一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒及其构建方法

摘要

本发明属生物医学领域，涉及溶瘤腺病毒，具体涉及一种受组织或细胞特异性启动子(转录水平)和microRNA(转录后水平)双调控的新型溶瘤腺病毒及其构建方法，构建的双调控溶瘤腺病毒比仅受组织或细胞特异性启动子调控的溶瘤腺病毒更加安全、有效；本发明构建的双调控溶瘤腺病毒能单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能显著提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及溶瘤腺病毒，具体涉及一种受组织或细胞特异 性启动子(转录水平)和microRNA(转录后水平)双调控的新型溶瘤腺病毒及 其构建方法，按此方法构建的双调控溶瘤腺病毒比仅受组织或细胞特异性启动 子调控的溶瘤腺病毒更加安全、有效。

背景技术

据报道，生物治疗是继手术、放疗、化疗三大传统疗法之后治疗癌症的第 四种疗法，其主要包括免疫治疗、细胞治疗与基因治疗等。有关肿瘤生物治疗的 研究与应用已经取得较多成果，其中，条件复制型腺病毒可以在肿瘤细胞内选择 性的复制，而且具有显著的“溶瘤效应”和“旁观者效应”，因而作为一种新兴 方式被期望在晚期癌症的治疗中发挥作用。目前最常用的构建条件复制型腺病毒 的手段是利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒早期复制必需基因 (E1A)，实现其仅在肿瘤细胞内特异性复制和溶瘤的作用，以保证其治疗效应的 安全性及有效性。然而，必须清楚地认识到，所述的安全性是相对的，尤其在高 浓度病毒剂量的使用下，仍会产生比较严重的毒副作用，Kumiko Sugio等用人 端粒酶启动子调控E1A早期复制的腺病毒TRAD以10moi和2moi剂量分别感染 人肺成纤维细胞WI38,结果发现，在2moi小剂量情况下，病毒复制量很少，而 在10moi剂量下，病毒复制量有500倍的增加；John Nemunaitis得出同样的结 果；究其原因，均为腺病毒E1A基因的表达不够严谨所导致。研究者认为，如果 能够在E1A mRNA的翻译水平可根据细胞不同活性进行更精细地调控，使其E1A 基因表达经转录水平和转录后水平双重调控，则构建的这种新型条件复制型腺病 毒，其严谨性必应得以增强，更为安全。近年来，MicroRNA是一类研究透彻的 转录后基因表达调控分子，在肿瘤细胞和正常细胞中存在差异表达，它们是内源 表达的小编码RNAs,通常只有18-25个核苷酸长度，是转录后基因表达的重要调 控子,通过形成RNA诱导沉默复合体(RISC,RNA-induced silencing complex), 和目的mRNA部分碱基完全互补配对结合，沉默靶基因；miR-145是其中研究众 多、也最为清楚的microRNA，在很多肿瘤中包括结肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌 组织和细胞系中表达量是低的，而在它们的正常细胞中表达量较高。本申请的前 期研究曾成功构建了一个人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒复制早 期必需基因E1A的腺病毒Adzq11，其能很好地在肿瘤细胞内选择性复制。

在此基础上，本申请的发明人拟构建一种新的病毒Adzq11-145T。

与本发明相关的现有技术有如下参考文献：

1.Wei Fang,Wang Hui-ping,Chen Xia-fang,et al.Construction and characterization of  oncolytic adenovirus controlled under heat shock protein 70 gene  promoter[J].Prog.biochem.biophys,2009,36(12):1536-1543

2.Sugio K,Sakurai F,Katayama K,et al.Enhanced safety profiles of the telomerase-specific  replication-competent adenovirus by incorporation of normal cell-specific microRNA-targeted  sequences[J].Clin Cancer Res,2011,17(9):2807-2818

3.Nemunaitis J,Tong A W,Nemunaitis M,et al.A phase I study of telomerase-specific  replication competent oncolytic adenovirus(telomelysin)for various solid tumors[J].Mol Ther, 2010,18(2):429-434

4.Paranjape T,Slack F J,Weidhaas J B.MicroRNAs:tools for cancer diagnostics[J].Gut,2009, 58(11):1546-1554

