一种黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中的应用，该黄酮苷类化合物对心肌损伤具有明显的保护作用，且未见毒副作用，为研制保护心肌缺血损伤的药物提供先导化合物。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中的应用。

背景技术

缺血性心脏病最常见的是冠心病，是威胁人类健康的重大疾病。2008年世界卫生组织（WHO）发布的流行病学调查显示：全球因疾病死亡的人数达5700万，其中，缺血性心脏病死亡的人数达730万，占到13%左右，占死亡的人数第一位。溶栓疗法、介入治疗（PCI），和冠脉旁路移植术（PTCA）等血管再通术血运重建是治疗该类疾病的最有效手段。但缺血心肌在恢复血液灌注后仍会引起心肌的进一步损伤，进而引起一系列并发症，致使患者远期生存率及生活质量大大下降，研制能够发挥保护缺血和再灌注对心肌损伤的新型药物对于提高该类疾病患者的生存率和生活质量具有重要意义。

黄酮苷类化合物是在植物中分布非常广泛存在的一类天然产物，在植物体内多与糖结合成苷类。药理学研究表明该类化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤等作用，同时在预防和治疗冠心病、高血压及动脉硬化等心脑血管疾病方面也具有显著的疗效。近年来，从传统药用植物中分离天然黄酮苷类化合物研发新的心脏保护药物成为研究者关注的热点。

芹菜素-7-O-β-D-(-6''-p-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-(-6''-p-coumaroyl)-glucopyranoside)属黄酮苷类化合物，简称APG，可从毛茛科甘青铁线莲、唇形科广藿香及独一味等植物中提取。毛茛科铁线莲属植物甘青铁线莲(Clematis tangutica)，别名唐古特铁线莲，藏药名又称叶芒那布、叶濛。主要分布于青藏高原地区，根据《晶珠本草》和《藏药志》等典籍记载，其性辛、甘、温，祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤积聚。此外，甘青铁线莲作为复方制剂益心康泰胶囊的主药在治疗心脑血管疾病方面疗效显著。本发明人首次从甘青铁线莲分离得到黄酮苷类化合物APG，虽已有文献报道过其结构（详见：Itokawa H, Suto K, et al. Studies on a novel p-coumaroyl glucoside of Apigenin and on other flavonoids isolated from Patchouli (Labiatae). Chem Pharm Bull, 1981,29(1):254~256和 张爱军，任凤霞，等. 藏药独一味化学成分的研究，中国药学杂志，2011, 46(2):102~104）。但是综观国内外文献，均未见该化合物在治疗缺血性心肌损伤方面的应用。

发明内容

本发明的目的提供一种从甘青铁线莲中提取的黄酮苷类化合物在制备治疗心肌缺血性疾病药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的，一种黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中的应用，所述黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中的应用。

所述黄酮苷类化合物在制备治疗缺血性心脏病及其并发症药物中可以单独使用或与其他药物配合，其剂型是注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或颗粒剂。

所述的缺血性心脏病及其并发症包括心肌梗死、冠心病、心绞痛、心律失常、心室纤维化、心力衰竭、心肌缺血、心肌炎、动脉粥样硬化。

本发明的特点是：黄酮苷类化合物APG对心肌损伤具有明显的保护作用，且未见毒副作用，表明其可以作为新的治疗缺血性心脏病及其并发症的治疗和预防药物进行研究开发，为研制保护心肌缺血损伤的药物提供先导化合物。

附图说明

图1是化合物APG对MI/R损伤大鼠心肌梗死面积的影响。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

本发明中黄酮苷类化合简称为APG，其化学结构式如式I：

式I

APG的化学名称为芹菜素-7-O-β-D-(-6’’-p-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷 (apigenin-7-O-β-D-(-6''-p-coumaroyl)-glucopyranoside)，是从甘青铁线莲中分离的黄酮苷类化合物。

   APG对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护：

（1）试验材料

① 实验动物

雄性Sprague Dawley (SD)大鼠40只，体重250-280g。自由进食及饮水，25±2 ℃，由第四军医大学动物实验中心提供。

② 主要药品与试剂  

式I化合物APG，2,3,5–氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma Aldrich公司 美国）, 二甲基亚砜（DMSO，Sigma Aldrich公司 美国）。肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）（南京建成生物工程研究所）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝（Tetrazolium chloride，TTC）染色剂（中国医药集团上海化学试剂公司）；伊文思蓝（Evans Blue，EB）（美国Sigma-Aldrich公司）。

化合物APG的提取和分离方法：

以采自青海省黄南藏族自治州的甘青铁线莲全草为原料，阴干，经粉碎后，取4公斤粗粉，加入70%乙醇12 升加热回流提取，共提取3次，每次2小时。提取液过滤并合并，浓缩干燥得总提取物985.6 克。提取物分散于4 升水中，用石油醚萃取3次，每次4 升，萃取后的水相再用正丁醇萃取4次，每次4升，合并正丁醇萃取液，回收溶剂，得到正丁醇萃取部位168克。将正丁醇萃取部位经硅胶柱层析（薄层色谱用硅胶H，青岛海洋化工厂），以体积比为20:1:0.1~6:3:0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液为洗脱剂，梯度洗脱。按200 毫升为一个流份收集，并用薄层层析检测(展开剂采用体积比为7：3：1的氯仿-甲醇-水下层，显色剂为体积比1：4硫酸-乙醇溶液，喷显色剂后于105 ℃加热显色)，收集含如下式I化合物APG的第24~38流份。减压蒸干溶剂后得2.8克粗品，用体积比1：1的氯仿-甲醇溶解，经Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱(GE-Healthcare公司) 色谱，用体积比1：1的氯仿-甲醇进行洗脱，合并含如下式I化合物的第12~18流份，减压蒸干溶剂后得到如下式I化合物APG纯品1.2 克。

