用于靶向递送的、与小分子整联蛋白拮抗剂共价连接的壳聚糖

摘要

本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物：

说明书

本发明涉及用于靶向递送的共价连接于小分子整联蛋白拮抗剂的壳聚 糖聚合物衍生物。这些小分子整联蛋白拮抗剂中的一些结合于VLA-4(极迟 抗原-4)二聚体(也称为整联蛋白α-4-β-1二聚体或α4β1)。本发明的其它小分 子整联蛋白拮抗剂结合于α-V-β-3(αVβ3)二聚体。此类壳聚糖连接的整联蛋 白可用作靶向配体，用于递送其它小分子、肽和核酸。例如，此类壳聚糖 可用于形成寡核苷酸或siRNA纳米粒子，这些纳米粒子有助于将此类寡核 苷酸或siRNA选择性递送至表达此类整联蛋白受体的细胞，由此通过RNA 干扰(RNAi)或其它作用机制来改变或预防靶基因的表达。

VLA-4(极迟抗原-4，也称为α4β1)为整联蛋白二聚体。其主要包含由 CD49d(α)和CD29(β)组成的两个亚单元。VLA-4在白细胞质膜上表达，其 结合于血管上的VCAM-1(在由细胞因子激活之后)，帮助白细胞附着至血 管内皮(促成动脉粥样硬化或其它炎性疾病)。某些癌细胞也可表达VLA-4， 其结合于粘附至内皮的VCAM-1(增加转移的风险)。因此，结合于VLA-4 的化合物可阻断与VCAM-1的相互作用，潜在地治疗或预防由这种相互作 用介导的疾病。可选择地，结合于VLA-4的化合物可用于递送制剂以将药 物、核酸或其它治疗性化合物递送至表达VLA-4的组织或细胞，用于治疗 或预防疾病。

本发明涉及用于靶向递送的、共价连接于小分子整联蛋白拮抗剂的壳 聚糖聚合物衍生物。这些小分子整联蛋白拮抗剂中的一些结合于VLA-4(极 迟抗原-4)二聚体(也称为整联蛋白α-4-β-1二聚体或α4β1)。本发明的其它小 分子整联蛋白拮抗剂结合于α-V-β-3(αVβ3)二聚体。此类壳聚糖连接的整联 蛋白可用作靶向配体，用于递送其它小分子、肽和核酸。例如，此类壳聚 糖可用于形成寡核苷酸或siRNA纳米粒子，这些纳米粒子有助于将此类寡 核苷酸或siRNA选择性递送至表达此类整联蛋白受体的细胞，由此通过 RNA干扰(RNAi)或其它作用机制来改变或预防靶基因的表达。

发明背景

VLA-4(极迟抗原-4，也称为α4β1)为整联蛋白二聚体。其主要包含由 CD49d(α)和CD29(β)组成的两个亚单元。VLA-4在白细胞质膜上表达，其 结合于血管上的VCAM-1(在由细胞因子激活之后)，帮助白细胞附着至血 管内皮(促成动脉粥样硬化或其它炎性疾病)。某些癌细胞也可表达VLA-4， 其结合于附着至内皮的VCAM-1(增加转移的风险)。因此，结合于VLA-4 的化合物可阻断与VCAM-1的相互作用，潜在地治疗或预防由这种相互作 用介导的疾病。可选择地，结合于VLA-4的化合物可用于递送制剂以将药 物、核酸或其它治疗性化合物递送至表达VLA-4的组织或细胞，用于治疗 或预防疾病。

整联蛋白αVβ3型为玻连蛋白受体[Hermann,P.等人，“The vitronectin  receptor and its associated CD47molecule mediates proinflammatory  cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23” [The Journal of cell biology144(1999):767–75]。它由两个组分整联蛋白αV 和整联蛋白β3(CD61)组成，并且由血小板以及其它细胞类型表达。已显示 αVβ3抑制剂如伊瑞西珠(etaracizumab)可用作抗血管生成剂。可选择地， 结合于αVβ3的化合物可用于递送制剂以将药物、核酸或其它治疗性化合物 递送至表达αVβ3的组织或细胞，用于治疗或预防疾病。

RNA干扰是一种众所周知的过程，其中信使RNA(mRNA)至蛋白质的 翻译通过互补或部分互补寡核苷酸如小干扰RNA(siRNA)、短发夹 RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义寡核苷酸的缔合或结合被干扰。 siRNA是双链RNA分子，通常为19-25个核苷酸长度，与细胞质中称为RISC (RNA-诱导的沉默络合物)的一组蛋白质缔合。RISC最终分离双链siRNA， 允许一条链与mRNA分子的互补或部分互补部分结合或缔合，之后mRNA 被RISC破坏或另外被阻止翻译-因此遏抑所编码蛋白质或基因产物的表 达。

在治疗应用(尤其用于人的系统性施用)中使用核酸如siRNA的问题之 一在于将核酸递送至：(1)特定的靶组织或细胞类型以及(2)那些细胞的细胞 质(即其中mRNA存在并被翻译成蛋白质)。部分递送问题是基于这样的事 实：核酸带负电且易被降解(尤其当未被修饰时)，被肾脏有效地过滤，且 不能容易地独自转运至细胞的细胞质。因此，大量研究已专注于用包括脂 质体、胶束、肽、聚合物、缀合物和适体的各种载体和制剂来解决递送问 题。参见Ling等人，Advances in Systemic siRNA Delivery,Drugs Future 34(9):721(2009年9月)。一些更有前景的递送媒介物已涉及包括脂质纳米 粒子的脂质系统的使用。参见Wu等人，Lipidic Systems for In Vivo siRNA  Delivery,AAPS J.11(4):639–652(2009年12月)；Hope等人的国际专利申请 公布No.WO2010/042877(“Improved Amino Lipids And Methods For the  Delivery of Nucleic Acids”)。但是，使用基于脂质的纳米粒子(LNP)的临床 试验在某种程度上受以下因素的限制：安全性、抗体调理作用和吞噬、以 及在静脉内施用后不能递送核酸如siRNA至除肝和肺之外的器官。

由于温和地带正电的寡聚物与阴离子DNA和/或siRNA的缔合，壳聚糖 自发地与DNA和siRNA形成络合物。已显示壳聚糖介导体外转染并且在 10％血清中敲除siRNA靶向的mRNA。从内体隔室释放siRNA的作用机制 是未知的，但是它被认为在内体隔室成熟时随着其酸化而发生。也已报道 壳聚糖具有粘膜黏着性。壳聚糖是生物可降解的，且已报道其在大鼠中的 口服LD50为16g/kg。其已被批准用于人创伤愈合治疗，且其目前在临床试 验中用于增强肽经由肺的递送。报道了壳聚糖用于递送寡核苷酸的用途(参 见国际专利申请公布No.WO2008/031899、WO2010085959、 WO2009012786和WO2009006905)。在这些情况下，壳聚糖不含有靶向配 体。

已在较小范围内报道了具有生物可降解聚合物的靶向配体的使用。已 报道了共价连接于壳聚糖、用于递送siRNA的叶酸的用途(Jiang,H.-L.等 人，“The suppression of lung tumorigenesis by aerosol-delivered  folate-chitosan-graft-polyethylenimine/Akt1shRNA complexes through  the Akt signaling pathway”Biomaterials(2009),30,5844-5852)。还参见 Rudzinski,W.E.和Aminabhavi,T.M.“Chitosan as a carrier for targeted  delivery of small interfering RNA”International Journal of Pharmaceutics 399(2010):1-11。尽管也已报道了整联蛋白靶向肽用于靶向递送壳聚糖 -siRNA纳米粒子的用途(Han,H.D.等人，“Targeted gene silencing using  RGD-labeled labeled chitosan nanoparticle”Clinical Cancer Research (2010),16,3910-3922)，但是对用于靶向递送治疗剂的、包括小分子壳聚糖 衍生物缀合物的载体和制剂的进一步改进仍有需求。

发明概述

本发明涉及包含三个单体的式I壳聚糖聚合物衍生物：

其中单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价连接， 其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中Y、R1、 R2和n在详述和权利要求中所定义。此外，本发明涉及连接至此类聚合物 的缀合物和组合物，用于改进小分子、肽和核酸至表达整联蛋白α4β1(极迟 抗原-4)二聚体或αVβ3二聚体的靶细胞的递送，以用于各种治疗和其它应 用。本发明还涉及制备和使用此类聚合物、缀合物和组合物的方法。

附图简述

图1示出用壳聚糖-siRNA纳米粒子对A549细胞中Aha1mRNA敲低(相 对于作为对照的GAPDAH RNA)的柱状图，其中壳聚糖被αVβ3小分子拮抗 剂共价衍生。壳聚糖随小分子已被负载至壳聚糖寡聚物可用反应性氨基末 端的程度而变化，然后与siRNA络合。

图2示出用壳聚糖-siRNA纳米粒子对KB细胞中Aha1mRNA敲低(相对 于作为对照的GAPDAH RNA)的柱状图，其中壳聚糖被αVβ3小分子拮抗剂 共价衍生。壳聚糖随小分子已被负载至壳聚糖寡聚物的可用反应性氨基末 端的程度而变化，然后与siRNA络合。

图3示出用壳聚糖-siRNA纳米粒子对MDA-MB-435细胞中的Aha1 mRNA敲低(相对于作为对照的GAPDAH RNA)的柱状图，其中壳聚糖被 αVβ3小分子拮抗剂共价衍生。壳聚糖随小分子已被负载至壳聚糖寡聚物的 可用反应性氨基末端的程度而变化，然后与siRNA络合。

发明详述

除非另有指示，否则描述和权利要求中使用的下列特定术语和短语如 下定义：

术语“部分”是指原子或化学键合的原子的组，其与另一原子或分子 通过一个或多个化学键连接、由此形成分子的一部分。例如，式I的变量Y、 R1和R2是指在指示的地方通过共价键连接于式I中所示结构的部分。

除非另有指示，否则术语“氢”是指氢原子的部分(-H)而不是H2。

术语“烷基”是指具有1至25个碳原子的脂肪族直链或支链饱和烃部分。

术语“TFA”是指三氟乙酸。

除非另有指示，否则术语“该式化合物”或“通式化合物”或“多种 该式化合物”或“多种通式化合物”意指选自由该式定义的化合物属种的 任何化合物(包括任何此类化合物的任何药学上可接受的盐或酯，如未另外 指出的话)。

壳聚糖是一种天然生物聚合物，以由β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰化 单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的线性多糖形式出现；乙酰化 和游离氨基-葡糖胺部分是无规排序的。壳聚糖具有很多生物医学应用。壳 聚糖也通过几丁质的脱乙酰化而制得。不同形式的壳聚糖的特征在于壳聚 糖制品中不同寡聚物集合的脱乙酰度(％DA)以及平均分子量(例如MW >150KDa)。多分散性与制品中不同分子量壳聚糖的多样性有关。据信壳聚 糖的氨基末端具有pKa～6.5。用立体化学定义寡聚体。

壳聚糖聚合物包含无规排序的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺和N-乙酰基 β-(1-4)-连接的D-葡糖胺部分。在β-(1-4)-连接的D-葡糖胺的情况下，可根据 pH对氨基质子化。在用靶向配体对一种或多种这些壳聚糖单体的胺基团衍 生化的情况下，聚合物则由这些衍生化单体的无规排列组成。为了指示本 发明的壳聚糖聚合物衍生物的单体的无规排列，属种结构含有字母X¹和 X⁴，其指示单体以β-1-4键联、在那些位置之间通过单个氧原子彼此共价连 接，其中X¹和X⁴表示任何立体化学的羟基的聚合物末端除外。因此，在指 示式I中单体之间的连接点时，糖类的取向必须为β-(1-4)-连接。

