进行异源表达，通 过在表达质粒上添加标签6His，实现目标酶的快速亲和纯化和可溶性表达， 得到具有高活性的嗜热酯酶。

本发明提供一个能够将塑化剂初步降解的酯酶，并且是目前唯一一个能 够水解塑化剂酯键的嗜热酯酶。该酶对中低浓度的变性剂和有机溶剂具有一 定的抗性，热稳定性较为优越，并且显示了对多种PAEs底物的降解功能， 该酶是文献中报道的唯一一个从嗜热微生物中克隆得到的，其优良的性能使 其在PAEs的纯酶法降解中有着良好的应用前景。

本发明提供了一种PAEs无害化降解的方法，采用所述的酯酶进行生物 催化降解，降解反应稳定性好，反应条件粗放，反应速度快，实际应用价值 大。

附图说明

图1为构建重组表达载体pET28a-10332的示意图。

图2显示纯化后的pET28a-10332表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。1， 100mM洗脱液；2，上清液；3，诱导后；4，诱导前；M，Marker。

图3显示10332酯酶以DBP为底物在37℃和50℃的反应的HPLC分析。其 中图3(A)显示254nm DBP反应底物残留百分比，图3(B)显示254nm DBP 反应产物峰面积比。

图4显示10332酯酶对DEP的降解，其中是254nm反应底物残留百分比。

图5显示10332酯酶对DPrP的降解，其中是254nm反应底物残留百分比。

图6显示10332酯酶对DPeP的降解，其中是254nm反应底物残留百分比。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1嗜热酯酶基因的质粒构建

以嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）基因组为模板，以 10332-Nde I-F和10332-HindIII-R为正反向引物PCR扩增约900bp大小的 编码PAEs水解酶的10332基因片段，PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳检查将 得到的PCR产物连接到pET28a载体中再转化进大肠杆菌DH5α中，挑选多 颗白色菌落进行鉴定。通过菌体电泳筛选，提取质粒进行双酶切验证，得到 正确的含有目的基因的pET28a-10332重组质粒，并将该重组质粒转化保存 到大肠杆菌BL21(DE3)中，经测序正确，成功构建了可以异源表达目标基 因10332的重组质粒pET28a-10332及其表达转化体。重组质粒pET28-10332 的构建过程示意图见图1。

dNTP、各种限制性内切酶、LA Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶 均购自大连TaKaRa公司。细菌总DNA提取试剂盒，质粒提取试剂盒，PCR 产物纯化试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒是从天根生化科技(北京)有 限公司购买。PCR引物合成及基因测序委托上海捷瑞生物技术有限公司完成。 嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）,从德国微生物保藏中心 （DSMZ）购买所得。其他菌种和质粒见表1。

表1 菌株和质粒

1.1嗜酸硫化芽孢杆菌总基因组的获取

嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus）DSM 10332（购自DSMZ） 在刻度试管中生长5天左右，培养基有浑浊。取少量进行2代培养，在45℃， 200rpm转速下试管培养。取培养3天的菌体培养液1-5mL，10,000rpm离 心1min，尽量吸净上清，获得湿菌体。按照天根生化科技(北京)有限公司细 菌基因组DNA提取试剂盒的书进行菌体基因组提取。

1.2质粒的提取

质粒提取质是按照天根生化科技(北京)有限公司购得的质粒提取试剂盒 说明书进行。通过收集相应的培养过夜的含有质粒的大肠杆菌菌体，经过重 悬浮、裂解、洗涤、去杂蛋白、洗脱最终获得40-70μl的质粒存于洁净的EP 管中，立即用于下一步分子生物学试验操作或-80℃保存。

1.3大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态的制备

从4℃保存的LB平板上挑相应的大肠杆菌（DH5α、BL21(DE3)）单菌 落划线接种到LB平板，或直接从-80℃保存的感受态细胞划线到相对应的 LB平板，37℃培养12～16h，直至可辨别单菌落。

