使用标记化学和LC-MSMS工作流分析具有酚系OH的雌二醇和分析物

摘要

本发明描述一种使用季氨氧基库克森QAOC试剂对包含酚系OH的样品，如包含酚系OH的类固醇进行质谱分析的方法。所述QAOC试剂可以改进酚系OH样品的电离和分裂特性，其进而可以改进定量和鉴别。所述方法可以包括用所述QAOC试剂衍生化所述酚系OH样品以产生加合物和使用质谱法来分析所述加合物。所述样品的衍生化可以为单步反应，其中所述QAOC试剂包含氨氧基MS标记，或可以为多步反应，其中通过使基于羰基取代的PTAD的试剂与所述样品反应，接着与氨氧基MS标记组合来形成所述加合物。也可以在使样品与所述试剂反应之前对所述样品进行富集。所述方法也可以允许多路复用。

说明书

相关美国申请

本申请要求美国临时申请序列号61/588902的优先权，其全部传授内容以引用的方 式并入本文中。

技术领域

本发明传授内容涉及质谱和适用于质谱的标记试剂的领域。

背景技术

标记化学大体上用于改进质谱信号。

使用水性烯型反应以使用试剂4-苯基-3H-1，2，4-三唑-3，5(4H)-二酮(通常被称为 PTAD或库克森试剂(Cookson Reagent))衍生酪氨酸的共轭可以提供对于合成双特异性抗 体尤其适用的共轭物(Hitoshi Ban，吉里亚加夫里柳克(Jilia Gavrilyuk)，卡洛斯F.巴巴斯 (Carlos F.Barbas)，美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)2010，132，1523-1525)。PTAD也 已用于与化合物的维生素D类共轭以用于质谱分析(岛田一兵(Kazutake Shimada)，大江 友之(Tomoyuki Oe)，水口辰人(Tatsuhito Mizuguchi)，分析家(Analyst)，1991，116， 1393-1397)。

开发季氨基氧基库克森(Cookson)(“QAOC”)，一种与PTAD具有相同反应核心的 试剂以用于分析如美国公开专利申请2011/0212534(其以全文引用的方式并入本文中)中 所述的维生素D3代谢物。发现此试剂与维生素D3的共轭二烯官能团反应以对于维生 素D3的质谱(MS)分析提供改进的电离和分裂特性。

精确分析和定量激素和其它含有酚系OH的化合物变得越来越重要。举例来说，雌 激素和雌激素类化合物经由激素取代疗法在现今的社会中正发挥越来越多的作用。并 且，分析和定量雌激素和雌激素类化合物帮助处理雌激素相关的疾病，如乳癌。

但是，仍需要对于含有酚系OH的化合物，如类固醇或雌激素进行改进质谱分析的 标记。通常难以通过质谱来分析这些化合物，所述化合物可以包括激素，如雌二醇。举 例来说，这些化合物中的许多不含可电离基团。因此，可能难以定量生物基质中的这些 分子，例如雌二醇，尤其在低浓度下。

尽管如五氟苄基溴和丹磺酰氯的试剂常用于使用质谱以进行雌二醇分析的衍生化 策略中，但包含利用含有酚系OH的分析物的所述衍生作用的LC/MSMS的当前策略未 能达到临床分析所需的检测限(岛田(Shimada)等人，分析家(Analyst)，116，1393-1397 (1991)；东谚(Higashi)等人，化学与药学公报(Chem.Pharm.Bull.)54(11)，1479-1485 (2006))。需要一种克服这些缺点的定量这些分析物的方法。

发明内容

根据各种实施例，本发明传授内容提供定量具有一个或一个以上酚系OH部分和其 代谢物的化合物(在本文中统称为酚系OH分析物)的方法。

根据各种实施例，公开一种用于对酚系OH分析物进行质谱分析的方法，其可包含 用QAOC试剂标记分析物以产生加合物和使用质谱(MS)来分析加合物。在一些实施例 中，可以使用LC-MSMS来鉴别和定量加合物。在一些实施例中，可以使用LC-MSMS 和多重反应监测(MRM)工作流来分析加合物。在一些实施例中，加合物可以在反相管柱 上具有相异保留时间和相异质量。在一些实施例中，在高能碰撞下，可以产生报告子基 团。在一些实施例中，对于各报告子基团检测的强度或峰面积不仅可以用于鉴别，而且 可以用于定量。根据各种实施例，所述方法也可以包含样品富集，例如在用QAOC试剂 标记分析物之前。

在一些实施例中，可以使用母离子-子离子跃迁监测(PDITM)，例如使用三重四极 MS平台来分析加合物。

在一些实施例中，可以使用质谱同时分析已经用QAOC试剂标记的具有酚系OH基 团的多种不同分析物。举例来说，不同QAOC试剂可以用于标记不同分析物，并且可以 使用质谱，例如LC-MSMS来分析标记的分析物。在一些实施例中，QAOC试剂含有一 个或一个以上同位素标记的原子。

根据各种实施例，酚系OH分析物可以为类固醇和雌激素。举例来说，酚系OH分 析物可以为雌激素化合物，如雌酮(E1)、雌酮硫酸盐(E1s)、17α-雌二醇(E2a)、17β-雌二 醇(E2b)、雌二醇硫酸盐(E2s)、马烯雌酮(EQ)、17α-二氢马烯雌酮(EQa)、17β-二氢马烯 雌酮(EQa)、马萘雌酮(EN)、17α-二氢马萘雌酮(ENa)、17β-二氢马萘雌酮(ENb)、Δ8，9- 脱氢雌酮(dE1)、Δ8，9-脱氢雌酮硫酸盐(dE1s)雌三醇、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16，17- 表雌三醇。

在一些实施例中，基于羰基取代的苯基-3H-1，2，4-三唑-3，5(4H)-二酮(羰基-PTAD)的 试剂可以在标记酚系OH分析物之前偶合于氨氧基标记剂(此方法在本文中被称作单步 标记反应)。在其它实施例中，无氨氧基标记剂的基于羰基取代的PTAD的试剂可以与酚 系OH分析物反应以标记分析物。标记的分析物可以随后经质量分析。或者，可以在质 量分析之前在标记的分析物的羰基部分用氨氧基标记来标记所述分析物(此方法在本文 中被称作两步标记反应)。

可以通过下式描述QAOC试剂：

其中R₁为

或其中R₁为：

R₂为环状、分支链或直链、被取代或未被取代的C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃或被取代或未被取代的芳族基；R₃不存在或为一个或一个以上相同或不同的取代 基，其为环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；卤素(例如Cl、 Br、I或F)；-NO₂；被取代或未被取代的芳族(芳基)基；受保护或未受保护的氨基、酰 基、羧基或硫醇基；-SO₃H、-PO₄^-、硫醚、醚、环氧化物、环硫化物、叠氮化物或氮丙 啶；