术语“药学上可接受的盐”是指保留游离碱或游离酸的生物学效力和 性能的那些盐，从生物学或其它观点看来它们不是不合乎需要的。可与无 机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等、优选盐酸和有机酸如乙酸、 丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、琥珀酸、富马 酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对 甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等形成盐。此外，盐可通过将无机碱或有机 碱加入至游离酸来制备。源自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、 钙和镁盐等。源自有机碱的盐包括但不限于仲胺、伯胺和叔胺、取代胺、 包括天然存在的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂如异丙胺、三甲胺、 二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、 聚胺树脂等的盐。根据取代模式，本发明化合物也可以两性离子形式存在。

本发明化合物可以以药学上可接受的盐形式存在。本发明化合物也可 以以药学上可接受的酯(即用作前药的式I酸的甲酯和乙酯)存在。本发明化 合物也可被溶剂化，即水合化。溶剂化可在制造工艺过程中实现或可发生， 即由于最初无水式I化合物的吸湿特性(水合)的结果。

具有相同分子式但它们原子键合的性质或顺序或它们原子排列不同的 化合物被称为“异构体”。它们原子空间排列不同的异构体被称为“立体 异构体”。非对映异构体为在一个或更多个手性中心具有相反构型的立体 异构体，其不是对映异构体。具有一个或更多个不对称中心的彼此为不可 重叠镜像的立体异构体被称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心 时，例如如果碳原子与四个不同基团键合，那么一对对映异构体是可能的。 对映异构体可通过其一个或多个不对称中心的绝对构型表征并且由Cahn、 Ingold和Prelog的R-和S-定序规则描述，或通过分子使偏振光平面旋转的方 式表征且被指定为右旋或左旋(即分别被指定为(+)或(-)-异构体)描述。手性 化合物可以以个别对映异构体或作为其混合物形式存在。含有等量比例的 对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。

术语“治疗有效量”的siRNA制剂意指有效预防、减缓或改善疾病的 症状或者延长所治疗受试者存活的siRNA化合物的量。治疗有效量的确定 在本领域技术人员的技能之内。根据本发明的化合物的治疗有效量或剂量 可在宽限度内变化，并且可以以本领域已知的方式来确定。将调节此类剂 量来满足在每种特定情况下的个体需求，包括要施用的具体化合物、施用 途径、要治疗的疾患、以及要治疗的患者。日剂量可以作为单次剂量或以 分份剂量来施用，或者用于胃肠外施用，它可以作为连续输注给予。

术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任意和所有 材料，包括溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收 延迟剂，以及与药物施用相容的其它材料和化合物。除了与活性化合物不 相容的任何常规媒介物或试剂以外，涵盖其在本发明组合物中的应用。还 可以将补充性的活性化合物掺入所述组合物中。

详细地，本发明涉及式I的三个单体的壳聚糖聚合物衍生物：

其中单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价连接， 其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的酰胺-丙酰基-巯基-马来酰亚胺-丙酰基-酰胺(Pr-S-Mal)：

和

(2)下式的琥珀酸酰胺(Suc)：

R1选自下组：

(1)下式的αVβ3的整联蛋白拮抗剂：

及其药学上可接受的盐和酯，其中m为0或1；且

(2)下式的α4β1的整联蛋白拮抗剂：

及其药学上可接受的盐和酯，其中为：

且

R2为氢或甲基，且n为8-25。

如上述结构中所用，虚线“----”或符号“”用于指示结构或部分通过共 价键连接于基础分子的地方。此外，与虚线或上述符号组合使用的短语“连 至PEG”或“连至壳聚糖”或类似语言，指示存在多个连接点时结构或部 分连接于基础分子的地方或结构或部分如何连接于基础分子。

例如，在特定实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其 中Y为酰胺-丙酰基-巯基-马来酰亚胺-丙酰基-酰胺：

其中“连至壳聚糖”和“连至PEG”是指如式IA中所示的分子的连接点， 其中X¹、X⁴、R1、R2和n如在式I中所定义：

在其它具体的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其 中Y为琥珀酸酰胺：

如下式IB中所示，其中X¹、X⁴、R1、R2和n如在式I中所定义：

在其它具体的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其 中R1为下式的αVβ3整联蛋白拮抗剂：

或其药学上可接受的盐或酯，其中m为0或1，如下式IC中所示，其中X¹、 X⁴、Y、R2、m和n如在式I中所定义：

在其它具体的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其 中R1为下式的α4β1整联蛋白拮抗剂：

或其药学上可接受的盐或酯，其中G如在式I中所定义，

如下式ID中所示，其中X¹、X⁴、Y、R2、m和n如在式I中所定义：

R1基团的共价键连点使得整联蛋白拮抗剂与整联蛋白受体的结合的 亲和性并未显著减少。

本发明还涉及连接于式I的壳聚糖聚合物衍生物的缀合物以及含有式I 的壳聚糖聚合物衍生物的组合物。在特定的实施方案中，本发明的壳聚糖 聚合物衍生物用于产生配制和递送siRNA的纳米粒子，导致向表达α4β1和/ 或αVβ3二聚体的靶细胞细胞质的递送改善。本发明还涉及制备和使用此类 缀合物和组合物的方法。本发明的壳聚糖聚合物衍生物可用作改善药物、 核酸或其它治疗性化合物至表达α4β1和αVβ3二聚体的组织或细胞递送的 缀合物和组合物的组分。在特定的实施方案中，本发明涉及含有本发明的 壳聚糖聚合物衍生物的纳米粒子制剂，其可用于将siRNA递送至表达α4β1 和αVβ3二聚体的靶细胞的细胞质，以通过RNA干扰来抑制某些蛋白质的表 达。在更特定的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其在 用于治疗癌症或炎症疾病的可将siRNA有效地递送至表达α4β1和αVβ3二 聚体的肿瘤细胞和其它细胞类型的制剂中使用。此类缀合物、组合物和制 剂是更有效的，且显示与缺少本发明壳聚糖聚合物衍生物的类似制剂相比 改善的敲低能力。

当使用壳聚糖及其衍生物时，脱乙酰度是用于控制的重要方面。优选 地，壳聚糖具有相对高的脱乙酰度。因此，在一个实施方案中，壳聚糖具 有至少60％的脱乙酰度。

壳聚糖的分子量优选高于10kDa。在另一个实施方案中，分子量高于 50kDa，且甚至更优选高于100kDa的分子量。

另一重要的参数是所谓的N:P比率，在本文被定义为碱性(非乙酰化或 酰化)壳聚糖氨基(N)与RNA磷酸基团(P)的比率。在优选实施方案中，含有 本发明壳聚糖聚合物衍生物的纳米粒子以大于3至50的N:P比率形成。上文 提及的参数均可用于控制所形成纳米粒子的特性。在前它实施方案中， N:P比率至少为20。当使用高N:P比率和低RNA浓度时，可形成包含松散结 合的壳聚糖的纳米粒子。

本领域具有技能的科学家理解如何操纵参数如siRNA和衍生化壳聚糖 的浓度来产生纳米粒子。在一个实施方案中，RNA溶液的浓度为至少30 nM。

在特定的实施方案中，本发明涉及本发明的壳聚糖聚合物衍生物，其 中式I中的R1为：

或其药学上可接受的盐和酯，其中m为0或1。

在其他实施方案中，本发明涉及本发明的壳聚糖聚合物衍生物，其中 式I中的R1为：

或其药学上可接受的盐和酯，其中：

为

在更特定的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其中：

为

在其他实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其中：

为

在其他实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其中：

为

在其他实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其中：

为

在其他实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物，其中m为 0。

在更特定的实施方案中，本发明涉及选自下组的式I的壳聚糖聚合物衍 生物：

Cs(AK)-αvβ3配体2(壳聚糖衍生物A)，负载有0.15％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的2.5％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(AK)-αvβ3配体2(壳聚糖衍生物B)，负载有0.21％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的2.5％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(AK)-αvβ3配体2(壳聚糖衍生物C)，负载有0.76％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的2.5％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-αvβ3配体3(壳聚糖衍生物D)，负载有0.3％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-αvβ3配体3(壳聚糖衍生物E)，负载有0.6％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-αvβ3配体3(壳聚糖衍生物F)，负载有1.9％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-αvβ3配体3(壳聚糖衍生物G)，负载有6％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-αvβ3配体3(壳聚糖衍生物H)，负载有5.0％的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-VLA₄配体1(壳聚糖衍生物I)、用20％的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲 酰基氨基)苯基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢 吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸衍生的14％N-乙酰 基-壳聚糖；

Cs(NM)-VLA₄配体3(壳聚糖衍生物J)，用18％的 `(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰 基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰 基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代 -1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸衍生的14％N-乙酰基-壳聚糖；和

Cs(NM)-VLA₄配体2酸(4％负载率)(壳聚糖衍生物K)，用4％ N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[ 1-(S)-1-羧基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰基]环戊基]乙基 氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰胺酸衍生的 14％N-乙酰基-壳聚糖。

在其它具体的实施方案中，本发明涉及壳聚糖，其与小分子整联蛋白 拮抗剂-siRNA纳米粒子组合物共价连接，所述组合物包含：

(1)衍生的和未衍生的壳聚糖，和

(2)多核苷酸(如siRNA)。

此外，本发明涉及制备和使用式I的壳聚糖聚合物衍生物的方法以及含 有此类聚合物的药物组合物。式I的壳聚糖聚合物衍生物可用于配制组合物 如纳米粒子以改善小分子、肽和核酸如siRNA至表达VLA-4或αVβ3二聚体 的靶细胞的细胞质的递送。在特定的实施方案中，本发明涉及含有壳聚糖 的纳米粒子组合物和含有式I的壳聚糖聚合物衍生物的制剂，它们可用于将 siRNA递送至表达VLA-4或αVβ3二聚体的靶细胞的细胞质，以通过RNA干 扰来抑制某些靶蛋白的表达。

在更特定的实施方案中，本发明涉及式I的壳聚糖聚合物衍生物用于配 制成衍生化壳聚糖纳米粒子组合物以促进核酸如siRNA至表达VLA-4或 αVβ3二聚体的肿瘤细胞和其它细胞类型的递送的用途。而且，式I的壳聚 糖聚合物衍生物合成递送制剂以治疗炎症和增殖性病症如癌症的用途是本 发明的一部分。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1选自下组：

(1)下式的部分：

其中m为0或1；且

(2)下式的部分：

其中是：

R2为氢或甲基，且n为8-25。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y为下式的部分：

且

R1选自下组：

(1)下式的部分：

其中m为0或1；且

(2)下式的部分：

其中为

R2为氢或甲基，且n为8-25。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y为下式的部分：

R1选自下组：

(1)下式的部分：

其中m为0或1；且

(2)下式的部分：

其中为：

R2为氢或甲基，且n为8-25。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为

并且

R2为氢或甲基，且n为8-25。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为下式的部分：

其中为：

R2为氢或甲基，且n为8-25。

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为下式的部分：

其中

为

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为下式的部分：

其中：

为

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为下式的部分：

其中

为

在一个实施方案中，提供了式I的壳聚糖聚合物衍生物：

其中式I的单体在表示β-1-4键联的位置X¹和X⁴处通过单个氧原子彼此共价 连接，其中X¹和X⁴表示任意立体化学的羟基的聚合物末端除外；且其中：

Y选自下组：

(1)下式的部分：

和

(2)下式的部分：

R1为下式的部分：

其中

为

本发明化合物的一般合成

各种形式的壳聚糖广泛可得。存在具有指定脱乙酰度和分子量范围的 很多商业来源。脱乙酰化的程度可根据公布的方法通过用强碱处理来改变。 通过使用具有不同分子量截断值的透析包将壳聚糖调节成较窄的分子量范 围是可能的。以这种方式操纵壳聚糖的方法已被公布且对于本领域技术人 员而言是已知的。