5.Ylosmakie HakkarainenT,Hemminki A,et al.Generation of a conditionally replicating  adenovirus based on targeted destruction of E1 A mRNA by a cell type-specific MicroRNA[J]. J Virol,2008,82(22):11009-11015

6.Cawood R,Wong S L,Di Y,et al.MicroRNA controlled adenovirus mediates anti-cancer  efficacy without affecting endogenous microRNA activity[J].PLoS One,2011,6(1):1-10

7.Guo Zhi-wei,Zhong Zhao-hua.Tissue specific expression of microRNA and detection  methods[J].Int J Immunol,2010,33(5):367-370

8.Li Guang-ping,Qiu Chang-chun.The current progress of microRNAs[J].Progress in modern  biomedicine,2007,7(12):1893-1895

9.Iio A,NakagawaY,Hirata I,et al.Identification of non-coding RNAs embracing  microRNA-143/145cluster[J].Mol Cancer,2010,9(136):1-7

10.Li Jhy-ming,Kao Kuo-chin,Li Li-fu,et al.MicroRNA-145regulates oncolytic herpes simplex  virus-1 for selective killing of human non-small cell lung cancer cells[J].Virol J,2013, 10(241):1-9

11.Jin Hua-jun,Lv Sai-qun,Yang Jia-he,et al.Use of microRNA Let-7 to control the replication  specificity of oncolytic adenovirus in hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2011,6(7): 1-10.

12.Wang Hui-ping,Wei Fang,Zhang Ju-feng,et al.A novel immunocompetent murine tumor  model for the evaluation of RCAd-enhanced RDAd transduction efficacy[J].Tumour Biol, 2012,33(4):1245-1253。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种受转录和转录后水平双调 控的新型溶瘤腺病毒及其构建方法。

本申请以Adzq11为基础，利用miR-145存在肿瘤组织和正常组织差异表达的 特点，设计四个拷贝的靶序列，加入腺病毒Adzq11早期复制必需基因E1A的3' 非翻译区，构建一种新的病毒Adzq11-145T。

具体的，本发明以重组腺病毒(Ad)为载体，根据不同类型肿瘤的遗传特点， 转录水平选择肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子调控腺病毒复制必需元件 E1基因，转录后水平选择在肿瘤组织和正常组织差异表达的MicroRNA，设计多 个拷贝的靶序列加入早期复制必需基因E1的3'非翻译区，构建受转录和转录后 水平双调控的新型溶瘤腺病毒。

本方法构建的双调控溶瘤腺病毒能有效克服仅受组织或细胞特异性启动子 调控的溶瘤腺病毒由于启动子严谨性的相对性带来的安全性问题，能使腺病毒的 复制更特异地局限在肿瘤细胞内，而在正常细胞内不复制。

本发明中，所述的腺病毒复制必需早期基因包括E1A,E1AE1B,E1AE1B19k。

所述腺病毒复制必需早期基因的启动子，被人肿瘤细胞或肿瘤组织的启动 子所取代；所述的启动子包括肿瘤细胞或微环境特异性的启动子或肿瘤组织特异 性启动子，其中，肿瘤细胞或微环境特异性的启动子可以是低氧诱导性基因的启 动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，端粒酶(TERT)基因启动子 或热休克蛋白基因启动子；所述的肿瘤组织特异性启动子可以是前列腺组织特异 性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-甲胎蛋 白(AFP)基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase 基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚抗 原蛋白(CEA)基因启动子；

所述的microRNA为在肿瘤组织和正常组织差异表达的microRNA，即在正常 组织中高表达，在肿瘤组织中低表达或不表达；所述microRNA包括：miR-143， miR-145，miR-122，miR-199，let-7等；其靶序列为与其完全或大部分互补的 序列；序列拷贝数为1-10个；序列插入位置为病毒复制早期基因E1表达框终止 密码与polyA之间；上述miRNA靶序列可2个或多个组合使用。