每一R₄独立地为H或环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；

m为1与20之间的整数；

X为阴离子；

L1和L2独立地为键或连接基团；并且

Ar为键、芳基或杂芳基。

在一些实施例中，Ar为芳基。在一些实施例中，Ar为苯基或萘基。在一些实施例 中，L1和L2独立地为键、肽、寡聚物、PEG、C₁-C₂₀亚烷基链、C₁-C₆亚烷基链或C₂-C₄亚烷基链。在一些实施例中，X为全氟羧酸盐。在一些实施例中，X为CF₃COO-、 CF₃CF₂COO-、CF₃CF₂CF₂COO-、CF₃SO₃COO或(C₆H₅)₄B-。

在一些实施例中，可以通过下式描述QAOC试剂：

在一些实施例中，QAOC试剂可以包含氨氧基标记剂，举例来说，用于单步标记反 应的QAOC试剂可以具有以上结构，其中L2为C₁-C₂₀亚烷基。

在一些实施例中，在任一以上结构中，R₂为甲基或乙基。在一些实施例中，R₃不存 在。在一些实施例中，R₄为甲基。在一些实施例中，m为1与6之间的整数或1与3之 间的整数。在一些实施例中，n为1与10之间的整数、1与5之间的整数或2与4之间 的整数。在一些实施例中，X为全氟羧酸盐。在一些实施例中，X为CF₃COO-、 CF₃CF₂COO-、CF₃CF₂CF₂COO-、CF₃SO₃COO或(C₆H₅)₄B-。

在一些实施例中，QAOC试剂为以下化合物：

在其它方面中，公开一种用于鉴别和定量样品中的一或多种酚系OH分析物的方法， 其包含用QAOC试剂处理样品以标记样品中的一个或一个以上酚系OH分析物(若存 在)。随后可以通过质谱来分析处理的样品以鉴别和定量一或多种酚系OH分析物。举例 来说，处理的样品可以经受LC-MSMS分析以鉴别和定量一或多种酚系OH分析物。

在一些实施例中，样品为生物样品，如血液、血浆、血清、尿液或唾液。此外，在 一些实施例中，酚系OH分析物为类固醇或雌激素，例如雌酮(E1)、雌酮硫酸盐(E1s)、 17α-雌二醇(E2a)、17β-雌二醇(E2b)、雌二醇硫酸盐(E2s)、马烯雌酮(EQ)、17α-二氢马烯 雌酮(EQa)、17β-二氢马烯雌酮(EQb)、马萘雌酮(EN)、17α-二氢马萘雌酮(ENa)、17β-二 氢马萘雌酮(ENb)、Δ8，9-脱氢雌酮(dE1)、Δ8，9-脱氢雌酮硫酸盐(dE1s)雌三醇、16-表雌三 醇、17-表雌三醇和16，17-表雌三醇。

在以上方法中的一些实施例中，酚系OH分析物为类固醇，并且所述方法进一步包 含：通过用已知量的一或多种酚系OH内标和一或多种具有已知增量浓度的酚系OH分 析物对已知量的酚系OH分析物耗尽的生物样品进行加标来产生一组校准基质；用 QAOC试剂处理从步骤(a)获得的样品以标记至少一个酚系OH分析物和对应内标；使用 LC-MSMS分析步骤(b)的校准基质；使用从步骤(c)的分析获得的数据产生校准曲线；用 已知量的一或多种酚系OH内标对样品中的酚系OH分析物进行加标；和使用所述校准 曲线来评估可以为样品中的类固醇的所述至少一种酚系OH分析物的量。在一些实施例 中，所述方法可以进一步包含进行样品制备以富集或清理校准基质中的酚系OH分析物 和一或多种酚系OH内标的步骤。

在一些实施例中，在以上方法中，用QAOC试剂处理包含已知浓度的分析物(所述 分析物包含酚系OH，如包含酚系OH的类固醇分析物)的内标或外标以标记标准物中的 至少一种酚系OH分析物从而产生酚系QAOC标准物。随后可以例如通过液相色谱(LC)/ 质谱(MS)来分析标准物和分析物。其可以作为混合物来分析或分别进行分析。可以从获 自分析酚系QAOC标准物的数据产生校准曲线并且可以估计所述至少一种酚系OH分析 物(例如样品中的类固醇)的量。对于标准物和分析物的混合物，可以例如使混合物经受 LC分离以在分开的时间洗脱标记的标准物加合物和标记的分析物(由于在LC柱上的不 同保留时间)。随后可以通过质谱来分析每一洗脱液。举例来说，可以采用母离子-子离 子跃迁监测(PDITM)。从标记的标准物产生的报告子信号的峰面积的信号强度相对于标 记样品的所述信号强度的比可以提供样品中的标记的分析物的相对浓度。由于已知标记 的标准物加合物的浓度，可以确定样品中的标记的分析物的比浓度。

在一些实施例中，可以用QAOC试剂标记包含已知浓度的一或多种所选酚系OH分 析物的标准物以形成一或多种标准物加合物。举例来说，可以通过上文所论述的单步或 两步标记反应来产生标准物加合物。可以使用质谱来分析标准物加合物宁且随后可以将 获自此分析的数据与获自分析样品(所述样品与QAOC试剂反应以标记其酚系OH分析 物(若存在))的数据相比以确定样品的酚系OH分析物的比浓度。

在其它方面中，提供一种包含QAOC试剂和一或多种包含用QAOC试剂标记的已 知浓度的所选酚系OH分析物的标准物的试剂盒。

在其它方面中，提供一种包含QAOC试剂和一或多种包含已知浓度的所选酚系OH 分析物的标准物的试剂盒。

在一些实施例中，可以同时分析酚系OH分析物和维生素D。举例来说，可以用 QOAC试剂处理含有酚系OH分析物和维生素D的样品以标记酚系OH分析物和维生素 D。随后可以例如在LC/MSMS光谱仪的单次操作中分析标记的样品以定量酚系OH分 析物和维生素D二者。

在一些实施例中，可以提供允许多路能力的两步标记反应。举例来说，在一些实施 例中，可以用不同QAOC试剂标记不同酚系OH分析物。在其它实施例中，可以用单一 QAOC试剂标记不同酚系OH分析物并且所得加合物可以与不同氨氧基标记反应。

附图说明

参考附图，将更完全地理解本发明传授内容。所述图式预期说明而不是限制本发明 传授内容。

图1为根据本申请人的传授内容的一个实施例的QAOC试剂的一个实施例。

图2A显示可以根据本发明传授内容的各种实施例用于四重分析的一例示性组的四 种氨氧基标记剂。

图2B显示可以根据本发明传授内容的各种实施例用于四重分析的一例示性组的四 种氨氧基标记剂。

图3A显示可以根据本发明传授内容的各种实施例用于四重分析的一例示性组的四 种质量差示标记，其包含四种不同试剂。

图3B显示可以根据本发明传授内容的各种实施例用于四重分析的一例示性组的四 种质量差示标记，其包含四种不同试剂。

图4为显示雌二醇与QAOC试剂的反应的反应流程，所述反应形成两种相同质量的 异构物并且那两种异构物的分裂模式产生根据本发明传授内容的各种实施例的报告子 离子。

图5A为使用API-5500QTRP^TM质谱仪的显示于图3中的反应混合物的Q1-MS-Q1 扫描：预期M⁺＝604.35，实验值为604.2。

图5B显示雌二醇-QAOC加合物的两种异构形式的化学结构。

图6A显示图5B中显示的化合物在m/z＝604.3处和包括中性丢失片段的一些MRM 片段在m/z＝545.1处的碰撞能量扫描。

图6B显示图5A的加合物以及图6A的MRM片段的化学结构。

图7显示图4的反应混合物的LC-MRM特征曲线，其通过虚线和实线显示两种MRM 跃迁。

图8提供包含用图1的QAOC试剂标记的雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)的反 应的LC-MRM特征曲线。