实施例中提供了适用于合成式I的壳聚糖聚合物衍生物的方法。一般而 言，式I的壳聚糖聚合物衍生物可根据下示流程来制备。除非另有指示，否 则以与前面对于通式I所定义的方式相同的方式定义下面流程中的变量如 R1、R2、X1、X2、Y等。

以如下列流程中所示的下列一般方式制备由以下式I的三个单体组成 的整联蛋白靶向壳聚糖聚合物衍生物

其中变量如在详述和权利要求中所定义。

马来酰亚胺-(PEG)n-整联蛋白拮抗剂缀合剂的一般合成

各种长度PEG的化合物如4是商购可得的(如来自Pierce BioScience)。 也可如流程1中所示，通过在酰胺键形成条件下用3-(2,5-二氧代-2,5-二氢- 吡咯-1-基)-丙酸酰化PEG氨基酸的氨基端、之后在成酯条件下通过N-羟基 琥珀酸的反应形成反应性N-羟基琥珀酸酯来制备此类化合物。与含有伯胺 或仲胺的化合物如5的反应在存在碱性胺如DIEA(二异丙基乙基胺)下于室 温在非质子或质子溶剂中进行，产生PEG化的中间体如6：

尤其对于本发明，将中间体2与4反应以制备马来酰亚胺中间体7：

以类似的方式，将中间体8与4反应以制备马来酰亚胺中间体9：

将3-乙酰基硫烷基-丙酸11与所需分子量和脱乙酰度的壳聚糖(10)在1- 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和羟基苯并三唑存 在下反应，形成经保护的巯基化壳聚糖12，如流程4中所示：

在100℃将经保护的巯基化壳聚糖12用0.1N HCl水溶液脱保护4小时， 由此形成巯基化壳聚糖13，如流程5中所示：

对于小分子–PEG–壳聚糖缀合物，在含水条件下于室温进行PEG化靶 向配体6与巯基化壳聚糖13的反应(流程6)。小分子负载度或取代度由与3- 乙酰基硫烷基-丙酸的反应程度控制，如流程4中所示。

中间体2(其中m＝1)，αVβ3靶向分子可如下流程8所示进行合成。简言 之，将间氨基苯甲酸14与N,N-二-Boc-甲基硫脲15在DMF、二氯甲烷和吡啶 中、在乙酸汞存在下反应。此时，将苄酯保护的甘氨酸与上述反应产物的 羧酸在标准肽形成条件下偶联。苄酯通过氢解条件去除，由此提供游离酸 16。在单独反应次序中，将对硝基苯酚17与(2-羟基-乙基)氨基甲酸叔丁酯 在三苯基膦和偶氮二羧酸二异丙酯存在下、在非质子溶剂如四氢呋喃中偶 联。将该产物的硝基还原为相应的苯胺18，其在酰胺键形成条件下与 N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯偶联。在去除氨基保护基团Fmoc后，通过 用哌啶处理，将氨基末端再次与中间体19在标准酰胺键形成条件下偶联以 形成中间体16。在用强酸如三氟乙酸处理后，形成中间体2并且通过本领域 技术人员熟知的纯化方法分离：

以如流程8中所示类似方式，可使用(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯代替(2- 羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备2的3-碳链胺类似物(其中m＝1)。

中间体3可以与如(Sidduri,A.等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry  Letters,2002,12,2475-2478)报道且如流程9所示的类似方式合成：

尤其，如流程9中所示，由商购可得的(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰 基氨基-丙酸20生成中间体21。将甲醇溶液中的商购可得的起始材料20的硝 基用锌粉、在氯化铵存在下、于室温还原数小时，产生苯胺21。其它硝基 还原方法对于本领域技术人员是已知的。将苯胺21用苯甲酰卤衍生物如2,6- 二氯苯甲酰氯22在非质子溶剂如二氯甲烷中、在碱如二-异丙基-乙基胺存 在下于室温酰化。以这种方式，形成酰胺23。根据本领域技术人员已知的 标准方法除去叔丁基羰基(Boc)胺保护基团，如通过用HCl在二噁烷中的溶 液于室温处理；产生盐酸盐24。盐酸盐24在酰胺键形成条件(也为本领域技 术人员所熟知)下、在已知的1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷羧酸25存在下处理， 导致二-酰胺26的生成。通过用三烷基膦在非质子溶剂如四氢呋喃中、于室 温处理而使中间体26的叠氮基还原。此外，通过用氢氧化钠在溶剂混合物 如乙醇和四氢呋喃中、于升温如50℃处理15小时而将甲酯皂化。该方法导 致形成中间体8，其也可以以两性离子形式呈现。

下式的整联蛋白拮抗剂的合成：

其中：

可按照流程10有效地完成：

可将由G表示的环安置于中间体3中，如流程10中所示。然后制备中间 体3可用于以如流程3中所示类似方式的后续偶联并且生成靶分子，其准备 根据流程1进行偶联以制备式I的壳聚糖聚合物衍生物。上面流程10中制备 中间体27的详细合成方法公布于美国专利No.6,388,084B1和6,380,387B1 中。简言之，芳基或杂芳基锌试剂由已知中间体27或28在无水溶剂如二甲 基乙酰胺(DMA)中形成。此时将锌试剂与商购可得的(S)-2-叔丁氧基羰基氨 基-3-(4-碘)苯基]丙酸乙酯29在钯催化剂如Pd(dba)₂存在下和在钯配体三甲 苯甲酰基膦存在下、在非质子溶剂如四氢呋喃(THF)中于50℃反应。以这 种方式，形成通用结构30的中间体。然后以对于本领域技术人员而言是常 规的四个步骤将中间体30转化为中间体3。首先，在强酸如三氟乙酸(TFA) 存在下、在二氯甲烷(CH₂Cl₂)溶剂中实现氨基保护基团N-叔丁氧基羰基的 去除。其次，使用对于本领域技术人员熟知的标准酰胺键形成条件将环状 中间体15与前一步骤中所示的氨基偶联。第三，使用在THF中的三甲基膦 将叠氮基还原为相应的胺，最终使用氢氧化钠在THF和乙醇(EtOH)的溶剂 混合物中于50℃将羧酸酯皂化15小时。

对于通用结构4的化合物，不同PEG长度是可得的或容易由本领域技术 人员制备；尤其为n＝8-24。优选使用9H-芴-9-基甲氧基羰基保护 (N-Fmoc)peg化试剂的氨基末端。通过用仲胺如在THF(四氢呋喃)中的二甲 胺或在DMF(二甲基甲酰胺)中的哌啶处理来去除N-Fmoc保护基团。由于已 使peg化缀合物18的氨基末端脱保护，使用为本领域技术人员熟知的酰胺键 形成反应条件，进行与商购可得的琥珀酸酐的反应，作为暴露羧酸基团的 方式，以供后续偶联至中间体8的氨基末端。

详细地，本发明涉及如下所示Y表示琥珀酰亚胺连接体的式1化合物。 流程11中所示的使用中间体31的合成提供本领域技术人员进行复制的足够 细节。如有需要，该方法也可应用于含有亲核胺和适当羧酸基团、优选叔 丁酯的其它整联蛋白靶向小分子。尤其，将中间体31与商购可得的PEG化 试剂32在HBTU和二异丙基乙基胺存在下、在非质子溶剂如DMSO中反应， 由此产生中间体33。此时，用仲胺试剂如DBU(34)、在溶剂如DMF中、在 巯基淬灭剂如35存在下去除Fmoc胺保护基团。此时，用琥珀酸酐36处理胺 脱保护的中间体，之后使用羟基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸(磺基-NHS,38) 作为偶联催化剂进行活化的优选方法，由1-乙基-3-(3-二甲基l氨基丙基)碳 二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、在碱如二-异丙基乙基胺(DIPEA)存在下、在溶 剂如二甲基亚砜(DMSO)中介导。这产生衍生化试剂39。39与适当脱乙酰 化的壳聚糖11的反应提供小分子靶向的通式I的壳聚糖，如前文在详述和权 利要求中描述。

用于靶向递送siRNA、具有与小分子整联蛋白拮抗剂共价连接的壳聚糖衍生物的siRNA纳米粒子的一般合成

含有式I的壳聚糖聚合物衍生物的siRNA纳米粒子可通过将siRNA水溶 液与壳聚糖聚合物衍生物在缓冲液中合并来制备，浓度和比率为本领域技 术人员所知或如广泛公布。纳米粒子根据带负电的siRNA与带正电的壳聚 糖的静电缔合而自发地形成。siRNA/衍生化壳聚糖纳米粒子的大小和电荷 部分由N与P比率(碱性壳聚糖氨基与siRNA的带负电的磷酸二酯基团的平 均数量的比率)控制。在特定的实施方案中，N与P比率为2至200，优选为 50。壳聚糖聚合物衍生物的平均分子量在10,000至250,000Da之间变化，优 选大于100,000Da。与不同分子量的其它衍生化或未衍生化壳聚糖的组合 是一种控制纳米粒子大小和电荷的方法。

效用

式I的壳聚糖聚合物衍生物可用于缀合或配制组合物以改善治疗剂如 小分子、肽或核酸(即siRNA)至表达VLA-4和αVβ3二聚体的靶细胞的递送。

因此，含有式I壳聚糖聚合物衍生物的本发明组合物可用于包封、缩合 或以另外方式配制治疗剂如小分子、肽、或核酸(即siRNA)，以供治疗各种 与表达VLA-4和αVβ3相关的疾病和疾患。此类疾病和疾患包括癌症并且可 包括各种代谢相关疾病。

在特定的实施方案中，本发明包括治疗或预防需要此类治疗的哺乳动 物(优选人)的癌症的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的含有式I壳 聚糖聚合物衍生物的组合物。在另一实施方案中，提供了式I化合物用于治 疗或预防炎症、癌症或代谢疾病和疾患的用途。在另一实施方案中，提供 了式I化合物在制备用于治疗或预防炎症、癌症或代谢疾病和疾患的药物中 的用途。

在特定的实施方案中，此类组合物为壳聚糖-siRNA纳米粒子。此类组 合物可以以与良好医疗实践一致的方式施用。在这方面考虑的因素包括要 治疗的具体病症、要治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、 递送活性剂的位点、施用方法、施用时间表和为医疗实践者已知的其它因 素。“有效量”的待施用的化合物将由如抑制靶蛋白表达和避免不可接受 毒性所需的最小量的考虑支配。例如，这种量可以低于对正常细胞或哺乳 动物作为整体有毒性的量。含有本发明式I化合物的组合物可通过胃肠外、 腹膜内和肺内施用来施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜 内或皮下施用。

