基于LAMP的桃内标准基因快速检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及生物检测试剂及方法，具体是针对桃内标准基因叶绿素a/b结合蛋白（Lhcb2）基因设计LAMP引物，成功筛选出了一套LAMP引物，将该套引物用于LAMP定性检测和基于SYBR Green I的LAMP定量方法检测，同时提供了相应技术的试剂盒。本发明的试剂盒由引物、反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂等组成，检测方法包括基因组的提取、环介导等温扩增以及显色反应，操作简便、灵敏度高、反应快速、肉眼判定结果等优点，为桃内标检测提供了有效、快速的检测方法。结果表明，该引物检测桃内标准基因的灵敏度可达到10pg。定量结果标准曲线线性关系良好。该发明将为果汁掺假检测提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂及方法，具体是指基于环介导等温扩增技术鉴定桃内标准基因的定性和定量方法的建立。

背景技术

LAMP技术是2000年Notomi T等发明的一种新的体外恒温核酸扩增方法。LAMP方法针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase，large fragment）在恒温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，由于针对靶基因6个独立区域设计引物，可以在1h之内，将靶DNA片段扩增109至1010倍。如果设计环引物，将其用于环介导等温扩增反应中，扩增速率大大加快，时间可缩短至15-30min。

本发明以桃作为对象，对已经确定的桃内标准基因叶绿素a/b结合蛋白（Lhcb2）基因（EF127291.1）设计环介导等温扩增引物，建立桃内标准基因等温扩增方法，为水果源成分的分子生物学检测提供一种快速简便的方法。由于果汁及其饮料属于深加工产品，样品中的DNA经过一系列的加工步骤以及物理化学处理过程，易发生大量断裂、降解甚至破坏，提取的DNA模板片段会比较小，LAMP方法的扩增区域为200bp左右，由于LAMP方法使用4条引物识别靶序列的6个区域，具有较高的特异性，因而LAMP方法非常适于果汁等加工品的检测。该发明可为今后水果源成分的鉴定提供技术支持。

发明内容

为了建立了一种检测桃内标准基因的新型、快速的方法，即环介导等温扩增方法，本发明提供了一套定性和定量检测均具有较高的灵敏度的引物。根据上述引物建立了完整的检测方法，同时提供了相应的试剂盒。该方法具有灵敏度高、操作简单、快速、准确等优点，使用普通的定量PCR仪、水浴锅及恒温培养箱等即可在1h内完成检测。可为果汁掺假检测提供技术支持。

本发明提供的用于桃内标准基因检测的环介导等温扩增的引物。根据桃叶绿体a/b结合蛋白（Lhcb2）（EF127291.1）基因使用日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件LAMP primer designing software primerexplorer V4.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html )设计并筛选出了1套引物，包括两条外引物（peach863-F3/peach863-B3）、两条内引物（peach-FIP/peach-BIP），该引物组对于检测桃内标准基因具有特异性。

上述引物的核苷酸序列分别为：

peach-F3：ATTGCACCAATTTGCCAG

peach-B3：TGACTATGCTCTCCTGTTC

peach-FIP：CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-

ACCTCTCTCTCACTAGAACA

peach-BIP：ATCCACAACATCTTCACATTCCC-

GGCCTAATGAGATGCCTTG

根据上述引物设计的检测方法，采用以下技术方案：

1、样品的制备和模板的提取：将样品在液氮中磨成粉末，称20mg±1mg样品，用CTAB方法提取基因组。

2、环介导等温扩增：配置反应体系，总体积25μL，包括：1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M 甜菜碱，1.6μM外引物（peach -F3, peach -B3）、0.2μM 内引物（peach -FIP, peach -BIP）、3.2-8.0U Bst DNA聚合酶、1x Thermopol buffer(包含: 20mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100)。进行扩增反应。

3、环介导等温扩增产物的检测：

3.1电泳法：将LAMP扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳图呈现LAMP典型的阶梯状条带，则样品中有目的基因，若电泳图无任何条带则为阴性。

3.2染色法：加入SYBR Green I，观察颜色变化：在反应管中加入1μL SYBR Green I（1000X），混匀后观察颜色变化，若颜色变为绿色，则样品中有目的基因，若颜色仍保持SYBR Green I的橙色，则为阴性。

   本发明的第三个目的提供了快速诊断试剂盒，包括所述的引物组、上述检测方法的反应液、Bst DNA 聚合酶以及一张阳性定量标准曲线。

其中引物组由体积比为1:1:8:8的上下游外引物和上下游内引物组成。反应液是由体积比为5:8:1:8的1x Thermopol buffer、1.4-2.2mM dNTP、3-9mM MgSO4、0.4-1.0M 甜菜碱组成。Bst DNA聚合酶每微升含3-8个活性单位。还有20X SYBR GREENⅠ荧光染料，稀释到1000X后可作为显色剂。以及一份定量标准曲线图