参考例如以下图式，在下文中提供各种实施例的详细描述。应了解，所述图式仅是 例示性的并且所有图式参考仅是出于说明的目的，并且并不打算以任何方式限制下文所 述的实施例的范围。为方便起见，在整个图式中参考数字也可以重复(有或没有分支)来 指示类似成分或特征。

具体实施方式

应了解，为了清楚起见，以下论述将阐明本申请人的教示的实施例的各种方面，但 每当省略某些具体细节是适宜或恰当的时便省略某些具体细节。举例来说，在替代实施 例中，相似或类似特征的论述可以略微简化。众所周知的想法或概念为简洁起见也可以 不进行任何详细论述。所属领域的技术人员将认识到，一些实施例可以不需要在每个实 施方式中具体描述的细节中的某些，这些细节在本文中仅是为了提供实施例的透彻理解 而加以阐述。类似地，将显而易知可以根据公共常识，在不脱离本发明的范围的情况下， 对所述实施例稍作更改或改变。可以根据以下实例和各种实施例的描述进一步理解本申 请人的教示的各个方面，不应将所述实例和实施例理解为以任何方式限制本申请人的教 示的范围。

根据各种实施例，提供一种用QAOC试剂定量含有酚系OH的分析物(如雌激素)的 方法。在一些实施例中，所述方法可以包含样品富集、衍生化和LC-MSMS分析。样品 可以包含一或多种酚系OH分析物或其代谢物。根据各种实施例，样品可以包含多种不 同酚系OH分析物，并且标记可以包含用不同QAOC试剂标记每一分析物。

酚系OH分析物含有以下酚基：

在一些实施例中，酚系OH分析物可以为中性的。在一些实施例中，酚系OH分析 物为离子。在某些实施例中，酚系OH分析物可以具有在大约50-1000g/mol范围内的分 子量。在一些实施例中，酚系OH分析物可以具有在大约100-400g/mol范围内的分子量。 在一些实施例中，酚系OH分析物具有2、3或3个以上的酚系OH部分。

在一些实施例中，分析的样品可以含有一或多种酚系OH分析物或其代谢物。举例 来说，根据各种实施例，样品可以包含一或多种类固醇、类固醇类化合物、雌激素、雌 激素类化合物、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇(E3)、16-表 雌三醇、17-表雌三醇、和16，17-表雌三醇和/或其代谢物。在各种实施例中，代谢物可 以例如为雌三醇、16-表雌三醇(16-epiE3)、17-表雌三醇(17-epiE3)、16，17-表雌三醇 (16，17-epiE3)、16-酮雌二醇(16-ketoE2)、16α-羟雌酮(16α-OHE1)、2-甲氧雌酮(2-MeOE1)、 4-甲氧雌酮(4-MeOE1)、2-羟雌酮-3-甲醚(3-MeOE1)、2-甲氧雌二醇(2-MeOE2)、4-甲氧 雌二醇(4-MeOE2)、2-羟雌酮(2OHE1)、4-羟雌酮(4-OHE1)、2-羟雌二醇(2-OHE2)、雌酮 (E1)、雌酮硫酸盐(E1s)、17α-雌二醇(E2a)、17β-雌二醇(E2b)、雌二醇硫酸盐(E2s)、马烯 雌酮(EQ)、17α-二氢马烯雌酮(EQa)、17β-二氢马烯雌酮(EQb)、马萘雌酮(EN)、17α-二 氢马萘雌酮(ENa)、17β-二氢马萘雌酮(ENb)、Δ8，9-脱氢雌酮(dE1)、Δ8，9-脱氢雌酮硫酸 盐(dE1s)。在一些实施例中，酚系OH分析物可以为类固醇或类固醇类化合物，其具有 经sp²杂化的A-环和在A-环的3-位的OH基团。

根据各种实施例，单步标记反应可以用于标记酚系OH分析物。举例来说，所述方 法可以包含将具有以下结构中的一种的QAOC试剂与分析物的酚系OH基团反应，其中 通过下式描述QAOC试剂：

其中R₁为

或其中R₁为：

R₂为环状、分支链或直链、被取代或未被取代的C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃或被取代或未被取代的芳族基；

R₃不存在或为一或多种相同或不同的取代基，其为环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、 C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；卤素(例如Cl、Br、I或F)；-NO₂；被取代或未被取代的芳族 (芳基)基；受保护或未受保护的氨基、酰基、羧基或硫醇基；-SO₃H、-PO₄^-、硫醚、醚、 环氧化物、环硫化物、叠氮化物或氮丙啶；

每一R₄独立地为H或环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；

m为1与20之间的整数；

X为阴离子；

L1和L2独立地为键或连接基团；并且

Ar为键、芳基或杂芳基。

除非另行说明，否则术语“芳基”意味着被取代或未被取代的多元不饱和芳族烃取 代基，其可以为单环或共同稠合或共价连接的多个环(优选地1到3个环)。术语“杂芳 基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮、碳和硫原子任 选地经氧化，并且氮原子任选地经季铵化。杂芳基可以经由杂原子附接到分子的剩余部 分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2- 吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2- 苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、 5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、 2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、 5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上所指出的芳基和杂 芳基环系统中的每一者的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。“芳基”和“杂 芳基”也包涵环系统，其中一个或一个以上非芳环系统稠合或另外结合到芳基或杂芳基 系统。

术语“连接基团”或“连接剂”是指连接两个分子的双功能部分(如亚烷基链、肽、 单体、寡聚物或聚合物)。连接基团的非限制性实例为烷基链、聚乙二醇(PEG)和肽或拟 肽链。

在一些实施例中，Ar为芳基。在一些实施例中，Ar为苯基或萘基。

在一些实施例中，L1和L2独立地为键、肽、寡聚物、PEG、C₁-C₂₀亚烷基链、C₁-C₆亚烷基链或C₂-C₄亚烷基链。在一些实施例中，L1和L2独立地为键、肽、C₁-C₆亚烷基 链或C₂-C₄亚烷基链。

在一些实施例中，R₂为甲基或乙基。在一些实施例中，R₃不存在或为C₁-C₈烷基(分 支链或直链)、卤基、NO₂、氨基、酰基或羧基。在一些实施例中，R₃不存在。在一些实 施例中，每个R₄独立地为H或分支链或直链C₁-C₁₀烷基，或每个R₄独立地为H或分支 链或直链C₁-C₆烷基。在一些实施例中，每个R₄是相同的。在一些实施例中，R₄为甲基。 在一些实施例中，m为在1与6之间的整数或1与3之间的整数。在一些实施例中，X 为全氟羧酸盐。在一些实施例中，X为CF₃COO-、CF₃CF₂COO-、CF₃CF₂CF₂COO-、 CF₃SO₃COO或(C₆H₅)₄B-。