无菌操作台上分别挑各种平板一个单菌落接入装载5ml LB培养基的试 管中，在220rpm、37℃下预培养活化12至14h，直至菌体OD₆₀₀约为0.6。

取1ml活化好的预培养的菌液接入含100ml LB培养基三角瓶中，37℃、 220rpm培养约2h后测OD₆₀₀，至OD₆₀₀到0.5～0.6。

将装有菌液的锥形瓶置于冰浴上冷却15min。

4℃下5000rpm离心5min后去上清。

加100ml冰浴的CaCl₂溶液重悬浮菌体，反复吹打迫使菌体充分扩散。

于4℃5000rpm离心2min，弃掉上清。

加入2ml预冷的CaCl₂溶液，混合均匀匀，放置于冰浴中。

分装至已灭菌的EP管中，每管100μl，用于转化或于-80℃保存备用。

2.1引物的合成

合成表2中的二条引物，用来扩增嗜酸硫化芽孢杆菌的基因片段。该引 物的5’端为限制性内酶切位点(Nde I、Hind III)序列和3-4个保护碱基。引 物经人工合成后，配成30μM的浓度待用。

表2 试验中用到的引物

2.2PCR反应

以S.acidophilus基因组为模板，以10332-Nde I-F和10332-HindIII-R为 正反向引物，进行PCR扩增，用以扩增10332基因片段，其反应体系如表3 示。

表3 PCR反应体系

PCR扩增程序如下：

PCR扩增完成后取其产物5μl在0.8%琼脂糖上进行核酸电泳验证。电 泳结果表明扩增片段大小约为900bp，与预期的结果相符。

2.3目的条带的胶回收

在暗箱式紫外分析仪中观察核酸电泳后的琼脂糖凝胶并切下约900bp 左右长度的目的条带。

参照天根生化科技(北京)有限公司提供的胶回收试剂盒的说明书，按胶 块：溶胶液的体积比为1:5的比例向胶块中加入溶胶液，置于55-65℃溶胶 约需要10min，其间不时的摇动直至胶块完全溶解。

将胶块完全溶解后的溶解液转移到吸附柱中，室温下12000rpm离心30 秒。

向吸附柱中加500μl漂洗液，室温下12000rpm离心30s，弃掉废液。 重复此操作一次。

12000rpm下空管离心2min以完全去除漂洗液。

将吸附柱移至一个洁净的1.5mL的离心管中，向吸附柱膜中央悬空加 入适当体积（通常用30-50μL）的洗脱缓冲液或去离子水，室温放置1-2分 钟后12000rpm离心2min洗脱得到目的DNA片段。

2.4DNA的酶切与连接

按产品使用书，将胶回收的目的DNA片段和质粒pET-28a分别用限制 性内切酶Nde I、Hind III酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒 回收用于下面的连接反应，在进行连接反应前先将纯化的目的基因片段和质 粒片段同时进行凝胶电泳分析其浓度。

连接反应参照连接酶使用说明，具体反应体系如表4。其中质粒DNA 与外源DNA片段的摩尔比控制在1∶3-10，16℃连接12h以上，连接产物 用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

表4 连接反应体系

2.5利用化学转化法把连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞

从-80℃冰箱中取出一管大肠杆菌DH5α感受态细胞至于冰沙中，向EP 管中加入适量的连接反应液（1-10μl），用手轻轻弹匀后立即之余冰上冰浴 30min。

在42℃水浴热激90sec。

放置冰浴2min后向EP管中加入300μl无抗性的LB培养基后置于 37℃、220rpm的摇床培养45min。

离心去掉200μl上清后混匀之后取适量体积的转化菌均匀涂布到含有 50μg/ml卡那霉素的LB平板上。

将平板置于37℃恒温箱培养12h后筛选阳性转化子。

2.6菌体电泳

挑选10-20颗白色菌落置于含有50μg/ml卡那霉素的抗性300μl的LB 液体培养中，37℃，220rpm培养6-12h后，取其中150μl菌液离心取上清。

将菌体裂解后进行核酸电泳，以空载质粒作为对照组，筛选出滞后条带 对应的菌株进行进一步培养提取质粒，进行酶切验证。

2.7双酶切验证和PCR验证

用引物上含有的两个限制性内切酶酶切位点的酶Nde I、Hind III酶切通 过菌体电泳筛选出来的重组质粒，之后进行核酸电泳，可以看到与目标质粒 大小一致的片段，证明筛选的重组子正确。

酶切反应体系如表5。

表5 酶切反应体系

置于37℃水浴1h以上。

用之前合成的引物10332-Nde I-F和10332-BamHIII-F，以所选的重组质 粒为模板进行PCR扩增，经电泳验证得到了目标片段，验证了重组质粒的 正确性。