本发明所述的环介导等温扩增技术检测含桃样品具有以下优点：

1、反应快速，一般情况下在15-30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本发明选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增109倍，该方法操作简便，适于转基因产品的快速检测。

2、特异性好，该技术对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。

3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个数量级，该技术为转基因产品的监督检测提供了技术支持。

4、操作简单，适于基层使用。本发明设计了检测桃内标的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层检测使用。

附图说明    

图1 引物验证与引物酶切验证图，A从左至右分别为泳道1-3：产物酶切条带；泳道4：10倍稀释产物；M: DNA marker DL2000 。

图2LAMP定性灵敏度试验电泳图，从左至右分别为105，104,103,102,10 pg基因组。

图3LAMP定量灵敏度试验-扩增曲线。

图4LAMP定量灵敏度试验-标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 桃内标检测方法的建立

1.实验材料

收集自市场的桃叶

2.模板的制备：

基因组提取采用CTAB方法，并将浓度调整为100ng/μL。然后将此浓度的基因组按10倍浓度进行梯度稀释为104,103,102,10 pg/μL，制备成系列梯度浓度的标准DNA模板。

3.引物合成：

引物由上海生工生物有限公司合成，配制成10μM使用液。

4.LAMP扩增反应体系：

总体积25μL，包括：1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M 甜菜碱，1.6μM外引物（peach -F3, peach -B3）、0.2μM 内引物（peach -FIP, peach -BIP）、3.2-8.0U Bst DNA聚合酶、1x Thermopol buffer(包含: 20mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100)。

LAMP定性扩增反应程序：

65℃反应40min，85℃放置3min，终止反应。

5.LAMP定量扩增反应体系：

总体积25μL，包括：1.4-2.0mM dNTP、1-8mM MgSO4、0.6-1.2M 甜菜碱，1.6μM外引物（MON863-F3,MON863-B3）、0.2μM 内引物（MON863-FIP,MON863-BIP）、3.2-8.0U Bst DNA聚合酶、1x Thermopol buffer(包含: 20mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100)，1μL 20x SYBR Green I，ddH2O补足至25μL。

LAMP定量扩增反应程序为：

64℃反应3 min, 50个循环：64℃ 30 s，64℃30 s。

6.结果分析

6.1扩增产物电泳结果显示为LAMP典型的阶梯状条带，在EcoR V位点，通过计算，酶切产物大小为99bp和91bp，酶切结果与预期相符（图1）.

6.2五个不同桃基因组DNA浓度（105，104，103，102，10pg/μL）的样品，都可以被检测到（图2），这说明最低检测限为10pg。

6.3检测灵敏度的五个不同桃基因组浓度（105，104，103，102，10pg/μL）的样品，都可以被检测到（图3）。这说明最低检测限为10pg。

实施例2 桃内标试剂盒的制备

本发明所提供的试剂盒由一套引物组、反应液、Bst DNA 聚合酶、显色剂以及一张阳性定量标准曲线等组成。

1.试剂盒中的引物为：

peach-F3：ATTGCACCAATTTGCCAG

peach-B3：TGACTATGCTCTCCTGTTC

peach-FIP：CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-

ACCTCTCTCTCACTAGAACA

peach-BIP：ATCCACAACATCTTCACATTCCC-

GGCCTAATGAGATGCCTTG

2.反应液是由体积比为5:8:1:8的1x Thermopol buffer、1.4-2.2mM dNTP、3-9mM MgSO4、0.4-1.0M 甜菜碱组成；其中1x Thermopol buffer含有20mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100

3.Bst DNA聚合酶为Bst  DNA  polymerase ，每微升含3-8个活性单位；还有SYBR GREENⅠ荧光染料，稀释到后可作为显色剂。

实施例3 试剂盒检测桃内标

1.实验材料：农夫果园混合果汁

2.样品的制备和模板的提取：取样品10ml,12000r/min离心10min，沉淀用CTAB方法提取基因组。

3.环介导等温扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物9μL，反应液13μL，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板1μL，ddH2O1μL，盖紧管盖，65℃水浴锅中反应40min。

4.环介导等温扩增产物的检测：反应结束后，直接向反应液中加入1μL 1000x SYBR Green I，混匀，肉眼观察颜色变化。有扩增反应的管颜色变为绿色，无扩增反应的管仍然保持SYBR Green I的橙色。

5.环介导等温定量扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物9μL，反应液13μL，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板1μL，ddH2O1μL，盖紧管盖放于定量PCR中，65℃3min，50循环[65℃30s，65℃30s]。

6.环介导等温定量扩增产物的检测：将样品测得的Ct值代入在标准曲线方程中，算出样品的浓度。根据单倍体桃分子的分子质量约为0.55 pg，计算得出每毫升果汁中桃成分的拷贝数约为270。