一种狭叶金星蕨的人工繁殖方法

摘要

本发明公开了一种狭叶金星蕨人工快速繁殖的方法。方法通过狭叶金星蕨原叶体的诱导和培养，再将原叶体直接移栽并诱导孢子体的形成，然后进行孢子体的分割和栽培，完成狭叶金星蕨的人工繁殖。本发明在原叶体阶段直接分割移栽，然后诱导孢子体形成，免除了传统蕨类植物植物人工快速繁殖过程中孢子体驯化阶段，不仅大幅度降低了培养基的成本,而且显著提高了狭叶金星蕨孢子体的移栽繁殖效率，为该植物人工繁殖提供简单、高效的操作方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种狭叶金星蕨(Parathelypteris  angustifrons(Miq.)Ching)人工快速繁殖的方法，采用该工艺能够高效繁 殖狭叶金星蕨。

背景技术

金星蕨科(Thelypteridaceae)是真蕨亚纲中世界性的大科，包括20余 属600余种植物，广布世界热带和亚热带地区，少数种类产于温带地区，尤以 亚洲最多。多生于低海拔地区，极少热带产种类分布达海拔4500m处。我国 有金星蕨科植物18属，现知约365种，主产长江以南各省低山区，尤以华南 及西南的亚热带为多。民间该科药用植物多作清热解毒、消炎止痢和拔脓消肿 药，主要用于治疗痢疾、疥疮痈肿、跌打骨折及烧伤、烫伤等。金星蕨科药用 植物富含有黄酮类化合物、香豆素类、生物碱类、有机酸及脂类。涉及的药理 作用主要有抗肿瘤、抗菌消炎、驱虫、抗生育等。(张文霞等，2011)

狭叶金星蕨(Parathelypteris angustifrons(Miq.)Ching)是金星蕨 科金星蕨属植物，植株高25-35厘米。根状茎长而横走，粗约1.5毫米，先端 连同叶柄基部略被深棕色的披针形厚鳞片，叶近生。主要分布在产福建(鼓浪 屿)、台湾(台北)。生林下石上。分布于日本(本州、四国、九州)。

对金星蕨类植物的研究主要集中在分类鉴定、发育、化学成分和药理作用 方面；对狭叶金星蕨的研究，尤其是其繁殖方面更是少之又少。在金星蕨通过 组织培养进行金星蕨人工快速繁殖方面并没有相关的报道，而组织培养体系的 建立是植物进行遗传育种必要的技术平台。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种狭叶金星蕨人工繁殖方 法，该方法包括：

步骤一，将金星蕨原叶体分割成小块，然后将小块接种到含有生长素的青 苔基质中在适宜条件下培养形成孢子体，培养过程中青苔基质保持湿润状态；

步骤二，将步骤一中获得的孢子体分割后移栽到青苔基质中在适宜条件下 培养得到狭叶金星蕨。

优选的，步骤一中的小块大小为：0.3-0.6cm³。

优选的，所述含有生长素的青苔基质为0.5-1.5mg/L生长素水溶液饱和 过的青苔基质；所述生长素为NAA(a-萘乙酸)、IAA(3-吲哚乙酸)或IBA(吲 哚丁酸)。

优选的，步骤二中将孢子体分割成包含有2-4株孢子体的团块。

与传统蕨类植物人工快速繁殖方法相对比，本发明的工艺免去了孢子体驯 化阶段，显著提高狭叶金星蕨孢子体的移栽成活率，并节约人工繁殖成本，为 狭叶金星蕨的高效人工繁殖提供基础。

附图说明

图1是本发明的狭叶金星蕨人工快速繁殖工艺流程图，图中虚线表示传统 的蕨类植物人工繁殖方式，即孢子体在试管中形成(无菌环境)，然后进行移 栽；实线为本发明在原叶体阶段进行分割，再放置到试管外(青苔基质)中诱 导孢子体的形成，然后进行孢子体的移栽，不经过孢子体的驯化阶段。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明在传统蕨类植物人工快速繁殖的基础上建立了狭叶金星蕨的快速 繁殖，不经过孢子体驯化这一步骤，显著提高孢子体的移栽成活率，而且大幅 度降低了培养基的成本，为该植物乃至金星蕨类植物的种质改良和快速繁殖提 供高效的操作工艺。

参考图1，本发明狭叶金星蕨人工快速繁殖的方法，在常规蕨类植物人工 快速繁殖技术的基础之上，利用蕨类植物原叶体吸水、保湿的特点，模拟蕨类 植物自然的生长环境，在原叶体阶段将其分割移栽到活的青苔基质中继续生 长，原叶体的上面就会产生大量的孢子体。此方法和传统的试管内孢子体诱导 发相对比，具有移栽成活率高的特点，而且由于孢子体的诱导阶段是发生在试 管外基质中的，因此节约了人工培养时培养基的成本。本发明为狭叶金星蕨乃 至金星蕨类植物的人工繁殖和种质改良奠定技术基础和提供新思路。

经发明人研究发现，狭叶金星蕨孢子体按照常规的蕨类植物繁殖方式进行 人工繁殖时，孢子体从试管内向试管外移栽过程中，孢子体的移栽成活率非常 低(42％)，采用本发明所述的工艺方法进行繁殖时，孢子体的移栽成活率可以 达到96％。

本发明主要利用蕨类植物原叶体吸水保湿的特征，在原叶体阶段进行原叶 体的分割移栽，然后在试管外模拟野生环境进行狭叶金星蕨孢子体的诱导，再 将诱导出的孢子体分割移栽，这样孢子体的成活率显著提高到96％。