2.8表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332的制备

将双酶切验证和PCR验证正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)， 经测序验证正确，成功构建了可以异源表达目标基因10332的重组质粒 pET28a-10332及其表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332。

实施例3重组大肠杆菌的异源表达和分离纯化

培养表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332，通过合适的温度和合适浓度 诱导剂IPTG，使得目标蛋白得以可溶性表达，从而可大量制备获得该酶。 对诱导表达的的菌体进行超声破碎，将超声后上清液通过组氨酸标签亲和层 析分离法分离纯化得到电泳纯的带有his-tag标签的嗜热酯酶的蛋白。

1外源片段在大肠杆菌中的诱导表达

将表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332置于37℃恒温平板培养12h后， 挑一个单菌落于5ml LB（含50μg/ml卡那霉素）液体培养基中，培养8h 以后，做甘油管保种备用。取其中5μl甘油管菌液加入5ml LB液体培养基 （卡那霉素50μg/ml），活化培养过夜后，以1%的接种量转接入二级瓶， 37℃、200rpm下培养至菌体OD₆₀₀达到0.4～0.6之间时加入终浓度为1mM 的IPTG继续在25～37℃、160～220rpm，诱导表达12h之后，收集菌体，进 行蛋白表达测定以及酶活力等操作。

2大肠杆菌细胞的破碎

对表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332进行细胞破碎，具体步骤如下：

室温下8000rpm离心10min收集菌体细胞。弃上清，沉淀重悬浮于10-20 ml的冰浴预冷的磷酸盐缓冲液（1M KH₂PO₄3.85ml，加1M6.15ml的K₂HPO₄， 定容到100ml，高温高压灭菌后室温保存而得）中。

将离心管置于冰浴，用带直径5mm探头的超声波发生器裂解细胞，调 整频率和强度避免产生泡沫，同时及时更换冰防止温度过高使酶失活。

破碎之后产物于12000rpm下4℃离心10min，取上清（即粗蛋白酶液）， 弃沉淀。该上清液经0.45um滤膜过滤，得细胞破碎液，备用。

3表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

用10%的分离胶和4%的浓缩胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品中蛋白 的表达。

4重组蛋白的纯化

4.1缓冲液的配置

(1)结合液：100mM磷酸缓冲液，2M氯化钠，20mM咪唑，30% 甘油，1%triton,pH7.0。

(2)洗脱缓冲液：100mM磷酸缓冲液，2M氯化钠，50,100,200，500 mM咪唑，pH7.4。

4.2His-tag柱的分离

Ni分离柱(GE Health Histrap crude FF)预装柱,柱床体积为1ml。

用结合液平衡2～5个柱床体积，流速控制在2ml/min。

将细胞破碎液0.45μM无机滤膜过滤，上样，流速控制在1ml/min。

用结合液再洗2～5个柱床体积，流速为2ml/min。

分别用不同梯度的咪唑的缓冲液（即洗脱缓冲液）进行阶段洗脱，流速 为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-page检测融合蛋白的分子量大小 和纯度。

结果

从表达转化体BL21(DE3)/pET28–10332菌体破碎的上清液的聚丙烯酰 胺凝胶电泳图（见图2）可以看出，经过IPTG诱导，在35KD左右处有明 显过表达的条带，该条带大小与10332酯酶预测大小接近。且该蛋白大多以 可溶性形式表达在超声上清中。在常规的表达宿主的表达温度和诱导剂 IPTG的浓度中，对于BL21(DE3)/pET28–10332的重组的目标蛋白均可溶性 目标蛋白进行表达。

在His-tag柱的分离的对比试验中，结合液中只有缓冲液和10mM的咪 唑，蛋白的纯化效果较差，杂蛋白的含量高。在本发明中，在结合液中加入 降低疏水作用的甘油、Triton、NaCl，并把咪唑的浓度提高到20mM，即一 步即可纯化至电泳纯，纯化效率极高。经电泳及测活，该蛋白在100mM咪 唑浓度可以被全部洗脱下来，得到电泳纯级别的表达产物。因此，本发明成 功构建重组表达编码嗜热酯酶的表达系统，及通过组氨酸标签亲和层析分离 法分离纯化得到了带有his-tag标签的嗜热酯酶的纯化蛋白。