在一些实施例中，可以通过下式描述QAOC试剂：

或通过下式：

其中R₁为：

或其中R₁为：

R₂为环状、分支链或直链、被取代或未被取代的C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃或被取代或未被取代的芳族基；

R₃不存在或为一或多种相同或不同的取代基，其为环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、 C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；卤素(例如Cl、Br、I或F)；-NO₂；被取代或未被取代的芳族 (芳基)基；受保护或未受保护的氨基、酰基、羧基或硫醇基；-SO₃H、-PO₄^-、硫醚、醚、 环氧化物、环硫化物、叠氮化物或氮丙啶；

每一R₄独立地为H或环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；

m和n独立地为1与20之间的整数；

X为阴离子；

L2为键或连接基团，并且

Ar不存在、为芳基或为杂芳基。

在一些实施例中，在以上结构中，R₂为甲基或乙基。在一些实施例中，R₃不存在。 在一些实施例中，R₄为甲基。在一些实施例中，L2为键、肽、寡聚物、PEG、C₁-C₂₀亚烷基链、C₁-C₆亚烷基链或C₂-C₄亚烷基链。在一些实施例中，m为1与6之间的整数 或1与3之间的整数。在一些实施例中，n为1与10之间的整数、1与5之间的整数或 2与4之间的整数。在一些实施例中，X为全氟羧酸盐阴离子。在一些实施例中，X为 CF₃COO-、CF₃CF₂COO-、CF₃CF₂CF₂COO-、CF₃SO₃COO-或(C₆H₅)₄B-。

根据各种实施例，可以通过两步标记反应来标记酚系OH分析物，其中酚系OH基 团的芳环首先与不含氨氧基标记剂的基于羰基取代的PTAD的试剂反应以形成加合物， 并且随后用氨氧基标记剂标记加合物以形成标记的加合物。举例来说，根据各种实施例， 两步标记反应可以包括使酚系OH基团与具有以下结构的基于羰基取代的PTAD的试剂 反应：

其中R₂为环状、分支链或直链、被取代或未被取代的C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或 C₁-C₁₈炔烃或被取代或未被取代的芳族基；

R₃不存在或为一或多种相同或不同的取代基，其为环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、 C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；卤素(例如Cl、Br、I或F)；-NO₂；被取代或未被取代的芳族 (芳基)基；受保护或未受保护的氨基、酰基、甲酸或硫醇基；-SO₃H、-PO₄^-、硫醚、醚、 环氧化物、环硫化物、叠氮化物或氮丙啶；

Ar为键、芳基、或杂芳基；并且

L1为键或连接基团。

在一些实施例中，Ar为芳基。在一些实施例中，芳基为苯基或萘基。在一些实施例 中，L1为键、肽、寡聚物、PEG、C₁-C₂₀亚烷基链、C₁-C₆亚烷基链或C₂-C₄亚烷基链。 在一些实施例中，R₃不存在或为C₁-C₈烷基、C₁-C₈烯烃、C₁-C₈炔烃、卤素或-NO₂。在 一些实施例中，R₃不存在。酚系OH基团的芳环与以上基于羰基取代的PTAD的试剂的 反应可以产生含有以下子结构的加合物：

加合物随后可以与氨氧基标记，如具有以下结构的标记反应：

其中n为1到20、1-15、1到10、1到5或2到4并且R₁为季胺或取代基，其具有 以下结构：

其中每一R₄独立地为H或环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；

m为1与20之间的整数，并且X为阴离子，以形成标记的加合物。

标记的加合物具有以下子结构：

因此，根据各种实施例，两步反应包含用基于羰基取代的PTAD的试剂处理酚系 OH样品以产生加合物和使加合物氨氧基标记反应以形成标记的加合物以用于分析。在 一些实施例中，标记的加合物包含以下子结构：

图4说明雌二醇与QAOC试剂之间的例示性反应。尽管例示性反应为单步反应，但 多步反应，如两步反应也为可能的。在一些实施例中，使用单步标记反应，其中举例来 说，如图1中所说明的偶合于氨氧基MS标记的基于羰基取代的PTAD的试剂(QAOC试 剂)被用于标记酚系OH分析物。如本文所用，术语“氨氧基MS标记”可与“氨氧基标 记”互换地使用。在其它实施例中，所述方法包含首先用基于羰基取代的PTAD的试剂 处理酚系OH分析物以产生加合物，并且随后用氨氧基质谱(MS)标记剂来标记加合物以 形成标记的加合物。如本文所用，术语“氨氧基MS标记剂”可与“氨氧基标记剂”互 换地使用。可以使用质谱来分析标记的加合物。

所述方法可以进一步包含提供包含已知酚系OH分析物的标准物、用QAOC试剂处 理标准物的已知酚系OH分析物以形成标准物加合物。在各种实施例中，可以根据本发 明传授内容通过单步或两步标记反应用QAOC试剂或基于羰基取代的PTAD的试剂处理 标准物以形成标准物加合物。标准物加合物可以随后与加合物混合以形成混合物，通过 用QAOC试剂或基于羰基取代的PTAD的试剂标记酚系OH分析物，接着与氨氧基MS 标记反应来形成所述加合物。随后可以使用质谱，例如使用LC-MSMS光谱测定来分析 混合物。在一些实施例中，可以获得相对浓度的酚系OH分析物。在其它实施例中，可 以通过使用已知浓度的标准物来获得酚系OH分析物的绝对定量。

根据各种实施例，一种用于一或多种酚系OH分析物的相对定量的方法可以包含标 记一或多种分析物，接着使用质谱进行分析。根据一些实施例，可以定量一或多种酚系 OH分析物和/或其代谢物。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以包含一组同量异位标记。 根据一些实施例，在第一步中，可以用基于羰基取代的PTAD的试剂标记标准物中的至 少一种酚系OH分析物以形成标准物加合物。在第二步中，可以用来自一组同量异位标 记的第一同量异位标记来标记标准物加合物。测试样品可以与基于羰基取代的PTAD的 试剂反应以标记测试样品中的一或多种酚系OH分析物(若存在)。随后可以用来自同量 异位标记的相同组的第二同量异位标记(其不同于第一同量异位标记)来标记测试样品中 的标记的酚系OH分析物。随后可以合并标记的标准物和标记的测试样品并且可以在反 相管柱上对所得混合物进行液相色谱(LC)分离。标记的酚系OH和/或酚系OH代谢物可 以具有相异的保留时间并且可以在分开的时间从管柱洗脱。洗脱峰可以包含含有标记的 分析物的峰和含有标记的标准物的峰。随后可以使用质谱来分析来自管柱的洗脱液。

应理解可以通过与上文关于相对定量所述相同的方式来进行酚系OH分析物的绝对 定量，其中标准物具有已知浓度的酚系OH分析物。并且，当酚系OH分析物和/或酚系 OH分析物的代谢物为上文所提及的时，应理解可以使用任何酚系OH分析物。