③主要仪器  

HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；BL-420S 多道生理记录仪（成都泰盟科技有限公司）；5417型低温高速离心机（Eppendorf公司）；COOLPIX S1型照相机（Nikon公司，日本）；680型酶标仪（BIO-RAD公司）。

（2）实验方案及结果

①动物分组

随机分为5组，每组8只

（1）假手术组（Sham）：0.9%氯化钠注射液

（2）溶剂对照组(Vehicle )：20%DMSO氯化钠溶液

（3）低剂量组(APG25) ：25 mg/kg

（4）中剂量组(APG50)：50 mg/kg

（5）高剂量组(APG100)：100 mg/kg

模型制作：

各组进行心肌缺血再灌注模型制备后（Sham组大鼠除了不结扎冠状动脉前降支血管，其他手术操作与模型制备组相同），于缺血前10min和再灌注前10min分别腹腔给药。APG高、中、低剂量组按照25、50、100 mg/kg腹腔注射给药。假手术组、模型组及模型+DMSO组注射等量溶剂。 

大鼠称重后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛，仰卧位固定，连接心电图监测，气管插管并接呼吸机（频率：75次/min；潮气量：8-9 mL；吸：呼=1:2），胸骨左缘旁纵行切开第3-5肋间做横行切口，剪开并挑起心包，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状动脉前降支(Left anterior descending coronary aery，LAD)为标志，于左心耳下方1-2 mm处进针、穿线（横跨左冠状动脉前降支），将一小硅胶管从丝线两端穿入，稳定10 min后结扎，缺血30 min后，再灌注3 h结束。成功标准：结扎LAD后心电图II导联ST段出现弓背向上抬高，T波高耸等为缺血成功；放松结扎线后，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功。

②心功能参数测定

再灌注结束前5分钟，通过多道生理记录仪监测大鼠心功能各指标。数据分析系统由计算机自动采集、记录并计算。

缺血前，各组大鼠的心功能指标值无明显差异（数据未提供）。再灌注结束时溶剂对照组与假手术组相比，左心室终末舒张压（LVEDP）显著升高（p＜0.05）；左室等容舒张期/收缩期心室压力上升速率（+dp/dvmax；-dp/dvmax）显著下降（p＜0.05）。给予APG处理后，中剂量和高剂量均能明显改善以上心功能指标，见表2。

表2 大鼠心肌缺血再灌注3h心功能恢复情况（, n=8）

^#P<0.01与Sham组比, ^* P <0.05与溶剂对照组比，^**P <0.01与溶剂对照组相比。

③ 心肌梗死面积测定

再灌注3 h后，再次结扎各组大鼠左冠状动脉前降支，从颈动脉迅速注入3%依文思蓝溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮肤蓝染后迅速摘除心脏，滤纸吸除心室腔中残余染液，-20℃冻至变硬。取出后自心尖向心底平行房室沟方向将其切成相等厚度的5片，2% TTC溶液（pH=7.4）37℃孵育10 min，4%多聚甲醛固定过夜。染色后白色代表梗死区（area of necrosis，AN），红色代表缺血但未梗死区，蓝色代表正常区，危险区（area at risk，AAR）为红色和白色面积之和。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。梗死程度采用梗死区面积（AN）与危险区面积（AAR）的比值表示。

大鼠缺血30 min再灌注3 h后，假手术组未见有梗死区域，模型组动物心肌出现明显的梗死，梗死区面积与危险区面积的比为（37.4±2.8）%。与经APG中、高剂量治疗后，大鼠心肌梗死面积分别降至（30.5±6.1）%和（23.1±4.1）%，与溶剂对照组相比具有显著性差异（p＜0.05），见图1，其中* p＜0.05 与 Vehicle组比较；**p＜0.01 与Vehicle组比较，n=8。

④ 血清生化指标测定  

再灌注3 h后，腹主动脉取血，离心（4000 r/min）12 min，分离血清，试剂盒检测CK-MB和LDH的活性，按照说明书操作。

与假手术组相比，模型组大鼠血清CK-MB和LDH水平明显增加（p＜0.05）。APG中、高剂量治疗组大鼠血清CK-MB和LDH水平明显下降，与模型组相比有统计学差异（p＜0.05），见表3。

表3 对大鼠心肌梗死面积、血清CK-MB和LDH的影响(，n=8)

其中，^# P<0.05与Sham组比，^* P<0.05与MI/R组比，^* *P<0.01与MI/R组比。

由以上结果可见，所述的式Ι化合物对大鼠冠状动脉前降支结扎法致心肌缺血再灌注模型造成的心肌损伤具有明显的保护作用，即：所述的式Ι化合物具有较好的抗缺血性心脏病药理活性，可用于制备治疗缺血性心脏病及其并发症的药物。所述的缺血性心脏病及其并发症包括心肌梗死、冠心病、心绞痛、心律失常、心室纤维化、心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌缺血、心肌炎、动脉粥样硬化。

实施例2

药物的制备：

注射剂配方：2 mg APG，50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0，总体积1 mL。制法：取实施例1式I化合物APG 10 mg，加50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0) 5 mL，在无菌条件下完全溶解，分别经过G3和G6玻砂过滤器过滤，灌封于1 mL安瓿中，100 ℃灭菌30分钟，得5支。

口服制剂配方：5毫克APG，50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。制法：取实施例1式I化合物APG 5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉，充分混匀后制粒，所制颗粒包装即得颗粒剂；所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂；所制颗粒直接压片，包薄膜衣，即得片剂。

   在临床应用时，以常规的制剂工艺，所述的式Ι化合物APG可以单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。

   本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。