实施例

通过参考下列实施例可更全面地理解本发明。但是，它们不应被解释 为限制本发明的范围。

试剂购自Aldrich,Sigma和Pierce BioScience或下示其它供应商，其不 经进一步纯化即可使用。毫克至克数量级的纯化通过本领域技术人员已知 的方法如硅胶闪柱洗脱进行。在一些情况下，也可通过使用用CombiFlash 系统洗脱的一次性克数量级预填硅胶柱(RediSep)实现制备型闪柱纯化。 Biotage^TM和ISCO^TM也为可在本发明中用于纯化中间体的闪柱仪器。

为了判断化合物身份和纯度，使用下列系统记录LC/MS(液相色谱/质 谱法)光谱。对于质谱的测量，该系统由Micromass Platform II光谱仪：正 电子模式的ES电离(质量范围：150-1200amu)组成。用下列HPLC系统达 到同时色谱分离：ES Industries Chromegabond WR C-183u(3.2x 30mm)柱筒；流动相A：水(0.02％TFA)和流动相B：乙腈(0.02％TFA)； 梯度10％B至90％B，3分钟；平衡时间1分钟；流速2mL/分钟。在一些情 况下，将20毫摩尔浓度的醋酸铵用作制备型HPLC期间有效电离的改性剂。 在此类情况下，分离出铵盐。

对于一些分离，超临界流体色谱的使用也可以是有用的。使用 Mettler-Toledo Minigram系统、在下列典型条件下进行超临界流体色谱分 离：100bar,30℃,2.0mL/min，用在超临界流体CO₂中的40％MeOH洗脱 12mm AD柱。在具有碱性氨基的分析物的情况下，向甲醇改性剂添加0.2％ 异丙胺。

通过使用Varian Inova400MHz NMR光谱仪或Varian Mercury300 MHz NMR光谱仪的¹H-NMR以及通过使用Bruker Apex-II高分辨率4.7T FT-质谱仪的高分辨率质谱法表征化合物。也通过使用由Thermo Electron 销售的LTQ CL Orbitrap的高分辨率质谱法来表征最终化合物。

如下为本文所用的缩写：

AIBN         2,2’-偶氮二异丁腈

Bu           丁基

DCE          1,2-二氯乙烷

DCM          二氯甲烷

DBU          1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯

DIAD         偶氮二羧酸二异丙酯

DIPEA        二异丙基乙基胺

DMF          N,N-二甲基甲酰胺

DMSO         二甲基亚砜

EDC-HCl      1-乙基-3-(3-二甲基l氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

EtOAc        乙酸乙酯

EtOH         乙醇

FCC          闪柱色谱

h            小时

HBTU         O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HOBt         羟基苯并三唑

HPLC         高压液相色谱

HRMS         高分辨率质谱

LRMS         低分辨率质谱

LC           液相色谱

L-Pro        L-脯氨酸

MCPBA        间氯过氧苯甲酸

MeOH         甲醇

MW           微波

NIS          N-碘琥珀酰亚胺

NBS          N-溴琥珀酰亚胺

NMP          1-甲基-2-吡咯烷酮

PdCl₂(dppf)  [1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)

PEGn         聚乙二醇重复n次(例如PEG2＝-OCH2CH2OCH2CH2-)

PG           保护基团

PyBroP       三吡咯烷子基溴化鏻六氟磷酸盐

rt           室温

TBAF         四丁基氟化铵

TBDMS        叔丁基-二甲基甲硅烷基

TBTU         2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氯硼酸盐

TMS          三甲基甲硅烷基

TMSSMe       (甲基硫基)三甲基硅烷

TEA          三乙胺

TEMPO        2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基

TFA          三氟乙酸

THF          四氢呋喃

TPP          三苯基膦

配体的制备

αvβ3配体1：

(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1- 基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰 基氨基]-琥珀酰胺酸

步骤1：3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酸的制备

将3-氨基苯甲酸(82.3g，0.60mol)、N,N’-双(叔丁氧基羰基)-S-甲基异硫 脲(1,3-二-boc-2-甲基异硫脲，CAS#107819-90-9)(174.2g，0.6mol)和吡啶 (94.92g，97mL，1.20mol，2.0当量)在无水二甲基甲酰胺(600mL)和无水1,2- 二氯乙烷(600mL)的混合物中的溶液用乙酸汞(95.6g，0.30mol，0.5当量)处 理，用顶置式机械搅拌器于室温搅拌5h。然后，将固体滤出，用二氯甲烷 洗涤，将合并的滤液和洗涤液蒸发，得到粗产物(～307g)。向该粗材料添加 甲醇(240mL)，将混合物剧烈搅拌2h。然后在剧烈搅拌下缓慢加入2400mL 水。过滤，用水彻底洗涤固体，抽干过夜，获得超过理论收率的3-(N,N-双 -叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酸。高真空泵式干燥。所得重量高于理论值(理论 值＝227.6g，实际值＝251.2g。¹H NMR指示存在～10％的DMF)。

步骤2：2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯的 制备

将3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酸(171.56g，0.4073mol)、2-氯-4,6- 二甲氧基-三嗪(71.52g，0.4073mol)和N-甲基吗啉(41.2g，44.78mL， 0.4073mol)在无水四氢呋喃(1600mL)中的浅褐色溶液于室温搅拌(顶置式 机械搅拌器)2h，然后加入甘氨酸苄酯p-TsOH盐(137.44g，0.4073mol)和第 二当量的N-甲基吗啉(41.2g，44.78mL，0.4073mol)。将所得混合物在室温 搅拌36h。然后，在旋转蒸发仪上去除四氢呋喃，然后加入乙酸乙酯 (2000mL)。所得混合物相继用冰冷0.5N HCl(3x1000mL)、水(1x 1000mL)、5％碳酸钠水溶液(1x1000mL)、水(1x1000mL)、饱和氯化钠 水溶液(1x1000mL)洗涤，经硫酸钠干燥。将固体滤出，蒸发溶剂，得到 为油状物的粗产物(228.5g)。用Waters Prep500、通过色谱(10次试验)、使 用二氯甲烷：己烷：乙酸乙酯＝40:45:15作为洗脱剂来纯化粗材料，得到 2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯(79.3％收率)。 (注释：第一次试验获得152g洁净物质和33g略微不纯的物质，其再在两次 试验中进行色谱处理)。ES(+)-HRMS m/e C₂₇H₃₄N₄O₇(M+H)⁺的计算值 527.2500，实测值527.2499。

步骤3：2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸的制备

于室温，将2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯 (170.0g，0.323mol)在无水乙醇(2000mL)中的溶液在高压设备中以60psi用 10％Pd/碳(20g湿催化剂，其含有～50％水)氢化过夜(18h)。滤去催化剂， 蒸发溶剂，得到产物。将产物与甲苯(3次)共沸以除去所有乙醇，得到为白 色固体的2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸(97.88％收 率)。ES(+)-HRMS m/e C₂₀H₂₈N₄O₇(M+H)⁺的计算值437.2031，实测值 437.2030。

步骤4：[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备

于室温、在氮气气氛下向(3-羟基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(7.03g， 40.1mmol)在无水THF(40mL)中的溶液加入4-硝基苯酚(5.07g，36.5mmol)、 三苯基膦(10.5g，40.1mmol)。将所得溶液用冰水浴冷却至～0℃，然后逐滴 添加偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD,8.1g，40.1mmol)，持续15-20分钟。添加 后，将溶液升温至室温，搅拌15h，此时实时LCMS分析指示存在16％的起 始材料。然后，加入另外0.1当量的所有上述试剂，将反应混合物再搅拌15h。 将固体滤去，用乙酸乙酯洗涤，然后将滤液用饱和氯化钠溶液洗涤，经无 水硫酸镁干燥。过滤和浓缩得到粗残余物，其使用ISCO(340g)柱色谱纯化， 得到为白色固体的[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(64％收率)。 ES(+)-HRMS m/e C₁₄H₂₀N₂O₅(M+Na)⁺的计算值319.1264，实测值 319.1266。

步骤5：[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备

于室温向[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(7.7g，26mmol)在 甲醇(200mL，加热以溶解起始材料)中的溶液加入水(10mL)、氯化铵(20.9g， 390mmol，15当量)和锌粉(16.4g，260mmol，10当量，分3次)。在添加锌 粉后，反应混合物放热，将反应混合物搅拌1-2h，此时对混合物的TLC分 析指示不存在起始材料。然后，将固体滤去，用水和乙酸乙酯洗涤，将来 自滤液的有机化合物用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的萃取液用盐水 溶液洗涤，经无水硫酸镁干燥。过滤和浓缩得到粗残余物，其使用ISCO (330g)柱色谱纯化，分离出为白色固体的[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲 酸叔丁酯(79％收率)。ES(+)-HRMS m/e C₁₄H₂₂N₂O₃(M+Na)⁺的计算值 289.1522，实测值289.1523。

步骤6：(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲 氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备

于室温向[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(5.41g，20.2mmol) 和(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酸叔丁酯在DMF(40mL)中的溶 液加入HOBT(3g，22.2mmol)和DIPEA(8.52g，66.6mmol)。用冰浴将所得 溶液冷却至0℃，在5-10分钟内分3份添加固体HBTU(8.43g，22.2mmol)。 添加后，除去冷却浴，将反应混合物升温至室温，搅拌2.5h，此时LCMS 分析指示不存在起始材料。然后，将反应混合物用乙酸乙酯(400mL)稀释， 用水(400ml)、饱和碳酸氢钠溶液(400mL)和盐水溶液(400mL)洗涤。经无 水硫酸镁干燥，浓缩滤液，使用ISCO(330g)柱色谱纯化粗残余物，分离出 为白色固体的(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基 甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯(95％收率)。ES(+)-HRMS m/e  C₃₇H₄₅N₃O₈(M+Na)⁺的计算值682.3099，实测值682.3105。

步骤7：(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺 酸叔丁酯的制备

于室温向(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基 甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯(11g，16.67mmol)在THF(95mL)中的 溶液加入哌啶(4.26g，50mmol)。将所得溶液搅拌4h，此时LCMS分析指示 不存在起始材料。然后，在真空下除去溶剂，将残余物与甲苯共沸，得到 白色固体，将其在热条件下溶解于最小量的乙酸乙酯(25-30mL)中，然后将 其用己烷(250-300mL)稀释直至沉淀。通过过滤收集所得固体，用己烷洗涤， 在空气干燥后获得为白色固体的(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙 氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(81％收率)。ES(+)-HRMS m/e C₂₂H₃₅N₃O₆(M+Na)⁺的计算值460.2418，实测值460.2416。

步骤8：(S)-3-(2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基 氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备

于室温在氮气气氛下，向(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧 基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(2.0g，4.58mmol)、2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰 基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸(2.0g，4.58mmol)、HBTU(1.91g，5.04mmol) 和HOBT(681mg，5.04mmol)的混合物加入DMF(15mL)，之后加入DIPEA (1.95g，15.12mmol)。将所得浅褐色溶液搅拌2天，此时大量凝胶样固体形 成。然后，添加水(～50mL)，将所得浅褐色糊状物在热条件下溶解于乙酸 乙酯(～200mL)中。然后，分离两层，将水层用乙酸乙酯(100mL)再萃取一 次。将合并的乙酸乙酯萃取液用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水溶液洗涤， 然后将有机层经无水硫酸镁干燥。过滤和浓缩得到粗浅褐色固体，其使用 ISCO(120g)柱色谱纯化，分离出为白色固体的(S)-3-(2-(3-(N,N-双-叔丁氧 基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧 基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(94％收率)。ES(+)-HRMS m/e C₄₂H₆₁N₇O₁₂(M+H)⁺的计算值856.4450，实测值856.4451。