根据各种实施例，可以用不同QAOC试剂处理包含多种不同酚系OH分析物的样品 来用所述试剂中的不同试剂来标记两种或两种以上酚系OH分析物中的每一者。随后可 以使用质谱，例如LC/MSMS来分析标记的样品以定量标记的酚系分析物。在一些实施 例中，可以在光谱仪的单一操作中进行样品的所述分析。如上所述，在一些实施例中， 酚系OH分析物可以为类固醇或类固醇类分析物。

根据各种实施例，可以通过不同方法在分析之前富集含有一或多种具有酚系OH的 化合物的样品。富集方法可以取决于样品类型，如血液(新鲜的或干燥的)、血浆、血清、 尿液或唾液。例示性富集方法可以包含(但不限于)蛋白质沉淀、液-液萃取、固-液萃取、 亲和力捕捉/释放、抗体介导的富集和超滤。可以使用其它富集方法或两种或两种以上富 集方法的组合。在下文实例1中提供例示性样品富集方法。

在一些实施例中，分析酚系OH分析物可以包含例如通过质谱仪中的高能碰撞产生 报告子离子，和利用报告子离子的强度或峰面积进行定量。举例来说，以上显示的QAOC 试剂可以在高能碰撞(MSMS)期间经历中性丢失，保留作为报告子离子的带电分析物质， 并且报告子离子随后可以经受MS³分析。在一些实施例中，QAOC试剂可以在高能碰撞 时产生标记片段，并且标记片段可以随后经受MS³分析。

根据各种实施例，多种质谱(MS)标记剂可以用于标记一或多种根据本发明传授内容 形成的酚系OH分析物和/或其加合物。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以很好地破碎 以提供强报告子离子。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以包含专门设计用于质谱的标 记剂并且根据一些实施例，氨氧基标记剂专门设计用于多重反应监测(MRM)分析。在一 些实施例中，氨氧基标记剂可以用于标记通过标记酚系OH分析物产生的加合物。在标 准物加合物用于定量酚系OH分析物的一些实施例中，氨氧基标记剂可以用于标记标准 物加合物。在各种实施例中，标准物加合物可以用于如与标准物加合物相比的分析物的 相对定量。在一些实施例中(其中已知标准物加合物的浓度)，标准物加合物可以用于分 析物的绝对定量。在一些实施例中，不同氨氧基MS标记剂可以用于标记不同分析物。 举例来说，氨氧基MS标记剂可以为不同同量异位标记或不同质量差示标记。举例来说， 用于标记标准物加合物的氨氧基MS标记剂可以包含来自一组同量异位标记的第一同量 异位标记，而用于标记来自样品的加合物的氨氧基MS标记剂可以包含来自同量异位标 记的相同组，但不同于第一同量异位标记的第二同量异位标记。

根据一些实施例，至少两个不同类别的氨氧基标记剂可以用于在高能碰撞下产生报 告子基团。可以由使用单步或两步标记反应形成QAOC试剂，所述反应使用此等氨氧基 标记剂与具有以下结构的化合物(基于羰基取代的PTAD的试剂)合饼：

R₂为环状、分支链或直链、被取代或未被取代的C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃或被取代或未被取代的芳族基；

R₃不存在或为一或多种相同或不同的取代基，其为环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、 C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃；卤素(例如Cl、Br、I或F)；-NO₂；被取代或未被取代的芳族 (芳基)基；受保护或未受保护的氨基、酰基、甲酸或硫醇基；-SO₃H、-PO₄^-、硫醚、醚、 环氧化物、环硫化物、叠氮化物或氮丙啶；

L1为键或连接基团；并且

Ar为键、芳基或杂芳基。

在下文中显示可以使用的来自第一和第二类或组的氨氧基MS标记剂的例示性化合 物。

在第一类中，氨氧基MS标记剂为：

R₁-(CH₂)_n-ONH₂，其中R₁为季胺或磷酸酯或具有如以下的结构的取代基：

其中每一R₄独立地为H或环状、分支链或直链C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈烯烃或C₁-C₁₈炔烃，m为1与20、1到15、1到10或1到5之间的整数，并且X为阴离子。

在第二类中，氨氧基MS标记剂为：

R₁-(CH₂)_n-ONH₂

其中R₁可以为(但不限于)这五种结构中的一或多种：

并且n可以为1到20、1到15、1到10或1到5。

来自第一类氨氧基MS标记剂的氨氧基MS标记剂可以在高能碰撞(MSMS)期间经历 中性丢失，保留带电分析物质作为报告子离子，可以随后对其进行MS³分析。来自第二 类氨氧基MS标记剂的氨氧基MS标记剂可以在高能碰撞时产生作为报告子离子的标记 片段。

如上所述，氨氧基MS标记剂可以与通过用基于羰基取代的PTAD的试剂标记酚系 OH分析物形成的加合物的羰基部分合并以产生标记的加合物。

根据各种实施例，对于每一类型的氨氧基MS标记剂，可以调配和使用多种同量异 位标记或质量差示标记剂。图2A和2B各自分别描绘一组同量异位4路氨氧基MS标记 剂。每一组同量异位标记剂可以具有相同化学结构和质量但可以包含同位素的不同组合 和/或定位。

在一些实施例中，可以使用三重四极MS平台进行标记的酚系OH分析物的母离子- 子离子跃迁监测(PDITM)。关于PDITM和其用途的更多细节描述于美国专利申请公开案 第US2006/0183238A1号中，所述公开案以全文引用的方式并入本文中。在如本文中所 述的标记的酚系OH分析物上进行的质谱分析的类型不受限制。在各种实施例中，可以 采用LC-MSMS。在一些实施例中，使氨氧基MS标记剂在MSMS期间经历中性丢失并 留下报告子离子，即带电分析物质。在一些实施例中，氨氧基MS标记剂在MSMS期间 形成报告子离子，其为标记片段。

在一些实施例中，一种分析根据本发明传授内容的含有酚系OH分析物的样品的方 法可以采用内标。在一些实施例中，可以通过使酚系-OH分析物与QAOC标记试剂的一 或多种同位素变体反应制得所述内标。本发明传授内容的标记化学和方法可以提供相对 于已知方法的增加的敏感度，并且在各种实施例中，可以消除对于酚系OH分析物的含 ²H、含¹³C、含¹⁵N和含¹⁸O的标准物的需要。一些酚系OH分析物的同位素标记的标准 物不是可商购的，其使得难以在无本发明传授内容的情况下对这些分析物进行绝对定 量。根据本发明传授内容，在一些实施例中，每一分析物可以具有其自身的内标。报告 子信号可以特定针对于标准物样品和测试样品。