实施例4重组大肠杆菌表达产物的酶学性质以及底物谱

对所得到的粗蛋白酶液和纯化蛋白进行蛋白浓度检测和酶活检测，该酶 比活很高，最高达到2600U/mg。采用不同链长的pNP酯，测量该酶对于不 同底物的反应效率，得到该酶的反应底物谱及该酶对pNP酯的最佳底物。检 测该酶对热、变性剂、有机溶剂和金属离子的耐受性，该酶具有良好的热稳 定性，对低浓度尿素和吐温有较高的耐受性，对有机溶剂和金属离子具普遍 的耐受性。行氨基酸比对分析以及保守序列分析，该酶与其他酶的最高相似 度仅为52%，确定为新酶。

1蛋白浓度的测定

考马斯亮兰法检测样品的蛋白质含量。

2酶活检测的

该酯酶的检测是根据通用底物对硝基苯酚丁酸酯（PNPB）与酶反应过 程中的PNPB颜色的改变，从而通过实时监控的分光光度计的数值来确定酶 活的大小。

检测体系3ml，包括以下溶液：

2.87mL K₂HPO₄-KH₂PO₄(100mM,pH7.0)；

30μL PNPB母液；

100μL酶液。

检测波长405nm，温度50℃。先加入缓冲液和底物保温2min，再加入 酶液。每隔10s记录一个A₄₀₅值，记录时长为1min。1min内吸光值的变化 大于1.2，最佳范围在0.4-0.8之间，可适当稀释酶液。

计算酶活的动力学参数时所用到的方程如下：

酶活U/mL=(ΔAbs₄₀₅/t)·2.24×10⁵

3反应底物谱

采用不同链长的pNP酯，分别是C2，C3，C4，C5，C8，C10，C12， C14，C16测量该酶对于不同底物的反应效率，以探明该酶对pNP酯的最佳 底物。测活方法利用1-100μL的纯化后的嗜热酯酶与PNP酯在1min内的反 应，通过分光光度计测量其在A405nm的吸光度。

4热稳定性检测

将纯化得到的酯酶分别放置在50℃水浴器中，间隔5小时取酶液进行与 PNPB进行反应，对照组采用在室温下放置的同批次纯化的酶液，进行分光 光度计的测量；同时用该批次纯化的酶液保温在70℃恒温箱中，间隔约1 分钟取酶液与PNPB进行反应，测定其稳定时分光光度计的数值。

5变性剂对酶活的影响

将纯化得到的酶，分别与不同浓度的变性剂、有机溶剂以及金属离子溶 液混合，再与PNPB进行反应，测定其分光光度计的数值，与对照组进行比 对，得到酶活百分比。

结果

（1）蛋白浓度与酶活

100mM为最适洗脱液，在此条件下所得的酶活为203U/ml，比活为 2600U/mg，活力回收为54.6%。可见是得到的是具有高活性的酯酶。

（2）反应底物谱

通过与对硝基苯酚不同碳原子数酯化的PNP酯反应，来确定底物谱范 围，如表6所示。通过活力百分比的比较，该酶与对硝基苯酚丁酸酯（PNPB） 的反应活性最高，对于长链底物反应活性较低，该特征与典型酯酶的特征相 似，对低链长的底物反应活性高，高链长活性低，而脂肪酶相反。

表6 PNP酯化的酸的碳链长度与活性的变化

（3）热稳定性

该酶在50℃和70℃的高温情况下保存后，检测该酶与PNPB的反应活 性，结果如下表7、8所示。可知，该酶50℃保温20小时，仍具有对PNPB 的50%活性，且70℃保温6分钟，该酶仍具有对PNPB的活性。表明其在 50℃具有良好的热稳定性。

表7 50℃热稳定性数据

表8 70℃热稳定性数据

（4）不同变性剂对酶活的影响

将该酶在与不同变性剂、有机溶剂、金属离子溶液混合，测定其对PNPB 的反应活性，如下表9、10、11所示。通过比较，该酶对于低浓度的尿素和 吐温有较高的耐受性，而对于有机溶剂和金属离子溶液则具有普遍地耐受性。 从表中还发现，2M，4M的尿素以及较低浓度的吐温对酶活有提高作用。 表9 不同变性剂对酶活的影响