步骤9：(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)- 乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐的制备

于0℃(冰浴)在氮气气氛下，向(S)-3-(2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)- 苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥 珀酰胺酸叔丁酯(3.7g，4.32mmol)在二氯甲烷(80mL)中的溶液添加过量的 三氟乙酸(40mL)。将所得无色溶液在此温度搅拌1-2h，然后通过去除冷却 浴将其升温至室温。搅拌15h后，在真空下除去溶剂，将残余物与甲苯共沸。 将所得深蓝色糊状物用叔丁基甲基醚研磨，但是其未得到良好固体。然后， 在真空下除去溶剂，将残余物用二氯甲烷和乙醚研磨。通过过滤收集所得 浅褐色固体，用乙醚洗涤。在空气中干燥后，将2.7g(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧 基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸以三氟乙 酸盐形式分离(85％收率)。ES(+)-HRMS m/e C₂₃H₂₉N₇O₆(M+H)⁺的计算值 500.2252，实测值500.2252。

通用方法：

步骤10：(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢- 吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨 基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备

于室温在氮气气氛下，向(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍 基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸(245mg，0.289mmol)和 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代 -吡咯烷-1-基酯(200mg，0.289mmol)在DMSO(5mL)中的溶液添加过量的 DIPEA(186mg，252uL，1.44mmol)。将所得浅黄色溶液搅拌2h，此时LCMS 分析指示不存在起始材料。然后，在真空下除去过量DIPEA，将所需产物 通过使用HPLC方法纯化来分离，得到212mg为浅黄色固体的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙 酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基 氨基]-琥珀酰胺酸(68％收率)。ES(+)-HRMS m/e C₄₉H₇₁N₉O₁₈(M+H)⁺的计 算值1074.4990，实测值1074.4984。

αvβ3配体2：

(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备

由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰 基氨基)-琥珀酰胺酸(245mg，0.289mmol)、 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基 氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸 -2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(250mg，0.289mmol)和DIPEA(373mg，503uL， 2.89mmol)开始，使用αvβ3配体1的通用方法步骤10中所述的类似方法，在 HPLC纯化后获得312mg(86％收率)为浅褐色油状物的 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸。ES(+)-HRMS m/e C₅₇H₈₇N₉O₂₂(M+H)⁺的计算值1250.6039，实测值1250.6032。

αvβ3配体3：

(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备

步骤1：[2-(4-硝基-苯氧基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备

通过与2-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯类似的方法、由(2-羟 基-乙基)-氨基甲酸叔丁酯和4-硝基苯酚制备2-(4-硝基-苯氧基)-乙基]-氨基 甲酸叔丁酯。

步骤2：[2-(4-氨基-苯氧基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备

通过与2-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯类似的方法、由2-(4- 硝基-苯氧基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯制备2-(4-氨基-苯氧基)-乙基]-氨基甲 酸叔丁酯。

步骤3：(S)-N-[4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲 氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备

通过与(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲 氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯类似的方法、由[3-(4-氨基-苯氧基)-乙 基]-氨基甲酸叔丁酯和(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酸叔丁酯制 备(S)-N-[4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基 氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯。

步骤4：(S)-3-氨基-N-[4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)苯基]琥珀酰胺 酸叔丁酯的制备

通过与(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺 酸叔丁酯类似的方法、由(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-苯 基]-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯制备(S)-3-氨基 -N-[4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)苯基]琥珀酰胺酸叔丁酯。

步骤5：(S)-4-(4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基)苯基氨基)-4-氧代 -3-(2-(3-(2,2,10,10-四甲基-4,8-二氧代-3,9-二氧杂-5,7-二氮杂十一烷-6-亚基 氨基)苯甲酰胺基)乙酰胺基)丁酸叔丁酯的制备

通过与(S)-3-(2-(3-(N,N-双-叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基 氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯类似方 法、由2-(3-(2,2,10,10-四甲基-4,8-二氧代-3,9-二氧杂-5,7-二氮杂十一烷-6- 亚基氨基)苯甲酰胺基)乙酸和(S)-3-氨基-4-(4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧 基)苯基氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯制备(S)-4-(4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧 基)苯基氨基)-4-氧代-3-(2-(3-(2,2,10,10-四甲基-4,8-二氧代-3,9-二氧杂-5,7- 二氮杂十一烷-6-亚基氨基)苯甲酰胺基)乙酰胺基)丁酸叔丁酯，为白色浅黄 色固体，3.57g(97％收率)。

步骤6：(S)-N-[4-(2-氨基-乙氧基)-苯基]-3-[2-(3-胍基-苯甲酰基氨基)-乙 酰基氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐的制备

通过与(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)- 乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐类似的方法、由(S)-4-(4-(2-(叔丁氧基 羰基氨基)乙氧基)苯基氨基)-4-氧代-3-(2-(3-(2,2,10,10-四甲基-4,8-二氧代 -3,9-二氧杂-5,7-二氮杂十一烷-6-亚基氨基)苯甲酰胺基)乙酰胺基)丁酸叔丁 酯制备((S)-N-[4-(2-氨基-乙氧基)-苯基]-3-[2-(3-胍基-苯甲酰基氨基)-乙酰基 氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐，为HPLC纯化的冻干白色固体，430mg(51％ 收率)。LCMS ES MS m/e C₂₂H₂₇N₇O₆(M+H)⁺的计算值485.2实测值486.1。

步骤7：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙 氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备

通过与(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]- 乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的类似方法、由(S)-N-[4-(2-氨基-乙氧基)-苯 基]-3-[2-(3-胍基-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐和 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基 氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸 -2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯制备 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡 咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]乙氧基]-苯 基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸，为透明的黄色 粘稠半固体，274mg(73％收率)。LCMS ESI MS m/e C₅₆H₈₅N₉O₂₂(M+H)⁺的计算值1235.6，实测值1236.7。

VLA₄配体1：

(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙 酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸。

步骤1：1-(2-溴乙基)环戊烷羧酸甲酯的制备

于-10℃向二异丙胺(396mmol，56mL)在THF(85mL)中的溶液逐滴添 加正丁基锂(393mmol，240mL，1.6M)在己烷中的溶液，同时使温度保持 在0℃以下。添加后，在0℃将溶液搅拌30min。于-70℃向其逐滴添加环戊 烷羧酸甲酯(263mmol，37.4g)在THF(50mL)中的溶液，使内部温度保持在 -60至-70℃。添加后，将反应混合物在-50至-60℃搅拌1h。然后，逐滴添加 1,2-二溴乙烷(545mmol，47mL)在THF(50mL)中的溶液，于-70至-60℃将 浅褐色混悬液搅拌1h。然后，将其升温至室温，搅拌过夜。将反应混合物 倒入氯化铵饱和水溶液(200mL)，将有机化合物萃取到乙醚(2X100mL)。 将合并的萃取液用氯化钠饱和溶液(150mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥。过 滤干燥剂后，在真空下浓缩溶液，将所得残余物于95-105℃/2.5mm Hg蒸馏， 得到49.6g(80％收率)为无色油状物的1-[2-溴乙基]环戊烷羧酸甲酯。

步骤2：1-[2-叠氮基乙基]环戊烷羧酸甲酯的制备

于50℃在氮气气氛下将1-[2-溴乙基]环戊烷羧酸甲酯(211mmol，49.6g) 和叠氮化钠(831mmol，54g)在DMF(200mL)中的溶液搅拌5h。然后，过滤 固体，将滤液浓缩至近乎干燥。将残余物用乙酸乙酯(500mL)稀释，将未 溶解的固体通过过滤收集，浓缩滤液，得到粗1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羧酸 乙酯，其通过色谱在250g硅胶上纯化，用含5％乙酸乙酯的己烷洗脱，得到 36.2g(87％收率)为浅褐色油状物的1-[2-叠氮基乙基]环戊烷羧酸甲酯。 EI(+)-HRMS m/e C₉H₁₅N₃O₂(M-H)⁺的计算值196.1086，实测值196.1342。

步骤3：1-[2-叠氮基乙基环戊烷羧酸的制备

将1-[2-叠氮基乙基]环戊烷羧酸甲酯(184mmol，36.2g)溶解于THF (500mL)和甲醇(250mL)中，加入LiOH一水合物(368mmol，15.44g)在水 (300mL)中的溶液。将所得溶液于40℃搅拌过夜，浓缩。将残余物溶解于 含有40mL1N NaOH的1L水中，用己烷(500mL)洗涤。将水层用1N盐酸酸 化，将有机化合物用乙醚萃取(2x500mL)。将合并的萃取液用饱和氯化钠 溶液洗涤，将有机层经无水Na₂SO₄干燥。过滤干燥剂和浓缩，得到32.5g (96％收率)为琥珀色液体的1-[2-叠氮基乙基环戊烷羧酸。ES(+)-HRMS m/e  C₈H₁₃N₃O₂(M+Na)⁺的计算值206.0900，实测值206.0900。

步骤4：(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯的制备

于室温向(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸(226.2mmol， 70.2g)和碳酸钠(1.13mol,95g)在DMF(500mL)中的混悬液添加甲基碘(1.13 mol,70.4mL)。将混悬液于室温搅拌15h，此时混合物的TLC分析指示不存 在起始材料，在高真空下除去过量的甲基碘和一些DMF。然后，将其倒入 水(2L)中，于室温搅拌，历经72h沉淀缓慢形成。将沉淀的固体通过过滤收 集，用水(2L)洗涤。空气和真空干燥后，分离出72g(98％收率)为浅黄色固 体的(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯(mp95-96℃)。 ES(+)-HRMS m/e C₁₅H₂₀N₂O₆(M+H)⁺的计算值325.1400，实测值325.1404。

步骤5：(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯的制备

于室温向(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯 (222mmol，72g)、锌粉(～325目，2.2mol,145.2g，10当量)和氯化铵(3.3mol, 178.1g，15当量)的混合物添加甲醇(1L)和水(500mL)。在添加水后，放热反 应随之发生，将内部温度升至45-50℃。将混悬液于室温搅拌30min至1h， 此时混合物的TLC分析指示不存在起始材料，将反应混合物通过硅藻土垫 过滤，将滤饼用甲醇(1L)和水(500mL)洗涤。浓缩以除去大部分甲醇和一些 水，提供白色固体，其通过过滤收集，用水洗涤。空气干燥后，分离出65.5g (100％收率)为白色固体的(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲 酯(mp86-89℃)。ES(+)-HRMS m/e C₁₅H₂₂N₂O₄(M+H)⁺的计算值294.1621， 实测值294.1614。

步骤6：(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙 酸甲酯的制备

于室温向(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯 (127.6mmol，37.57g)和2,6-二氯苯甲酰氯(140.6mmol，29.45g)在二氯甲烷 (350mL)中的溶液添加DIPEA(192mmol，24.8g)。将褐色溶液于室温搅拌 15h，得到白色混悬液，此时混合物的TLC分析指示不存在起始材料。然 后，通过过滤收集固体，将固体用二氯甲烷(150mL)洗涤，空气干燥，得 到52.75g(88.4％收率)为白色固体的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯 苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯：mp192-194℃。ES(+)-HRMS m/e  C₂₂H₂₄Cl₂N₂O₅(M+H)⁺的计算值466.1062，实测值466.1069。