在一些实施例中，用于标记的标准物的QAOC试剂可以包含来自一组质量差分标记 的第一质量差示标记。标记的样品可以包含来自质量差示标记的相同组，但不同于第一 质量差示标记的第二质量差示标记。随后可以使用标记的样品的质谱、LC-MSMS分析、 其组合等来分析标记的样品。根据各种实施例，定量一或多种酚系OH分析物的方法可 以包含两步化学反应以改质分析物，接着使用质谱进行质量分析。根据各种实施例，两 步化学反应可以包含首先在酚系OH分析物中用基于羰基取代的PTAD的试剂衍生酚系 OH官能团的芳环以形成加合物，并且随后用(MS)标记剂，例如氨氧基MS标记剂来标 记加合物。根据一些实施例，液相色谱-串联质谱(LC-MSMS)可以用于分析改质的分析 物。不同分析物的加合物可以具有截然不同的反相管柱上的保留时间和相异的质量，并 且可以在分开的时间从柱洗脱。可以对来自柱的洗脱液进行MSMS分析。在高能碰撞下， 可以产生报告子基团。报告子基团的强度或峰面积可以用于鉴别和/或定量。

同量异位标记允许多路复用并且提供一种用于多重分析酚系OH分析物的方法，每 样品分析具有高通量和较低成本。由于在所有酚系OH分析物中存在一个共同官能团， 在各种实施例中，每一分析物仅需要一个标记。在一些实施例中，使用PDITM增加特 异性并且减小误差风险。试剂设计使其为FlashQuant^TM应用的良好工具并且实现帮助确 认分析物身份的MS³能力。

根据各种实施例，可以使来自一组同量异位试剂的第一同量异位标记与可以包含已 知酚系OH分析物(例如在已知浓度下)的标准物接触。可以在促进第一同量异位标记与 标准物之间的反应的条件下进行接触。可以使与第一同量异位标记来自同量异位试剂的 相同组的第二同量异位标记与包含未知浓度的酚系OH分析物的样品接触。如下文中进 一步描述，标准物和样品的标记的分析物可以共同地混合并且经分析以确定样品中的分 析物浓度。分析可以包含分离混合物以形成经分离的分析物，和分析经分离的分析物。 可以使用的分离方法包括气相色谱法、液相色谱法、其它色谱法、电泳法、电渗法、质 量差示分离法等。在例示性实施例中，液相色谱用于分离混合物中的不同分析物并且因 此形成经分离的分析物。

在一些实施例中，可以在反相管柱上进行色谱分离并且可以对从管柱洗脱的峰进行 后续分析。在一些实施例中，后续分析可以包含质谱或更具体地说，母离子-子离子跃迁 监测(PDITM)。通过比较来自PDITM的结果，可以确定样品中的酚系OH分析物的浓度 (如在下文中更详细地描述)。关于PDITM和其用途的更多细节可见于公开的申请案US 2006/0183238A1中，其以全文引用的方式并入本文中。

根据一些实施例，可以使用质量差示标记剂来代替同量异位标记试剂。在图3A和 3B中描绘例示性质量差示剂对。根据各种实施例，氨氧基MS标记剂可以用于多重分析 中的相对和绝对定量。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以用于两重、三重、四重 和其它多重分析。

在一些实施例中，试剂可以与含有如美国公开专利申请案2011/0212534(以引用的方 式并入本文中)中所述的一或多种维生素D化合物以及如本文中所述的酚系OH分析物 的样品反应以对两类化合物进行多重分析。

在一些实施例中，QAOC试剂与样品以酚系OH部分的等摩尔浓度合并。在一些实 施例中，将相对于酚系OH部分过量(举例来说，大约10％、大约20％、大约两倍过量 或大约四倍过量)的QAOC试剂添加到酚系OH样品。在一些实施例中，使用小于等摩 尔浓度的QAOC，举例来说，QAOC浓度可以为酚系OH部分的摩尔浓度的大约25％、 大约50％或大约75％。在一些实施例中，QAOC试剂与样品在样品溶液中的1μg/mL-100 mg/mL之间或100μg/mL-10mg/mL之间的浓度下合并。

在一些实施例中，可以在任何三重四极仪器，例如包括具有MALDI源的 FlashQuant^TM的那些仪器上进行标记化学和方法。在一些实施例中提供试剂盒、数据分 析软件和MS平台作为用于酚系OH分析物和其代谢物的分析器。

可以根据本发明教示的各种实施例使用的不同液相色谱和质谱方法、系统和软件包 括描述于2009年5月31日提交的美国临时专利申请第61/182,748号和2006年8月17 日公开的美国专利申请第US2006/0183238A1号中的那些。这些参照案均以引用的方式 并入本文中。

根据本发明教示的其它实施例，提供一种包含QAOC试剂(如上文所论述的试剂)的 试剂盒。在其它实施例中，提供一种包含基于羰基取代的PTAD的试剂和一或多种氨氧 基MS标记剂的试剂盒。氨氧基MS标记剂可以包含来自上文所述的第一和/或第二类或 组的氨氧基MS标记剂的化合物。在一些实施例中，试剂盒可以包含标准物，所述标准 物包含已知酚系OH分析物。

根据本发明教示的各种实施例，提供一种可以包含基于羰基取代的PTAD的试剂和 氨氧基MS标记剂中的一或多者的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒可以包含含有已知 浓度的类固醇分析物的标准物，所述分析物包含酚系OH。

在一些实施例中，试剂盒可以包含至少一种包含已知浓度的已知酚系OH分析物的 标准物。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以为来自一组同量异位标记的同量异位 标记，并且在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组同量异位标记的多种不同同量异 位标记。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以为来自一组质量差示标记的质量差示 标记，并且在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组质量差示标记的多种不同质量差 示标记。根据一些实施例，试剂盒可以包含基于羰基取代的PTAD的试剂、氨氧基MS 标记剂、包含已知酚系OH分析物和/或已知浓度的已知酚系OH分析物的标准物，并且 进一步可以包含标记酚系OH分析物的说明书。

根据本发明传授内容的其它实施例，试剂盒可以包含如图1中所示的QAOC试剂、 不同QAOC试剂、其组合等。试剂盒也可以包含标准物，所述标准物包含已知酚系OH 分析物。在一些实施例中，标准物可以包含至已知浓度的已知酚系OH分析物。在一些 实施例中，试剂盒中所包括的QAOC试剂可以包含来自一组同量异位标记的一个或一个 以上同量异位标记。在一些实施例中，试剂盒可以包含来自一组同量异位标记的多个不 同的同量异位标记。在一些实施例中，试剂盒中所包括的QAOC试剂可以包含来自一组 质量差示标记的一个或一个以上质量差示标记。在一些实施例中，试剂盒可以包含来自 一组质量差示标记的多个不同的质量差示标记。

根据各种实施例，试剂盒可以包含缓冲剂、一个或一个以上色谱柱和任选地对进行 分析有用的其它试剂和/或成分。在一些实施例中，试剂盒可以包含例如均质分析以使得 使用者仅需要添加样品。在一些实施例中，试剂盒可以包含校准或归一化试剂或标准物。 可以或应该用于进行分析的关于仪器设定的信息也可以包括于试剂盒中。在一些实施例 中，关于样品制备、操作条件、体积量、温度设定等的信息包括于试剂盒内。

试剂盒可以包装于含有一个或一个以上试剂容器和适当说明书的气封箱中。电子媒 体可以包括于试剂盒中，在所述电子媒体上储存有关于一个或一个以上分析、测量值、 跃迁对、操作说明书、用于进行操作的软件、其组合等的电子信息。根据各种实施例， 可以提供一种用于合成QAOC试剂和其中间体的方法。