本发明中，所述腺病毒DNA的E3区域亦可嵌入报告基因或抗癌基因。

所述抗癌基因包括：细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因， 细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因及其反义基因或 干扰RNA片段。其中，免疫基因包括：白介素(IL),各种集落刺激因子(CSF), 肿瘤坏死因子(TNFα)，各种细胞粘附分子等；自杀基因包括：细菌或及酵母的 cytosine deaminase(CD)基因；疱疹病毒的thymidine kinase(TK)基因以 及p450基因等。所述的抗癌基因的启动子包括：强效启动子(如CMV)、肿瘤细 胞或微环境特异性的启动子和肿瘤组织特异性启动子。

本发明的另一目的是提供所述受转录和转录后水平双调控的新型溶瘤腺病 毒构建方法的医用用途；尤其涉及所述方法在用于制备肿瘤基因治疗药物中的新 用途。

本发明所述受转录和转录后水平双调控的新型溶瘤腺病毒构建方法能用于 肿瘤治疗药物的制备；尤其是用于制备治疗人类原位或转移肿瘤的药物。

以本发明所述方法制备的新型双调控溶瘤腺病毒可单独用于肿瘤的治疗。

以本发明所述方法制备的新型双调控溶瘤腺病毒可与肿瘤的放射线治疗、化 学治疗、光动力学治疗及温热治疗相结合，对肿瘤进行综合治疗。可以在放射治 疗、化学治疗、光动力学治疗及温热治疗前，治疗期间，或治疗后直接注射入肿 瘤中。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现:

1、通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤或组织特异性启动子；

2、构建携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1基因的腺病 毒穿梭质粒；

3、通过PCR反应或基因合成获得miRNA靶序列；

4、利用分子克隆技术将获得的miRNA靶序列插入到腺病毒复制早期基因E1表 达框终止密码与polyA之间；

5.构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架质粒；

6.包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；

7.病毒感染正常细胞及肿瘤细胞测定并复制及杀伤能力，评价安全性及有效性。

本发明中，采用的质粒pEGFP-N1为CLONTECH L aboratories,Inc.产品， GenBank Accession#U55762。

本发明的有益效果在于，

本发明只要根据不同类型肿瘤的遗传特点，选择合适的肿瘤细胞或状态或 组织特异性的启动子及在正常组织和肿瘤中差异表达的miRNA从转录及转录后 水平双重调控腺病毒复制必需元件E1A基因，从而调控腺病毒复制，使得溶瘤腺 病毒具有更好的安全性，适用于不同组织来源的肿瘤及疾病的个体化治疗,具有 广阔的应用前景。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描 述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术 人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改 变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1.质粒构建，测序和腺病毒包装，其中，

图1a是质粒构建示意图；图1b是腺病毒包装出毒显示“彗星状”带，成 功构建出病毒Adzq11和病毒Adzq11-145T；图1c是pDC311-telo-E1A-145T质 粒测序显示四个拷贝的miR-145靶序列已经成功插入到pDC311-telo-E1A的E1A 3'非翻译区。

图2.miR-145和E1A在A549和HLF细胞中的表达，其中，

图2a显示miR-145在HLF中的表达明显高于A549中；图2b显示了质粒 pDC311-telo-E1A和pDC311-telo-E1A-145T转染细胞后E1A的表达分析比较：在 A549细胞中，转染两种质粒后E1A水平差异较小，而在HLF中， pDC311-telo-E1A-145T质粒E1A表达水平显著下降；图2c为病毒Adzq11和 Adzq11-145T感染细胞后E1A的表达分析：病毒感染细胞后，A549细胞中两种病 毒的E1A表达量都较高；HLF细胞中，Adzq11-145T病毒E1A表达显著下降 (*p<0.05，**p<0.01)。

图3.腺病毒复制和细胞毒性检测，其中，

图3a显示了空斑单位法检测腺病毒在A549和HLF中的复制情况：在A549 中，Adzq11-145T复制量高于Adzq11；在HLF中，Adzq11-145T复制量明显低 于Adzq11；图3b显示了病毒对两种细胞的杀伤情况比较：CCK8结果显示：不 同剂量组，Adzq11对A549杀伤效应均明显强于HLF；而同样剂量经改造后的 Adzq11-145T对HLF的杀伤力减小，较Adzq11更为安全(*p<0.05，**p<0.01)。