步骤7：(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐 的制备

于室温将(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基] 丙酸甲酯(92.97mmol，43.45g)在二噁烷(90mL)中的混悬液用166mL4.0N 在二噁烷中的盐酸处理。5分钟后，将固体溶于溶液中，将混合物搅拌2h。 然后，在真空下去除一些二噁烷，得到黄色浆状物，加入250mL乙醚。形 成胶状物，将其溶解于THF(100mL)和甲醇(100mL)中。在真空下除去溶 剂，得到43.7g(100％收率)为白色固体的(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基 氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐：mp180-195℃。将其在氩气气氛下存储于冰 箱中。ES(+)-HRMS m/e C₁₇H₁₆Cl₂N₂O₃(M+H)⁺的计算值367.0616，实测值 367.0611。

步骤8：(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰 基氨基)苯基]丙酸甲酯的制备

于室温向(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸 盐(24.79mmol，10g)和1-[2-叠氮基乙基]环戊烷羧酸甲酯(27.29mmol，5g) 在DMF(100mL)中的溶液加入HBTU(27.33mmol，10.37g)和DIPEA (68.3mmol，8.82g)。于室温将澄清的溶液搅拌48h，将水(～200mL)加入至 反应混合物以沉淀产物。将固体通过过滤收集，用水(100mL)和己烷 (～100mL)洗涤。空气干燥后，获得为淡砖色固体的11.2g产物，其在热条件 下用乙腈(100mL)处理。将所有杂质溶于乙腈中，将固体通过过滤收集， 得到8.24g偶联产物。将乙腈溶液在真空下去除，将残余物溶解于乙酸乙酯 中，通过加入己烷沉淀产物。再次，将固体通过过滤收集，空气干燥固体， 得到另外2.03g(78％总收率)为白色固体的(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷 羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯。ES(+)-HRMS m/e  C₂₅H₂₇Cl₂N₅O₄(M+Na)⁺的计算值554.1332，实测值554.1334。

步骤9：(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰 基氨基)苯基]丙酸的制备

于室温向(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲 酰基氨基)苯基]丙酸甲酯(27.7mmol，14.77g)在THF(200mL)和乙醇(200mL) 中的混悬液添加1.0N氢氧化钠水溶液(150mL)。于室温将混合物搅拌15h， 此时混合物的TLC分析指示不存在起始材料。然后，将其用水(20mL)稀释， 通过旋转蒸发除去THF和乙醇，用100mL水稀释，用乙醚萃取(200mL)以 除去任何中性杂质。将水层用1N HCl中和，将所得白色固体通过过滤收集， 用水和己烷洗涤。空气干燥后，获得13.37g(93％收率)为白色固体的 (S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]丙酸。ES(+)-HRMS m/e C₂₄H₂₅Cl₂N₅O₄(M+Na)⁺的计算值540.1176，实 测值540.1177。

步骤10：(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰 基氨基)苯基]丙酸的制备

于0℃向(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲 酰基氨基)苯基]丙酸(12.11mmol，6.28g)在THF(91mL)中的溶液添加三甲 基膦在THF中的溶液(48.46mmol，48.5mL，1.0M)。其开始时为澄清溶液， 30min后形成一些沉淀，将该混合物搅拌过夜，此时混合物的TLC分析指 示不存在起始材料。然后，添加10当量的水(120mmol，2.16mL)，将混合 物于室温搅拌2h。将溶剂在真空下去除，将残余物与甲苯共沸两次，得到 浆状材料，其使用HPLC方法纯化，得到4.57g(77％收率)为无定形白色固 体的(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基) 苯基]丙酸。ES(+)-HRMS m/e C₂₄H₂₇Cl₂N₃O₄(M+H)⁺的计算值492.1452， 实测值492.1451。

步骤11：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙 酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸的制备

由(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨 基)苯基]丙酸(607mg，1.0mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(689mg，1.0mmol)和 DIPEA(388mg，522uL，3.0mmol)开始，使用αvβ3配体1的通用方法步骤 10中所述的类似方法，在HPLC纯化后获得788mg(74％收率)为浅黄色固体 的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙 酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸。ES(+)-HRMS m/e  C₅₀H₆₉N₅O₁₆Cl₂(M+H)⁺的计算值1066.4189，实测值1066.4182。

VLA₄配体2叔丁酯：

N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2 -[2-[1-(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰基] 环戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰 胺酸2,5-二氧代-3-磺基-吡咯烷-1-基酯钠盐。

步骤1：(S)-2-[[1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷羰基]-氨基]-3-[4-(2,6-二氯-苯 甲酰基氨基)-苯基]-丙酸叔丁酯的制备

在500mL圆底烧瓶中，将(S)-2-(1-(2-叠氮基乙基)环戊烷甲酰胺 基)-3-(4-(2,6-二氯苯甲酰胺基)苯基)丙酸(6.216g，12.0mmol，Eq:1.00)与 DCM(120mL)合并，得到白色混悬液，在氮气下将反应混合物在冰浴中冷 却。将溶解于10mL DCM中的三氟乙酸酐(5.04g，24.0mmol，Eq:2)分批加 入至反应。在添加期间，溶液澄清且为黄色，将其在冰浴中搅拌2h，然后 分批加入叔丁醇(8.89g，120mmol，Eq:10)。1h后，从冰浴去除反应，使 其升温至室温过夜。将反应回流1h，然后浓缩形成白色固体。将固体在饱 和碳酸氢钠水溶液(100mL)和乙酸乙酯(200mL)之间分配，分离有机相，用 水(100mL)和盐水(150mL)洗涤。将水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，用相同 的水和盐水洗涤。将有机层合并，经硫酸镁干燥，浓缩，在高真空下干燥。 将粗产物通过SFC纯化，得到为白色固体的(S)-2-{[1-(2-叠氮基-乙基)-环戊 烷羰基]-氨基}-3-[4-(2,6-二氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸叔丁酯(1.94g，28.1 ％收率)，其旋光度与起始材料相等。ES(+)-LRMS m/e C₂₄H₂₅N₅O₄Cl₂(M+H)⁺的计算值517.1，实测值518。

步骤2：(S)-2-{[1-(2-氨基-乙基)-环戊烷羰基]-氨基}-3-[4-(2,6-二氯-苯甲 酰基氨基)-苯基]-丙酸叔丁酯的制备

向(S)-2-{[1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷羰基]-氨基}-3-[4-(2,6-二氯-苯甲酰 基氨基)-苯基]-丙酸(1.9g，3.31mmol，Eq:1)在1L圆底烧瓶中的溶液添加 THF(40mL)，在氮气下搅拌，然后加入三甲基膦(16.5mL，16.5mmol，1M, THF，Eq:5)。在氮气气氛下将所得澄清溶液在室温搅拌21h。将反应混合 物浓缩，从DCM/己烷干燥，在乙腈(50mL)与水(50mL)之间分配，于室温 搅拌22h。然后将反应混合物浓缩，在乙酸乙酯(175mL)与饱和碳酸氢钠水 溶液(200mL)之间分配，分离有机相。将水相用EA萃取(100mL)。将有机 层用盐水(75mL)洗涤，合并，经硫酸镁干燥，过滤，浓缩，从DCM/己烷、 然后从DCM干燥，得到为黄色固体的(S)-2-{[1-(2-氨基-乙基)-环戊烷羰基]- 氨基}-3-[4-(2,6-二氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸叔丁酯(1.67g，92％收率)。 ES(+)-LRMS m/e C₂₄H₂₇N₃O₄Cl₂(M+H)⁺的计算值491.1，实测值492。

步骤3：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸叔丁酯的制备

向含有 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[9H-芴 -9-基甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(305mg， 223μmol，Eq:1.0)的50ml圆底烧瓶添加((S)-2-{[1-(2-氨基-乙基)-环戊烷羰 基]-氨基}-3-[4-(2,6-二氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸叔丁酯(134mg， 245μmol，Eq:1.1)、乙腈(2mL)和DIEA(86.4mg，117μL，669μmol，Eq:3)。 于室温将黄色溶液搅拌5min，加入HBTU(127mg，334μmol，Eq:1.5)。将 反应气氛用氮气吹扫，密封烧瓶，于室温搅拌2.8天。通过添加TFA(50μL)、 穿过0.2μm PVDF注射器式滤器(用1x漂洗1mL)进行反应后处理，然后通 过RP-HPLC(C18Pursuit,20x150mm，30mL/min，水/0.1％TFA的乙腈， 35-100％乙腈，历时8min，三次注射)纯化。将适合的级分合并，加入0.5g 二异丙胺树脂(Aldrich538736-25g)。于室温将混合物搅拌3h。将材料滤过 #1Whatman滤纸，浓缩滤液，从乙腈干燥，高真空干燥，得到为无色粘稠 油状物的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸叔丁酯(264mg，62％收率)。 ES(+)-LRMS m/e C₉₄H₁₄₆N₄O₃₁Cl₂(M+H)⁺的计算值1899，实测值950 ((M+H)/2)⁺。

步骤4：

(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[ 2-[2-[2-[氨基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷 羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-丙酸叔丁酯的制备

向含有(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯 基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸叔丁酯(260mg，137μmol，Eq:1.00) 的25ml圆底烧瓶添加DMF(2mL)，将氮气鼓入溶液中。加入壬-1-硫醇 (219mg，261μL，1.37mmol，Eq:10)，然后加入DBU(41.7mg，41.3μL， 274μmol，Eq:2)，将烧瓶包裹于铝箔中，将反应在室温搅拌17h。将反应 滤过注射器式滤器(0.45μm PTFE，2次ACN漂洗，1mL/每次)，将样品通 过RP-HPLC(C18Pursuit,20x150mm，30mL/min，3次注射，具有不同起 始浓度的梯度15、20、30％至100％在水中的ACN，8min，不含改性剂)。 将适合的级分合并，浓缩，从ACN干燥，得到为无色粘稠油状物的 (S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[氨基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰 基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-丙酸叔丁酯(79mg，82％收率)。 ES(+)-LRMS m/e C₇₉H₁₃₆N₄O₂₉Cl₂(M+H)⁺的计算值1677.9，实测值839 ((M+H)/2)⁺。

步骤5：

N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2 -[2-[1-[(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰 基]环戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰 胺酸的制备

在25mL梨形烧瓶中，将 (S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[氨基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷 羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-丙酸叔丁酯(77mg，37.7μmol， Eq:1.00)与DMSO(1mL)合并，得到无色溶液。加入DIPEA(23.7mg，32μL， 183μmol，Eq:4.87)和二氢呋喃-2,5-二酮(琥珀酸酐)(6mg，60.0μmol，Eq: 1.59)，将反应搅拌15.5h。不经纯化即可在步骤6中使用含有 N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[ 1-[(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰基]环 戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰胺酸 的溶液。ES(+)-LRMS m/e C₈₃H₁₄₀N₄O₃₂Cl₂(M+H)⁺的计算值1777.0，实测 值889((M+H)/2)⁺。

步骤6：

N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2 -[2-[1-[(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰 基]环戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰 胺酸2,5-二氧代-3-磺基-吡咯烷-1-基酯钠盐的制备

向

N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[ 1-[(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰基]环 戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰胺酸 的溶液添加磺基-NHS酯(18.1mg，83.6μmol，Eq:2)，然后加入EDC(16.0mg， 83.6μmol，Eq:2)。将反应混合物于室温在氮气下搅拌17h。加入另外5mg 磺基-NHS酯和18mg EDC，将反应混合物再搅拌4.5h，然后将含有 N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[ 1-[(S)-1-叔丁氧基羰基-2-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]乙基氨甲酰基]环 戊基]乙基氨甲酰基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]琥珀酰胺酸 2,5-二氧代-3-磺基-吡咯烷-1-基酯钠盐的溶液用于下一步骤，以用于连接壳 聚糖衍生物。ES(+)-LRMS m/e C₈₇H₁₄₂N₅O₃₇Cl₂S(M+H)⁺的计算值1953.0， 实测值977((M+H)/2)⁺。