可以根据以下实例来进一步理解本发明传授内容的方面，所述实例不应该理解为以 任何方式限制本发明传授内容的范围。

实例

实例1-图示合成标记的QAOC试剂的步骤

合成对乙酰基-4-苯基-1-乙酯基氨基脲(1)

逐滴添加4-乙酰基苯基异氰酸酯(10g，62.05mmol)于甲苯(250mL)中的溶液至肼基 甲酸乙酯(6.46g，62.05mmol)于甲苯(100mL)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物2h 并且随后在80℃下搅拌2h。反应中形成的沉淀物经过滤并且在真空烘箱中干燥以得到 对乙酰基-4-苯基-1-乙酯基氨基脲1(16.5g，90％)。将其不经进一步纯化即用于下一反 应步骤中。(合成改自：有机合成汇编(Organic Syntheses，Coll.)第6卷，第936页(1988)； 第51卷，第121页(1971).4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮)。在各种方面中，用于此实例 中的每一成分的值可以增加或减小在大约5％到大约20％范围内的量，举例来说，可以 以比用于此实例中的值小5％到大5％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小 10％到大10％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小15％到大15％的量使用 每一成分或可以以比用于此实例中的值小20％到大20％的量使用每一成分。在各种方面 中，可以通过大约加上或减去5％到20％来改变所述值。

合成对乙酰基-4-苯基脲唑(2)

在70℃下用4M KOH水溶液(28mL，112mmol)加热对乙酰基-4-苯基-1-乙酯基氨 基脲1(15g，56mmol)大约2h。使用烧结的过滤漏斗来过滤残余的粒状固体。将滤过物 冷却到室温并且用浓缩HCl进行酸化。过滤形成的沉淀物并且在真空烘箱中进行干燥以 得到对浅黄色固体形式的乙酰基-4-苯基脲唑2(12.4g，85％)。¹H NMR(400MHz， DMSO-d6)：s＝1.65(s，3H)，6.70(d，2H)，7.10(d，2H)，9.50(s，2H)。(合成选自：有机合成 汇编(Organic Syntheses，Coll.)第6卷，第936页(1988)；第51卷，第121页(1971).4- 苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮)。在各种方面中，用于此实例中的每一成分的值可以增加或 减小在大约5％到大约20％范围内的量，举例来说，可以以比用于此实例中的值小5％到 大5％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小10％到大10％的量使用每一成 分、可以以比用于此实例中的值小15％到大15％的量使用每一成分或可以以比用于此实 例中的值小20％到大20％的量使用每一成分。在各种方面中，可以通过大约加上或减去 5％到20％来改变所述值。

合成溴化对乙酰基-4-苯基脲唑季氨氧基加合物(4)

在环境温度下搅拌对乙酰基-4-苯基脲唑2(2.10g，9.58mmol)和季氨氧基标记3(6.74 g，20.6mmol)于100mL甲醇-乙酸(95∶5v/v)中的悬浮液(在公开的美国申请 2011-0003395(以全文引用的方式并入本文中)中描述作为标记试剂的季氨氧基标记)48 h。在此阶段的HPLC分析显示2到产物对乙酰基-4-苯基脲唑季氨氧基加合物4的转化 率为95％。管柱：DeltaPak C18，3.9.times.150mm，缓冲液A：水+0.1％TFA，缓冲液B： 乙腈+0.085％TFA，波长(信号＝254nm，参考＝360nm)，流量＝1mL/min。分析物的浓度 大致为甲醇中的0.25mg/mL。对乙酰基-4-苯基脲唑2的保留时间＝5.1min并且对乙酰基 -4-苯基脲唑季氨氧基加合物4的保留时间＝5.5min。ES-MS数据：M+(计算值 M+＝C₁₆H₂₄N₅O₃+＝334.19，观测值M+＝334.20和275.50(-Me₃N))。在去除甲醇之后分离 白色固体形式的粗产物。在各种方面中，用于此实例中的每一成分的值可以增加或减小 在大约5％到大约20％范围内的量，举例来说，可以以比用于此实例中的值小5％到大 5％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小10％到大10％的量使用每一成分、 可以以比用于此实例中的值小15％到大15％的量使用每一成分或可以以比用于此实例中 的值小20％到大20％的量使用每一成分。在各种方面中，可以通过大约加上或减去5％ 到20％来改变所述值。

抗衡离子交换：如此获得的固体溶解于40mL水中并且其中的30mL(11.50mmol 的4)用于交换。立即添加七氟丁酸银溶液(3.69g，15mL去离子水中的11.53mmol)到此 溶液(50mL离心管中)中并且通过翻转所述管进行简单混合。通过持续2min的3000rpm 下的离心来分离沉淀物。通过添加七氟丁酸银的稀释溶液(1滴)检查上清液是否存在任 何溴化物离子(Br^-)。形成混浊表明存在Br^-。为确保溴离子完全沉淀，添加另一0.2当量 (0.738mg，5mL水中)的七氟丁酸银、经混合、离心并且检查是否存在Br^-。澄清溶液表 明所有Br^-被完全消耗。在注射器中获取滤过物并且再次经由5微米过滤器(25毫米， Millex LCR，PTEF，25毫升/过滤器)过滤并且通过急骤层析来纯化(分两批进行纯化： 43g，C18Isco管柱，流量＝40ml/min，溶剂A：水，溶剂B：甲醇，用100mL50％B 接着用250mL2％B来平衡管柱。将样品以溶液形式装载于管柱上，0-6min2％B接着 为6-35min2-85％B，波长＝254nm)。通过分析型HPLC来分析含有产物的洗脱份的纯 度并且收集纯(＞95％)溶离份并且在旋转蒸发器中进行干燥以得到白色固体形式的七氟 丁酸对乙酰基-4-苯基脲唑季氨氧基加合物5。用20mL甲苯共蒸发固体并且在真空中干 燥以确保完全去除水。最终产率和HPLC纯度为2.6g(65％)和＞98％。在各种方面中， 用于此实例中的每一成分的值可以增加或减小在大约5％到大约20％范围内的量，举例 来说，可以以比用于此实例中的值小5％到大5％的量使用每一成分、可以以比用于此实 例中的值小10％到大10％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小15％到大 15％的量使用每一成分或可以以比用于此实例中的值小20％到大20％的量使用每一成 分。在各种方面中，可以通过大约加上或减去5％到20％来改变所述值。

合成标记的QAOC试剂(6)

