一种由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束及其合成方法与应用

摘要

本发明公开了一种由两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束及其合成方法与应用，属于聚合物载体与缓控释材料技术领域。所述由两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束的结构如化学式Ⅰ所示。利用两亲性嵌段共聚物PEG-b-PNSM在水溶液中自组装形成胶束，再加入交联剂形成的交联胶束可以在体内输送难溶于水的药物(如抗肿瘤紫杉醇)。本发明的核交联胶束具有良好的酸敏感性，生物相容性和生物可降解性，在靶向治疗领域具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束及其合成方法与应用，属于聚合物载体与缓控释材料技术领域。 

背景技术

近年来，聚合物胶束因其高效、长效和安全等特点，在输送抗癌药物等方面引起了广泛的研究兴趣。然而，胶束的应用却受到纳米结构不稳定的限制，静脉注射给药后，胶束浓度降低，低于临界胶束浓度(CMC)后发生胶束的分解。因此提高胶束的稳定性是一个很重要的研究方向。 

核交联胶束可以作为固定胶束的一种有效手段(中国专利CN 101265311A)，然而交联胶束具有高度的稳定性，不利于包含在其中的药物的释放，从而影响治疗效率，因此Wooley’s等研究制备出响应性交联胶束。通过加入pH响应型交联剂，使交联胶束在肿瘤组织降解，从而达到靶向给药的作用。pH响应型交联剂中含有对酸敏感的化学键，其中以原酸酯键为敏感基团的交联胶束研究较少。 

发明内容

本发明目的就是为了提供一种由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束及其合成方法与应用。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

本发明由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束的结构如化学式Ⅰ所示： 

式中，X表示数值20-120。 

本发明的由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束的合成线路(化学式Ⅰ)如下所示： 

本发明通过嵌段共聚物聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N-琥珀酰亚胺酯(PEG-b-PNSM)在水溶液中自组装形成胶束结构，根据亲疏水嵌段比例不同导致胶束尺寸不同，并在自组装过程中负载药物，然后加入交联剂4，4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)(交联剂制备方法如专利CN103804339A所述)制得负载药物的交联胶束。 

本发明由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束的合成方法，包括以下步骤： 

(1)嵌段共聚物胶束的制备 

将嵌段共聚物聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N-琥珀酰亚胺PEG-b-PNSM溶于有机试剂中，然后搅拌滴加10-20mL浓度为50mM，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，滴加完毕后剧烈搅拌1h，溶液转移至截留分子量为3500的透析袋内，以蒸馏水作 为透析液透析48h，然后将袋内溶液转移至50mL离心管内，冷冻干燥，得到嵌段共聚物胶束； 

(2)嵌段共聚物交联胶束的制备 

将上述制备好的嵌段共聚物胶束溶于有机溶剂与水的等体积混合溶剂中，加入交联剂4，4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)，继续搅拌48h，溶液转移至截留分子量为3500的透析袋内，以蒸馏水作为透析液透析48h，袋内溶液冷冻干燥，得到嵌段共聚物交联胶束 

所述的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N-琥珀酰亚胺PEG-b-PNSM与交联剂4，4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)的投料质量比为(100-0.01)：1。 

所述的有机溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或者二氧六环。 

一种聚合物交联胶束药物组合物，包括由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的嵌段聚合物核交联胶束，以及至少一种掺入在该胶束中的活性剂；其中所述的活性剂选自抗炎药、癌症化疗药物、免疫抑制剂、代谢药物、抗过敏药物、肝病治疗药物、神经系统治疗药物或者循环系统疾病治疗药物。 

将所述的活性剂掺入到两亲性嵌段聚合物交联胶束中的方法包括搅拌、加热、超声波、溶剂蒸发或者渗透处理。 

所述的癌症化疗药物选自紫杉醇、阿霉素、环孢霉素、喜树碱或者卡莫司汀。 

本发明的有益效果： 

本发明合成的由含两个原酸酯五元环的交联剂制备的核交联胶束具有良好的酸敏感性，生物相容性和生物可降解性，可以在酸性环境下降解迅速，能够较快的释放包埋在其中的药物，在靶向治疗领域具有良好的应用前景。 

附图说明

图1为实施例2中嵌段共聚物胶束的临界胶束浓度。 

图2为实施例3中交联胶束的核磁验证。 

图3为实施例3中交联胶束的DLS验证；其中，图A、B、C为稀释5000倍后的交联胶束(CLM1、CLM2、CLM3)及未交联胶束(NCLM1、NCLM2、NCLM3)的尺寸变化，其起始胶束浓度均为0.5mg/mL。 

图4为实施例4中嵌段共聚物胶束pH依赖的尺寸变化。 

图5为实施例5中嵌段共聚物胶束体外细胞毒性试验；其中，图A、图B 分别为MTT法测定的未交联胶束NCLM及交联胶束CLM作用于NIH 3T3的细胞毒性。 

图6为实施例6中嵌段共聚物胶束体外药物释放试验。 

具体实施方式

实施例1 

(1)嵌段共聚物胶束的制备： 

将嵌段共聚物PEG-b-PNSM(PEG-b-PNSM₄₅，PEG-b-PNSM₉₀和PEG-b-PNSM₁₃₀)100mg溶于1mL DMSO(加少量三乙胺)，然后搅拌滴加10mL浓度为50mM，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，滴加完毕后剧烈搅拌1h，溶液转移至截留分子量为3500的透析袋内，以蒸馏水水(加少量三乙胺)作为透析液透析48h,然后将袋内溶液转移至50mL离心管内，冷冻干燥，得到嵌段共聚物胶束； 