VLA₄配体3：

(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙 酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙 酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代 -1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐

步骤1：(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4- 四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯的制备

于室温向锌粉(52.29g，800mmol)在THF(26.0mL)中的混悬液添加1,2- 二溴乙烷(4.58mL，53.2mmol)。用加热枪将混悬液加热至60-65℃，直至乙 烯气体的释出停止(观察到)。将混悬液冷却至室温，添加三甲基氯硅烷 (3.38mL，26.6mmol)，将混合物搅拌15min。将5-碘-1,3,6-三甲基尿嘧啶 (74.6g，266mmol)在DMA(225mL)中的混悬液升温，得到澄清溶液，一次 性添加至反应混合物。添加后，将混合物加热至70℃。由于放热反应，反 应混合物的内部温度升温至80-85℃。将反应混合物于70℃搅拌3-4h，此时 已用饱和氯化铵淬灭的等份试样的TLC指示不存在起始材料。将反应混合 物用THF(140mL)稀释，冷却至室温，将过量锌粉静置2-3h。

于室温将含有锌化合物的该溶液(266mmol)添加至Pd(dba)₂(4.6g， 8mmol)、三邻甲苯基膦[P(Tol)₃](9.0g，29.6mmol)和(S)-2-叔丁氧基羰基氨 基-3-(4-碘)苯基]丙酸甲酯(75.56g，186mmol)在THF(280mL)中的溶液，将 浅黄色混合物于50-55℃搅拌48h。将反应混合物倒入饱和氯化铵溶液，用 乙酸乙酯(3x750mL)萃取。将合并的萃取液用盐水溶液(1.5L)洗涤，经无 水硫酸镁干燥。过滤干燥剂和浓缩，得到粗产物，其通过硅胶柱色谱、使 用Biotage(75m)柱纯化，得到57.88g(72％收率)为无定形白色固体的(S)-2- 叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯 基]丙酸甲酯。EI-HRMS m/e C₂₂H₂₉N₃O₆(M⁺)的计算值431.2056，实测值 431.2054。

步骤2：(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5- 基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐的制备

于室温将上面获得的固体(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基 -2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯的一部分(7.4g， 17.15mmol)用4N在二噁烷中的盐酸(17mL，68mmol)处理，将溶液搅拌1h， 形成白色沉淀。将混合物用乙醚稀释，将上清液弃去，将残余物首先在旋 转蒸发仪上干燥，然后在高真空下干燥，得到6.28g(99％收率)为无定形黄 色固体的(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基) 苯基]丙酸甲酯盐酸盐。FAB-HRMS m/e C₁₇H₂₁N₃O₄(M+H)的计算值 332.1610，实测值332.1617。

步骤3：(S)-2-(4-溴-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧 代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备

于室温向(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5- 基)苯基]丙酸丙酯(4.67g，13mmol)、4-溴-2,6-二氟苯甲酸(3.12g， 13.16mmol)和HBTU(4.99g，13.16mmol)在DMF(60mL)中的混悬液添加二 异丙基乙基胺(6.8mL，39mmol)。1min后，将所有物质溶于溶液中，于室 温将溶液搅拌36h。将褐色溶液倒入水(500mL)中，得到混浊混悬液。然后， 将有机化合物用乙酸乙酯萃取(2x200mL)。将合并的萃取液相继用1N盐酸 (100mL)、饱和碳酸氢钠溶液(100mL)和盐水溶液(200mL)洗涤，经无水硫 酸镁干燥。过滤干燥剂和浓缩溶剂，得到粗产物，其使用ISCO(400g)柱色 谱纯化，得到14.1g(85％收率)为无定形类白色固体的(S)-2-(4-溴-2,6-二氟 苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基] 丙酸丙酯。ES-HRMS m/e C₂₆H₂₆BrF₂N₃O₅(M+H)⁺的计算值578.1097，实 测值578.1096。

步骤4：(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二 氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备

于室温向(S)-2-(4-溴-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二 氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(5.78g，10mmol)、氰化锌(940mg， 8mmol)和四(三苯基膦)钯(1.16g，1mmol)在DMF(40mL，经蒸馏和脱气) 中的混悬液。将所得溶液加热至85℃，搅拌24h，此时混合物的TLC分析 指示不存在起始材料。然后，将反应混合物冷却至室温，将其倒入水 (100mL)，得到混浊混悬液。然后，将有机化合物用乙酸乙酯萃取(2x 100mL)。将合并的萃取液用盐水溶液(100mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥。 过滤干燥剂和浓缩溶剂，得到粗产物，其使用ISCO(150g)柱色谱纯化，得 到5.2g(99％收率)为无定形白色固体的(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟苯甲酰基氨 基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯。 ES-HRMS m/e C₂₇H₂₆F₂N₄O₅(M+H)⁺的计算值525.1944，实测值525.1942。

步骤5：(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基 -2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备

向硼氢化钠(0.29g，7.62mmol，2当量)在THF(5ml)中的溶液添加TFA (566μl，7.62mmol，2当量)，将反应搅拌10min，然后逐滴添加(S)-2-(4-氰 基-2,6-二氟-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧 啶-5-基)-苯基]-丙酸丙酯(2.0g，3.81mmol)在THF(6ml)中的溶液(将烧瓶用 w/THF漂洗(2x1ml)，添加至反应)。将反应于室温在氮气下搅拌1.3h。将 反应混合物在冰浴中冷却，用水(20ml)和氯化钠溶液(20ml水，100ml饱和 溶液)淬灭。将含水混合物用DCM萃取(2x200ml)，将有机层用盐水洗涤， 合并，经硫酸镁干燥，浓缩，得到类白色固体1.77g。将粗品悬浮于乙酸异 丙酯(75ml)和异丙醇(0.75ml)中，逐滴添加TMSCl(1ml)。将反应在室温搅 拌2h，将白色沉淀过滤，用乙酸异丙酯和己烷洗涤，得到1.5g(63％收率) 为无定形白色固体的(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6- 三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯。ES-HRMS m/e  C₂₇H₃₀F₂N₄O₅(M+H)⁺的计算值529.2257，实测值529.2258。

步骤6：(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基 -2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备

于室温向(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基 -2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(508mg，0.96mmol)在 THF(10mL)中的混悬液添加氢氧化锂(240mg，10mmol)在水(2mL)中的溶 液。将混合物搅拌15h，此时TLC分析指示不存在起始材料。然后，在减 压下除去THF，将残余物用水(100mL)稀释，将混合物用TFA酸化。将粗 品通过HPLC方法纯化，得到450mg(78％收率)为白色固体的(S)-2-(4-氨基 甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧 啶-5-基)苯基]丙酸，为TFA盐。ES-LRMS m/e C₂₄H₂₄F₂N₄O₅(M+H)⁺的计 算值487，实测值487。

步骤7：(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯 -1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4- 二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备

由(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二 氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸TFA盐(121mg，0.2mmol)、 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧 代-吡咯烷-1-基酯(100mg，0.145mmol)和DIPEA(258mg，348uL，2.0mmol) 开始，使用αvβ3配体1的通用方法步骤10中所述的类似方法，在HPLC纯化 后获得80mg(38％收率)为白色固体的 (S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基 氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基 氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4- 四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸。ES(+)-HRMS m/e C₅₀H₆₆F₂N₆O₁₇(M+H)⁺的计算 值1061.4526，实测值1061.4521。

用于合成整联蛋白拮抗剂-衍生化壳聚糖的方法

定义

相对于起始壳聚糖的乙酰基的已知值，通过硫代乙酰基、烷基、芳族 峰或组合平均值的¹H NMR积分来确定负载率值。负载率百分比以摩尔％ 报道。所负载的配体的浓度以相对于每毫克壳聚糖中生物聚合物单体的平 均分子量的配体毫微摩尔数报道。单体的平均分子量由每个单体的分子量 的摩尔百分比的总数确定。N值被报道为每毫克壳聚糖的伯胺的微摩尔数， μmol/mg。下列缩写具有以下定义：

Cs＝壳聚糖，

NM＝Nova Matrix(目录号UP B80/20)、Protosan(壳聚糖的商标名) 14％乙酰化，按原样使用，

AK＝AK scientific(目录号K638)、壳聚糖、2.5％乙酰化，按原样使 用，

Pr-S＝3-巯基-丙酰胺

Pr-S-Ac＝硫代乙酸S-(2-氨甲酰基-乙基)酯-酰胺

PEG12＝

此外，下表描述了本发明式I中的哪个变量适用于每个上文制备的命名 配体。例如，表中R1为：(1)αVβ3的小分子拮抗剂：

或(2)α4β1的小分子拮抗剂：

同样，Y为：(1)酰胺-丙酰基-巯基-马来酰亚胺-丙酰基-酰胺(Pr-S-Mal)、 或(2)琥珀酸酰胺(Suc)；并且剩余变量的说明根据详述起始时对于式I所述 的变量是不言自明的。

实施例1

Cs(NM)-αvβ3配体3(0.3％负载率)(壳聚糖衍生物D)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)

在Erlenmeyer烧瓶中添加Protosan(novamatrix(NM)(200mg， 1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(153mg，1.13mmol，Eq:1.0)、3-(乙 酰基硫基)丙酸(836μg，5.64μmol，Eq:0.005)和水(50mL)。将混合物搅拌 直至形成澄清无色溶液，然后用乙腈(50.0mL)稀释。向其添加EDC (3.25mg，16.9μmol，Eq:0.015)，将反应于RT搅拌13小时。将反应用1mL 0.1M HCl部分酸化，浓缩，转移至透析包(10K MWCO,Thermo Scientific, Snake Skin)，并用4L2.5％NaCl溶液透析3h，用2％透析5h，用1％透析6h， 用0.5％透析2h，用水透析12h4次。冻干透析液，得到类白色纤维状固体 158mg。负载率通过与1.9ppm处的N乙酸酯的甲基(假定14％)相比在 2.21ppm处硫代乙酸酯的甲基的¹H NMR积分确定，为0.26摩尔％, 13.3nmol/mg，且N值为4.32nmol/mg(0.26％,13.3nmol/mg，N 4.32μmol/mg)。

步骤2：Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)

在20mL小瓶中，将Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)(46.6mg)与HCl(0.1M) (15.0mL，之前用氮气脱气)合并，得到澄清微黄色溶液。将溶液用氮气(1min) 吹扫，密封，包裹于铝箔中，在加热块中在100℃于暗处加热。4h后，将小 瓶放置于冰箱(-20℃)中过夜。第二天，将反应转移至圆底烧瓶(200mL)， 用0.1M HCl(之前用氮气脱气)漂洗，在减压下浓缩，产生澄清至不透明的 类白色膜/薄片固体。立即按原样使用该材料(0.26％,13.3nmol/mg)。

步骤3：Cs(NM)-αvβ3配体3(0.3％负载率)(壳聚糖衍生物D)