逐滴添加(2-3min的添加)tBuOCl(0.175mL，7mL无水乙腈中的1.46mmol)的溶液 到七氟丁酸对乙酰基-4-苯基脲唑季氨氧基加合物5(800mg，1.46mmol，在氩气氛围下) 的冷悬浮液中，同时进行搅拌。在完成添加之后，在0-5℃下搅拌反应混合物30min。 通过旋转蒸发器去除乙腈(用氮排出)并且用无水EtOAc洗涤粉红色固体(在氩气覆盖下 用滴管从顶部去除)。在真空中干燥之后，获得0.65g(80％)橙红色固体形式的6。产物 储存于-40℃下、不含水分并且保护免于强光。在各种方面中，用于此实例中的每一成分 的值可以增加或减小在大约5％到大约20％范围内的量，举例来说，可以以比用于此实 例中的值小5％到大5％的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小10％到大10％ 的量使用每一成分、可以以比用于此实例中的值小15％到大15％的量使用每一成分或可 以以比用于此实例中的值小20％到大20％的量使用每一成分。在各种方面中，可以通过 大约加上或减去5％到20％来改变所述值。

实例2-样品富集

样品体积、萃取溶剂和其组成、试剂溶液、萃取介质量和分子量截断膜类型为典型 的。

干血点：用内标对滤纸上的干燥人类或动物血液样品(3-10μL)进行加标并且用100 μL乙酸乙酯-己烷，优选地以1∶1的组合物，更优选地多次地进行萃取(可能需要声处理 以提高萃取效率)。随后使用离心真空浓缩器或热气流或全体的组合来干燥合并的乙酸乙 酯-己烷层。添加50μL试剂溶液(乙腈中的2mg/mL)到干燥样品。样品经涡旋以进行混 合并且随后在室温下培育至少30min。添加水(20μL)，样品经涡旋以进行混合，并且随 后通过LC-MSMS分析样品。

蛋白质沉淀：添加0.8mL乙腈到含有内标的人类或动物血清或血浆样品(200μL)。 样品经涡旋以进行混合并且随后于10,000xg下离心5min。去除上清液(750μL)并且随 后使用离心真空浓缩器或热气流或全体的组合来进行干燥。添加50μL试剂溶液(乙腈中 的2mg/mL)到干燥样品。样品经涡旋以进行混合并且随后在室温下培育至少30min。添 加水(20μL)，样品经涡旋以进行混合，并且随后通过LC-MSMS分析样品。

液-液萃取(LLE)：用1mL乙酸乙酯-己烷，优选地1∶1的组合物，更优选地多次地 萃取含有内标的人类或动物血清或血浆样品(200μL)。随后使用离心真空浓缩器或热气 流或全体的组合来干燥合并的乙酸乙酯-己烷层。添加50μL试剂溶液(乙腈中的2mg/mL) 到干燥样品。样品经涡旋以进行混合并且随后在室温下培育至少30min。添加水(20μL)， 样品经涡旋以进行混合，并且随后通过LC-MSMS分析样品。

固-液萃取(SLE)：将含有内标的人类或动物血清或血浆样品(200μL)涂覆于200mg 硅藻土介质(优选地呈筒柱或96孔板或任何其它合适的形式)上，允许吸收5-10分钟并 且随后用1mL二异丙基醚，优选地多次地进行萃取。随后使用离心真空浓缩器或热气 流或全体的组合来干燥合并的二异丙基醚萃取物。添加50μL试剂溶液(乙腈中的2 mg/mL)到干燥样品。样品经涡旋以进行混合并且随后在室温下培育至少30min。添加水 (20μL)，样品经涡旋以进行混合，并且随后通过LC-MSMS分析样品。

游离(非结合)雌激素：将人类或动物血清或血浆样品(400μL)涂覆于30kDa超滤(UF) 膜或装置上并且在3000-5000g下离心1小时。随后用内标对滤过物进行加标并且用1mL 二异丙基醚，优选地多次地进行萃取。随后使用离心真空浓缩器或热气流或全体的组合 来干燥合并的二异丙基醚萃取物。添加50μL试剂溶液(乙腈中的2mg/mL)到干燥样品。 样品经涡旋以进行混合并且随后在室温下培育至少30min。添加水(20μL)，样品经涡旋 以进行混合，并且随后通过LC-MSMS分析样品。

实例3-质谱分析

可以在LC-MSMS分析中使用以下参数来分析样品。

HPLC参数

管柱：AAA C18管柱(C18反相，5μm，4.6mm×150mm)

温度：50℃

移动相：A＝H₂O+0.1％FA B＝乙腈+0.1％FA

注射体积：20μL

梯度：

HPLC和MS参数为典型值并且为非限制性的。

实例4-分析API-5500QTRP上的雌激素

使用类似方法，根据显示于图4中的机制使雌二醇与式I的标记的QAOC反应并且 使用Q1-MS-Q1扫描进行分析。图5A提供使用由AB SCIEX制造的API-5500QTRP^TM质谱仪的反应混合物的扫描。如所展示，预期的M⁺＝604.35，但发现于604.2。

根据一些实施例，当同量异位标记为氨氧基MS标记剂时，报告子信号可以经受进 一步分裂(MS³)。使报告子信号经受进一步分裂可以通过与标准数据库比较提供使得能 够对分析物进行验证鉴别的峰值。根据一些实施例，可以使来自管柱的洗脱液经受母离 子-子离子跃迁监测(PDITM)。m/z604.3处的此产物离子经受碰撞能量扫描并且结果显示 于图6A中。可以在图6B中看见母离子以及一些MRM片段，包括545.1处的中性丢失 片段。此反应混合物随后关于两个MRM跃迁：604.3→545.1和604.3→217.2进行 LC-MRM特征曲线描绘，其显示于图7中(虚线和连续轨迹)。在8min内于乙腈-水(0.1％ 甲酸)梯度5→95％B，Water′s Acquity C8UPLC管柱，0.7mL/min，5μL注射液，40℃管柱 室中提供反应混合物。

实例5-分析3200QTRAP上的雌激素

雌酮、雌二醇和雌三醇各自经富集并且与式I的标记的QAOC试剂反应并且已经确 定产物离子的分裂模式。使用3200QTRAP仪器的MSMS参数为：

化合物 Q1 Q3 时间(毫秒) DP EP CE CXP 雌酮(E1) 602.4 543.3 50 46 4.0 29 6 雌二醇(E2) 604.4 545.3 50 46 7.0 31 6 雌三醇(E3) 620.4 561.3 50 51 6.5 30 6

使用的源/气体参数为：

CUR：   10.00

IS：    5000.00

TEM：   500.00

GS1：   20.00

GS2：   20.00

Ihe：   开

CAD：   高

图8提供包含用图1的QAOC试剂标记的雌酮、雌二醇和雌三醇的反应的LC-MRM 特征曲线。

本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且无论如何不应理解为限制所述标的物。

虽然结合各种实施例来描述本申请人的传授内容，但并不打算将申请人的传授内容 限制为实施例。与其相反，本申请人的传授内容涵盖如所属领域的技术人员将了解的各 种替代方案，修改方案以及等效物。

虽然以上描述提供了各种实施例的实例和具体细节，但是应了解，所述实施例的一 些特征和/或功能允许在不脱离所述实施例的范围的情况下加以修改。以上描述意图说明 本发明，其范围仅由在此随附的权利要求的语言进行限制。从本说明书和本文所公开的 本发明传授内容的实践来考虑，本发明传授内容的其它实施例对所属领域的技术人员来 说将为显而易见的。预期将本说明书和实例仅视为例示性的。