图4.病毒感染A549和HLF细胞后病理改变，其中，

荧光显微镜下可见，随着病毒浓度增大，病毒对细胞的杀伤效果都逐步增大， 病毒Adzq11和Adzq11-145T对A549细胞均有杀伤且后者杀伤效果明显，胞体变 圆，粘附力差；而在HLF细胞中，Adzq11-145T感染后，所有细胞胞体呈长梭状， 触角长，粘附牢；病毒Adzq11感染后，还可见存在部分变圆的、折光度稍差的 病变细胞，细胞存活状态较Adzq11-145T差。

具体实施方式

实施例1：通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子

A.端粒酶5’端调控顺序

为了分离端粒酶启动子，本发明采用PCR技术，以人类细胞DNA为模板， 扩增启动子(序列一)，将其插入质粒pEGFP-1(购自Clontech公司)中，驱动 GFP基因表达，构建pTERT-EGFP表达质粒，然后，用脂质体将pTERT-EGFP转入 各种细胞中，实验显示，EGFP仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中则没有EGFP 表达；

B.E2F1基因启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子(序列二)， 将该段顺序插入质粒pEGFP-1中，以E2F1基因启动子驱动EGFP表达，获得表达 质粒pE2F1-EGFP。之后的脂质体辅助的转导实验结果显示，GFP在肿瘤细胞中 高水平表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明该启动子的活性在正常与 肿瘤细胞之间的区别很大，可用于调控腺病毒选择性地在肿瘤内复制；

C.缺氧诱导性启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离缺氧诱导性的 启动子(序列三)，所述启动子是血管生长因子/血管通透性因子(VEGF)的5’ 端的启动子，其已被多种实验证明，是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。 而它的启动子也被证实在肿瘤中选择性的活化。本发明将所述启动子插入到质粒 pEGFP-1中，得到pHRP-EGFP-1。实验证明，上述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被 选择性激活，而在正常氧气分压下它的活性很低；

D.α-胚胎蛋白(AFP)基因启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出α-胚胎蛋白基因 启动子(序列四)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pAFP-EGFP。将所得质粒 导入细胞中，结果显示，只有在肝癌细胞中才观察到有高水平的GFP报告基因表 达，而在正常细胞和没有α-胚胎蛋白表达的肿瘤细胞中均没有GFP表达；

E.癌胚抗原(CEA)基因启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出CEA启动子(序 列五)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pCEA-EGFP。将所得质粒导入细胞中， 结果显示，在CEA阳性的直肠癌细胞Lovo和SW620中观察到有高水平的GFP 报告基因表达，而在正常细胞和无CEA表达的肿瘤细胞(如ChangLiver和Hela 细胞)中均没有GFP表达；

F.热休克蛋白(HSP)基因启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出HSP启动子(序 列六)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pHSP-EGFP，将所得质粒导入细胞中， 结果显示，上述启动子在加热的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常情况下它的 活性很低；

G.MUC-1基因启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离MUC-1基因启动 子(序列七)，将其顺序插入质粒pEGFP-1中，得到pMUC1-EGFP。细胞转染实验 证明，GFP仅在MUC1基因高水平表达的肿瘤细胞中特异性表达，而在没有MUC1 基因表达的细胞中则基本不表达；

F.c-erbB2启动子

本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离erbB2基因启动 子(序列八)，将其顺序插入质粒pEGFP-1中，得到perbB2-EGFP。细胞转染实 验证明，GFP仅在erbB2基因高水平表达的肿瘤细胞(如乳腺癌细胞株SKBR-3) 中特异性表达，而在没有erbB2基因表达的细胞中则基本不表达。

实施例2：构建携带肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的 真核表达载体

将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子(TSP)通过遗传工程的方法嵌 入真核表达载体,用其控制腺病毒复制必需的早期基因E1A的表达。所述质粒的 特点是其携带的腺病毒复制必需元件E1A基因被肿瘤组织特异性的启动子所调 控。本发明采用的真核表达载体结构示意为：Plasmid-TSP-E1A，其中，Plasmid 为腺病毒穿梭质粒(比如：pDC311，pDC312,pDC315,pDC316)；TSP为实施例 1中所分离出的肿瘤特异性启动子及其它未提及的肿瘤特异性启动子。