本发明金星蕨原叶体的获取可以采用常规方法获取。例如：取狭叶金星蕨 孢子囊，用氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培养基上，培养基中 不添加生长素或添加了0.2-1.0mg/L生长素。培养温度25℃±2℃，光照强度 为1000Lux、光周期12小时；培养60天后形成深绿色的原叶体。

本发明的适宜培养条件为适宜蕨类植物生长的条件。优选的，步骤一中的 适宜培养条件可采用培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为 2000Lux、光周期16小时；步骤二中的适宜培养条件可采用在温室中培养， 湿度大于65％，光照强度为3000Lux、自然光周期。

以下是发明人提供的实施例，以对本发明的具体方案作进一步解释说明。

实施例1：

(1)狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导：

将金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然后接种到被含有 0.5mg/L NAA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自来水浇透水。 培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16 小时。培养45天后，形成完整孢子体；

其中：狭叶金星蕨原叶体的获得方法为：取狭叶金星蕨孢子囊，用氯化汞 溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培养基上，培养基中添加了0.5mg/L NAA。 培养温度25℃±2℃，光照强度为1000Lux、光周期12小时；培养60天后形 成深绿色的原叶体；

(2)狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

将步骤(1)获得的孢子体带根进行分割，分割成包含有3株孢子体的团 块，去掉多余的原叶体，移栽到活青苔基质中，然后放置在温室中培养。大棚 湿度大于65％，光照强度为3000Lux、光周期16小时。

对照例：

(1)狭叶金星蕨原叶体的获得

取狭叶金星蕨孢子囊，用氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培 养基上，培养基中添加了0.5mg/L NAA。培养温度25℃±2℃，光照强度为1000 Lux、光周期12小时；培养60天后形成深绿色的原叶体。每块原叶体的平均 鲜重达到526mg。

(2)狭叶金星蕨孢子体的诱导

将步骤(1)获得的金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然 后接种到含有1.0mg/L NAA的MS培养基中诱导孢子体的形成，培养45天后， 形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率为52％。

(3)狭叶金星蕨孢子体的驯化和移栽

将通过步骤(2)获得的狭叶金星蕨孢子体，将整个培养瓶转移到大棚中 培养，慢慢打开瓶盖，在第七天完全打开瓶盖。小心从培养瓶中取出孢子体， 去掉多余的原叶体，洗干净上面的培养基，然后移栽到水饱和青苔基质中。大 棚湿度大于65％，光照强度为3000Lux、自然光周期。培养45天后，狭叶金 星蕨孢子体的移栽成活率平均为42％。

实施例2：

1、狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导

将狭叶金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然接种到被含有 0.5mg/L IAA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自来水浇透水。 培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16 小时。培养45天后形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率达到82％；其中，狭 叶金星蕨原叶体的获得方法为：取狭叶金星蕨孢子囊，用氯化汞溶液进行表面 灭菌，然后接到无激素的MS固体培养基上。培养温度25℃±2℃，光照强度为 1000Lux、光周期12小时；培养60天后形成深绿色的原叶体。每块原叶体的 平均鲜重达到212mg。

2、狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

将步骤1获得的孢子体带根进行分割，分割成包含有3株孢子体的团块， 去掉多余的原叶体，移栽到活青苔基质中，然后放置在温室中培养。大棚湿度 大于65％，光照强度为3000Lux、自然光周期。45天以后，移栽成活率达到 96％。

实施例3：

1、狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导

将狭叶金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然接种到被含有 1.0mg/L IAA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自来水浇透水。 培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16 小时。培养45天后形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率达到91％。

其中，狭叶金星蕨原叶体的获取方法是：取狭叶金星蕨孢子囊，用氯化汞 溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培养基上，培养基中添加了0.2mg/L NAA。 培养温度25℃±2℃，光照强度为1000Lux、光周期12小时；培养60天后形 成深绿色的原叶体。每块原叶体的平均鲜重达到361mg。

2、狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

同实施例2。

实施例4：

1、狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导

将狭叶金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然接种到被含有 1.0mg/L NAA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自来水浇透水。 培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16 小时。培养45天后形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率达到98％。

其中，狭叶金星蕨原叶体的获取方法是：取狭叶金星蕨孢子囊，用氯化汞 溶液进行表面灭菌，然后接到无激素的MS固体培养基上，培养基中添加了1.0 mg/L NAA。培养温度25℃±2℃，光照强度为1000Lux、光周期12小时；培 养60天后形成深绿色的原叶体。每块原叶体的平均鲜重达到463mg。

2、狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

将步骤1获得的孢子体带根进行分割，分割成包含有2株孢子体的团块， 去掉多余的原叶体，移栽到活青苔基质中，然后放置在温室中培养。大棚湿度 大于65％，光照强度为3000Lux、自然光周期。45天以后，移栽成活率达到 84％。

实施例5：

1、狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导

将实施例1获得的金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然接 种到被含有1.5mg/L NAA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自 来水浇透水。培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、 光周期16小时。培养45天后形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率达到89％。

2、狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

将步骤1获得的孢子体带根进行分割，分割成包含有4株孢子体的团块， 去掉多余的原叶体，移栽到活青苔基质中，然后放置在温室中培养。大棚湿度 大于65％，光照强度为3000Lux、自然光周期。45天以后，移栽成活率达到 93％。

实施例6：

1、狭叶金星蕨原叶体的分割和孢子体的诱导

将实施例1获得的金星蕨原叶体在无菌环境中分割成0.5cm³的小块，然接 种到被含有1.0mg/L IBA自来水饱和过的活青苔基质中培养，3周后，再用自 来水浇透水。培养环境中湿度大于75％，温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、 光周期16小时。培养45天后形成完整的孢子体，孢子体的诱导频率达到90％。

2、狭叶金星蕨孢子体的分割和移栽：

同实施例2。