表10 不同有机溶剂对酶活的影响

表11 不同有机溶剂对酶活的影响

（5）氨基酸序列比对

从S.acidophilus的基因可以看出，10332酯酶的序列和Nocardia  cyriacigeorgica,Pyrobaculum oguniense,Sulfolobus acidocaldarius,Sulfolobus  solfataricus相比，相似度分别为52%,42%,39%和37%。说明这些酶属于 同一个家族，BLAST的最大相似度为52%，说明该酶属于未发现的新酶。

实施例5重组10332酯酶对PAEs不同底物的降解

采用10332酯酶纯酶对邻苯二甲酸酯的不同底物进行降解，发现10332 酯酶对2C-6C直链PAEs底物均具有降解功能，3C，4C直链PAEs底物在 4h左右全部被降解，5C和2C直链PAEs底物在24h内全部降解。并且，0332 酯酶对邻苯二甲酸酯在50℃的降解效果好于37℃的降解效果。

1.与PAEs的反应分析

将不同的PAEs配制成100mM的母液，溶解在DMSO中，取100μl加 入到900μl磷酸缓冲液中（pH7.0），加入纯化酯酶36U/ml，在不同温度下进 行反应，定时取样，用乙酸乙酯进行萃取，分层后吸取上清，并过滤后分别 利用TLC和HPLC测定产物的减少。

所用的PAEs如表12。

表12 PAEs

2.TLC分析

流动性配比为石油醚：乙酸乙酯：乙酸（10:1：0.1），层析后，在紫外 灯下检测底物和产物。

3.HPLC分析

流动性为甲醇-水（90:1-80:1），不同底物流动相略有不同，检测波长 254nm，柱温40度。所使用的是Prominence UV/VIS DETECTOR SPD-20A。 4.GC-MS

为了检测产物的生成，采用安捷伦5973N GC–MS，装配HP6890GC和 HP7683B自动进样器。柱温控制如下：初始80℃，保持1min，以7°C/min 上升到280°C，进样口温度280°C，氦气作为载气。以HP化学工作站分析。

结果

纯化后的酶首先与塑化剂DBP进行反应，测的其TLC与HPLC的数据， 判断其催化效率。

通过TLC分析可见，该酯酶具有降解DBP的能力，且在反应开始3h 后完全降解DBP生成单酯MBP（邻苯二甲酸单丁酯）（以MBP标准品为对 照）。

利用HPLC，流动性为甲醇-水（85:15），对DBP标样进行分析，DBP 出峰时间为6.4min，反应之后在2.2min出现一产物峰，该峰与MBP标样出 峰时间一致，可以认定10332酯酶对DBP降解生产了邻苯二甲酸单丁酯。 将反应后的产物进行甲酯化，在GC-MS上分析，邻苯二甲酸单丁酯的羧酸 基团被甲酯化，进一步表明DBP的降解产物为MBP。

为了检测10332酯酶对于DBP的降解速率，在不同时间点取样，经过萃 取过滤后在HPLC上分析，以初始峰面积为100，以不同时间的峰面积百分率 表示降解速率。从结果可见，10332酯酶在3h，37℃内将所有的DBP降解。 将反应温度提高到50℃时，2h内将所有DBP降解完全，完全反应时间缩短了 1h（如图3A）。产物的生成曲线与底物的降解曲线形成正相关关系（如图3B）。

为了验证该酯酶对其它PAEs底物是否有反应，使用DMP，DEP、DPrP、 DPeP和DCHP作为底物进行反应，且在37℃和50℃分别进行反应，用HPLC 的方法进行分析，各个底物降解速率如图4-6所示，其余结果如表13所示。 可见，10332酯酶对几种直链PAEs具有良好的降解功能。DBP，DPrP，DPeP 37℃时分别在3h，5h，5h完成全部降解，DEP完全降解需要48h；当反应温 度提高到50℃时，反应速度大为提高，DBP，DPrP，DPeP和DEP完全降解所 需要的时间分别为2h，4h，1h和24h。DBP，DPrP，DPeP三种底物的初始反 应速度较快（如表13所示），其中邻苯二甲酸二戊酯初始反应最快。反应两 分钟，底物减少就超过了50%。DEP反应最慢。

表13 几种直链PAEs初始反应速率比较

以六碳侧链的邻苯二甲酸二己酯为底物时，在24h内也检测到底物完全 降解。另外，10332酯酶对DMP和DCHP无反应，这说明侧链基团过大或过 小均会影响其降解。

10332酯酶在高温下对几种PAEs优良的降解性能使其能够用于PAEs工 业化酶法降解。