实施例3：通过PCR反应或基因合成获得miRNA靶序列

通过PCR反应或基因合成获得1-10个拷贝的miRNA靶序列，各拷贝间含 linker序列，两端含酶切位点。如通过基因合成获得含4个拷贝的miRNA145靶 序列(序列九)。

实施例4：利用分子克隆技术将获得的miRNA靶序列插入到腺病毒复制早期 基因E1表达框终止密码与polyA之间

将实施例3获得的miRNA靶序列与实施例2构建的腺病毒穿梭质粒 Plasmid-TSP-E1A经同一限制性内切酶处理，连接，将获得的miRNA靶序列插入 到腺病毒复制早期基因E1表达框终止密码与polyA之间，构建双调控腺病毒穿 梭质粒Plasmid-TSP-E1A-miRNA。

实施例5：构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架质粒:

按本领域常规方法构建下述携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架载体

①.携带报告基因EGFP编码基因:pBHG-CMV-EGFP

②.携带具有刺激机体免疫能力的IL2编码基因：pBHG-CMV-IL2

③.携带具有刺激机体免疫能力的GM-CSF编码基因：pBHG-CMV-GM-CSF

④.携带肿瘤坏死因子TNFα编码基因：pBHG-CMV-TNFα

实施例6：包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；

采用人胚肾293细胞对上述构建病毒进行包装，经过噬菌斑(plaque  purification)筛选后再进行扩增，采用氯化铯密度梯度离心及透析纯化病毒。 纯化的病毒滴度均可达3-5×10¹⁰pfu/ml。

将上述病毒感染肿瘤细胞测定报告基因EGFP及治疗基因的表达。结果证明， 荧光显微镜下观察上述Ad-CMV-EGFP感染的肿瘤细胞，表达绿色荧光蛋白；ELISA 检测治疗基因的表达水平，IL2，GM-CSF和TNFα的表达量都较高。

实施例7：病毒感染正常细胞及肿瘤细胞测定比较复制及杀伤能力，评价安 全性及有效性

将实施例6纯化后的双调控溶瘤病毒Adzq11-145T(Ad-TERTp-E1A-mi145T) 和单调控对照病毒Adzq11(Ad-TERTp-E1A)(图1)分别感染非小细胞肺癌A549 和正常人胚肺细胞HLF，空斑单位法检测腺病毒在A549和HLF中的复制情况： 在A549中，Adzq11-145T复制量高于Adzq11；在HLF中，Adzq11-145T复制 量明显低于Adzq11。CCK8结果显示：不同剂量组，Adzq11-145T对A549杀伤效 均不低于甚至高于Adzq11；而同样剂量经改造后的Adzq11-145T对HLF的杀伤 力减小，较Adzq11更为安全(图3-4)；

将5×10⁸Adzq11-145T以及对照5×10⁸Adzq11分别注射到人非小细胞肺癌 A549裸鼠皮下移植瘤内，每2-3天测量肿瘤大小一次,跟踪观察肿瘤生长情况； 结果表明，Adzq11-145T和Adzq11组都具有一定抑制肿瘤生长的能力，但 Adzq11-145T组较Adzq11组抗癌效果明显增强，动物生存时间延长，显示 Adzq11-145T能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

本发明所涉及的启动子序列做如下说明：

序列一：

GenBank：AF097365

Homo sapiens telomerase reverse transcriptase(TERT)gene,promoter and  partial cds.

序列二：

GenBank:U47675

Human transcription factor E2F1(E2F1)gene,promoter and exon1.

序列三：

GenBank:AH006957

Homo sapiens hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit(HIF1A)gene, complete cds

序列四：

GenBank:L34019

Homo sapiens(clone Ch-HAF3)alpha-fetoprotein(AFP)gene,promoter  region

序列五：

GenBank:Z21818

H.sapiens carcinoembryonic antigen gene

序列六：

GenBank：X13229

Human hsp70Bgene5'-region

序列七：

GenBank:M35093

Homo sapiens tumor mucin antigen(MUC1)gene,complete cds.

序列八：

GenBank:M16892

Human c-erbB-2proto-oncogene,promoter region

序列九：

四个miR-145的靶序列(S-145T)

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