由嵌段共聚物PEG-b-PNSM₄₅，PEG-b-PNSM₉₀和PEG-b-PNSM₁₃₀分别制得的胶束命名为NCLM1，NCLM2和NCLM3； 

(2)嵌段共聚物交联胶束的制备： 

将上述制备好的嵌段共聚物胶束溶于DMSO与水的混合溶剂(v:v＝1:1)中，加入交联剂4，4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)(100mg)，继续搅拌48h，溶液转移至截留分子量为3500(Mw＝3500)的透析袋内，以蒸馏水(含少量三乙胺)作为透析液透析48h，袋内溶液冷冻干燥，得到嵌段共聚物的交联胶束； 

由胶束NCLM1，NCLM2和NCLM3制得的交联胶束分别命名为CLM1，CLM2和CLM3。 

实施例2 

聚合物的临界胶束浓度以采用荧光光谱法，以尼罗红作为荧光探针来测定。其具体操作方法为：先于棕色小瓶内加入20μL浓度为1.0×10^-4mol/L尼罗红的丙酮溶液，空气中放置直至丙酮完全挥发，常温真空干燥2h。然后用50mM pH＝7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1×10^-4～2mg/mL的共聚物PEG-b-PNSM溶液，于之前处理的棕色小瓶内分别加入5mL不同浓度的共聚物溶液，避光孵育12h后，采用荧光分光光度计测定尼罗红在聚合物溶液中的荧光强度。激发 波长设为550nm，激发带宽和发射带宽为2.0nm，测定共聚物溶液样品在560-720nm范围的发射光谱。找出各聚合物溶液样品在最大荧光强度时的波长，以聚合物浓度为横轴，对应最大荧光强度时的波长为纵轴作图，找出曲线变化变化点的浓度值，求出共聚物的CMC值。 

实施例3 

交联胶束的验证： 

(1)核磁验证。 

将交联胶束溶解于pH＝7.4和pH＝4的氘代磷酸盐缓冲液中，核磁检测可知在pH＝7.4的条件下，只能观察到亲水性外壳的质子峰，推测胶束的形成，在pH＝的条件下，8.19和8.25ppm处产生了新的质子峰，推测为原酸酯的降解峰，由于游离的原酸酯在交联胶束冻干之前已经透析出去，从而验证了交联胶束的形成。 

(2)DLS验证 

将交联胶束和未交联胶束分别至于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，配成0.5mg/ml的胶束溶液，同时将各溶液分别稀释5000倍，于马尔文粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)测量胶束稀释前后的尺寸变化。分析图3可知，胶束平均尺寸分别为98,113和122nm，未交联胶束尺寸分别为142,183和208nm交联胶束的尺寸明显降低，且胶束浓度稀释5000倍后，交联胶束的尺寸变化不大，而未交联胶束尺寸降为1nm左右，此时胶束结构被破坏，胶束散开为聚合物，这可能是由于胶束浓度稀释后低于临界胶束浓度。 

实施例4 

聚合物胶束尺寸测量及依赖pH尺寸变化的测定： 

将共聚物交联胶束P1-P3分别于pH＝7.4，5的磷酸盐缓冲液中，配置成2mg/mL的胶束溶液，溶液过0.45微米滤头，各溶液分别在设置时间内，于马尔文粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)测量其共聚物胶束尺寸变化，在pH＝7.4的情况下，交联胶束的粒径基本保持不变，而在pH＝5的情况下，胶束尺寸不断增大。由图2可知，原酸酯降解后生成的降解产物为亲水性的，但是在图2的核磁图中，可以找到未反应完全地NSM上的质子峰，推测原酸酯不断降解的同时，胶束结构不断膨胀，但由于NSM的疏水性，胶束任然保持着球状结构。 

实施例5 

细胞毒性试验： 

NIH 3T3细胞(10000个/孔)接种于96孔培养板，在37℃和5％二氧化碳条件下培养24小时，细胞融合度60-80％。将未交联胶束和交联胶束溶液加入上述已经接种，培养NIH 3T3细胞的96孔板，继续培养24小时。每孔加入20微升MTT(5mg/mL)，4小时后吸取培养基，每孔加入150微升DMSO，振摇10分钟，于酶标仪(Thermo Scientific多功能酶标仪)，570nm测定A值。按一下公式计算细胞生存率：细胞生存率(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％。从图5可以看出，NIH 3T3细胞的存活率相比于对照组，即使在较高浓度5mg/mL的条件下，细胞存活率都在80％，证明交联胶束和未交联胶束几乎没有细胞毒性。 

实施例6 

将30mg嵌段共聚物PEG-b-PNSM与疏水性药物模型药物尼罗红10mg溶解于1mL二甲亚砜中，搅拌溶解混合均匀，然后缓慢滴加10倍体积的磷酸盐缓冲液，滴加完毕后接续搅拌1h，加入交联剂后继续搅拌48h,溶液转移至截留分子量为3500透析袋内透析2天，离心取上清至透析袋内，溶液冷冻干燥，得到负载模型药物尼罗红的交联胶束。将该交联剂胶束各取5mg，分别溶解于5mL50mM pH＝7.4和pH＝5的磷酸缓冲液中，转移至截留分子量为20000的透析管内，并置于对应的缓冲液300mL内透析。在预定的时间测定尼罗红从胶束中释放的量。从图6中可以看出，负载的模型药物尼罗红在微酸环境pH＝5中释放较pH＝7.4的条件下较快，在62h时，尼罗红几乎完全释放。