在梨形圆底烧瓶中，将Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)(44mg，13.3nmol/mg， 0.585μmol)溶解于水(5mL，之前用氮气脱气)中。用NaOH水溶液(1M)将反 应的pH调节至pH6.2-6.3。将αvβ3配体3(2.13mg，1.72μmol,Eq3)在测试 管中溶解于DMSO(1mL和0.5mL漂洗；之前用氮气脱气)中，然后通过移 液管转移至反应。将反应于RT在氮气下搅拌11h。将反应酸化(HCl,0.1M, 3mL)，用NaCl水溶液(5mL，10％)稀释，搅拌5-10min。将反应转移(且用 水5mL漂洗1次)至Vivacell70(Sartoriusstedim)膜离心设备(10K MWCO)。 将溶液通过离心(～1K)浓缩，将渗余物重新悬浮，用水浓缩3次，用w/0.001 M HCl浓缩1次。用两次漂洗的水(1mL/ea)将渗余物转移至具有0.45μm PVDF(Gelman Acrodisc)注射器式滤器的注射器，过滤，冻干，得到白色 纤维状固体11mg。配体的负载率通过与1.9ppm处的乙酸酯的甲基相比在 6.85ppm处的芳族峰和2.33ppm处的亚甲基峰的四舍五入均值的¹H NMR 积分确定，为0.3％(15nmol/mg)，N值为4.2μmol/mg(0.3％,15nmol/mg，N 4.2μmol/mg)。该值基于NMR。

实施例2

Cs(NM)-αvβ3配体3(0.6％负载率)(壳聚糖衍生物E)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.47％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法，由Protosan(200mg， 1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(153mg，1.13mmol，Eq:1.0)、3-(乙 酰基硫基)丙酸(1.67mg，11.3μmol，Eq:0.01)和EDC(6.49mg，33.9μmol， Eq:0.03)制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体，176mg)。(0.47％,N 4.30nmol/mg)

步骤2：壳聚糖(NM)-Pr-SH(0.47％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-S-Ac (0.47％)(47.5mg)制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)。按原样使 用材料(0.47％,23.7nmol/mg)。

步骤3：Cs(NM)-αvβ3配体3(0.6％负载率)(壳聚糖衍生物E)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-SH (0.47％)(42mg，23.7nmol/mg，0.995μmol)和αvβ3配体3(3.7mg，2.99μmol, Eq.3)制备产物(白色纤维状固体，20mg)。(0.6％(29nmol/mg，N4.1μmol/mg)

实施例3

Cs(NM)-αvβ3配体3(1.9％负载率)(壳聚糖衍生物F)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(1.9％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法，由Protosan(200mg， 1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(153mg，1.13mmol，Eq:1.0)、3-(乙 酰基硫基)丙酸(5.02mg，33.9μmol，Eq:0.03)和EDC(19.5mg，102μmol， Eq:0.09)制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体，226mg)。(1.9％,N 4.20nmol/mg)。

步骤2：Cs(NM)-Pr-SH(1.9％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-S-Ac(1.9％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(48mg)。按原样使用材料 (1.9％,95.3nmol/mg)。

步骤3：Cs(NM)-αvβ3配体3(1.9％负载率)(壳聚糖衍生物F)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-SH (1.9％)(45mg，95.3nmol/mg，4.29μmol)和αvβ3配体3(15.9mg，12.8μmol,Eq 3)制备产物(白色纤维状固体，28mg)。(1.9％,89nmol/mg，N3.7μmol/mg)。

实施例4

Cs(NM)-αvβ3配体3(6％负载率)(壳聚糖衍生物G)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(6.1％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法，由Protosan(200mg， 1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(153mg，1.13mmol，Eq:1.0)、3-(乙 酰基硫基)丙酸(10mg，67.7μmol，Eq:0.06)和EDC(39mg，203μmol，Eq:0.18) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体，43mg)。(6.1％,N 3.92nmol/mg)

步骤2：Cs(NM)-Pr-SH(6.1％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-S-Ac(6.1％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(32.5mg)。直接按原样使用 材料(6.05％,300.1nmol/mg)。

步骤3：Cs(NM)-αvβ3配体3(6％负载率)(壳聚糖衍生物G)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-SH (6.1％)(30mg，300.1nmol/mg，9.00μmol)和αvβ3配体3(32.7mg，26.4μmol, Eq.3)制备产物(白色纤维状固体，17mg)。(6％,217nmol/mg，N 2.9μmol/mg)。

实施例5

Cs(NM)-αvβ3配体3(5％负载率)(壳聚糖衍生物H)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(8.8％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法，由Protosan(200mg， 1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(153mg，1.13mmol，Eq:1.0)、3-(乙 酰基硫基)丙酸(15.1mg，102μmol，Eq:0.09)和EDC(58.4mg，305μmol， Eq:0.27)制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体，165mg)。(8.8％,N 3.73nmol/mg)。

步骤2：Cs(NM)-Pr-SH(8.8％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法,由Cs(NM)-Pr-S-Ac(8.8％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(48mg)。直接按原样使用材 料(8.84％,435.4nmol/mg)。

步骤3：Cs(NM)-αvβ3配体3(5％负载率)(壳聚糖衍生物H)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法，由Cs(NM)-Pr-SH (8.8％)(32mg，435.4nmol/mg，13.9μmol)和αvβ3配体3(50.5mg，40.8μmol, Eq.2.9)制备产物(白色纤维状固体，15mg)。(5.3％,198nmol/mg，N 3.0μmol/mg)。

实施例6

Cs(AK)-αvβ3配体2(0.15％负载率)(壳聚糖衍生物A)

步骤1：Cs(Ak)-Pr-S-Ac(0.7％)

由购自Chitosan(AK)的壳聚糖(200mg)(200mg，1.13mmol)、1H-苯并 [d][1,2,3]三唑-1-醇(168mg，1.24mmol，Eq:1.1)、3-(乙酰基硫基)丙酸 (1.67mg，11.3μmol，Eq:0.01)和EDC(64.9mg，339μmol，Eq:0.3)、通过 与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法制备产物(白色纤维状固体， 154mg)。(0.7％,34.8nmol/mg，N4.88nmol/mg)。

步骤2：Cs(Ak)-Pr-SH(0.7％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法，由Cs(Ak)-Pr-S-Ac(0.7％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(54mg)。立即按原样使用材 料(0.69％,34.8nmol/mg)。

步骤3：Cs(AK)-αvβ3配体2(0.15％负载率)(壳聚糖衍生物A)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法、由Cs(Ak)-Pr-SH (0.7％)(36mg，0.69％,34.8nmol/mg，1.25μmol)和αvβ3配体2(3.7mg， 2.84μmol,Eq.2.3)制备产物(白色纤维状固体，41mg)。(0.15％,7.5nmol/mg， N4.87μmol/mg)。

实施例7

Cs(AK)-αvβ3配体2(0.21％负载率)(壳聚糖衍生物B)

步骤1：Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.5％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法、由购自Chitosan(AK)的 壳聚糖(200mg)(200mg，1.13mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(168mg， 1.24mmol，Eq:1.1)、3-(乙酰基硫基)丙酸(4.18mg，28.2μmol，Eq:0.025) 和EDC(64.9mg，339μmol，Eq:0.3)制备产物(白色纤维状固体，108mg)。 (1.5％,73.8nmol/mg，N4.82nmol/mg)。

步骤2：Cs(Ak)-Pr-SH(1.5％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法、由Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.5％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(49mg)。立即按原样使用材 料(1.5％,73.8nmol/mg)。

步骤3：Cs(AK)-αvβ3配体2(0.21％负载率)(壳聚糖衍生物B)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法、由Cs(Ak)-Pr-SH (1.5％)(28mg，1.5％,73.8nmol/mg，1.85μmol)和αvβ3配体2(5.2mg， 4.16μmol,Eq.2.2)制备产物(白色纤维状固体，38mg)。(0.21％,10.6nmol/mg， N4.85μmol/mg)。

实施例8

Cs(AK)-αvβ3配体2(0.76％负载率)(壳聚糖衍生物C)

步骤1：Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.8％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法、由购自Chitosan(AK)的 壳聚糖(205mg)(205mg，1.16mmol)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(208mg， 1.54mmol，Eq:1.33)、3-(乙酰基硫基)丙酸(10.5mg，70.9μmol，Eq:0.061) 和EDC(78mg，407μmol，Eq:0.352)制备产物(白色纤维状固体，77mg)。 (1.8％,88.5nmol/mg，N4.80nmol/mg)。

步骤2：Cs(Ak)-Pr-SH(1.8％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法、由Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.8％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)(50mg)。立即按原样使用材 料(1.8％,88.5nmol/mg)。

步骤3：Cs(AK)-αvβ3配体2(0.76％负载率)(壳聚糖衍生物C)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法、由Cs(Ak)-Pr-SH (0.38％)(29mg，3.7％,182.3nmol/mg，5.29μmol)和αvβ3配体2(12.4mg， 9.92μmol,Eq.1.9)制备产物(白色纤维状固体，41mg)。(0.76％,36.7nmol/mg， N4.66μmol/mg)。

实施例9

Cs(NM)-VLA₄配体1(21％负载率)(壳聚糖衍生物I)

步骤1：Cs(NM)-Pr-S-Ac(25％)

通过与Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26％)类似的方法、由Protosan(280mg， 1.58mmol)、3-(乙酰基硫基)丙酸(185.2mg，1.25mmol，Eq:0.79)和EDC (160mg，835μmol，Eq:0.528)制备产物(白色固体)。(25％,1180nmol/mg)。

步骤2：壳聚糖(NM)-Pr-SH(25％)

通过与Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)类似的方法、由Cs(NM)-Pr-S-Ac(25％) 制备产物(澄清至不透明的类白色膜/薄片固体)。按原样使用材料(25％, 1180nmol/mg)。

步骤3.Cs(NM)-VLA₄配体1(壳聚糖衍生物I(21％负载率)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法、由Cs(NM)-Pr-SH (25％)(16.7mg，1180nmol/mg，19.8μmol)、DIEA(2.5μl，14.5μmol，Eq.1) 和VLA₄配体1(15.5mg，14.5μmol,Eq.0.7)制备产物(白色纤维状固体， 10mg)。将反应用溴-乙酰胺(Eq.50)淬灭，用1M HCl酸化，用乙酸乙酯和 己烷混合物进行液体萃取，通过透析纯化(21％,480nmol/mg，N 1.4μmol/mg)。

实施例10

Cs(NM)-VLA₄配体3(18％负载率)(壳聚糖衍生物J)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法、由Cs(NM)-Pr-SH (25％)(18.3mg，1180nmol/mg，21.6μmol)、DIEA(3.7μl，21μmol，Eq.1) 和VLA₄配体3(22.5mg，21.2μmol,Eq.1)制备产物(白色纤维状固体， 13.4mg)。将反应用溴-乙酰胺(Eq.22)淬灭，用1M HCl酸，通过滤过Amicon  Ultra-15,10K NMWL膜进行纯化。(18％(440nmol/mg，N1.4μmol/mg)。

实施例11

Cs(NM)-VLA₄配体2酸(4％负载率)(壳聚糖衍生物K)

步骤1：Cs(NM)-VLA₄配体2-叔丁酯

在20mL小瓶中，将Cs(NM)(壳聚糖)(16.9mg，83.6μmol，Eq:4)和HOBT (12.8mg，N4.33μmol/mg，55.4μmol，Eq:2.7)与水(10mL)合并，得到混悬 液。将混合物在RT搅拌1.5h以溶解，并形成CS-HOBT盐。通过两次漂洗 (1mL和0.5mL)分滴或分批添加含有VLA₄配体2-叔丁酯(41.3mg，20.9μmol， Eq:1.00))的DMSO溶液(0.55ml)，将反应混合物在RT搅拌过夜持续19h。 然后，将反应混合物用HCl水溶液(1M,0.5mL)酸化，于室温搅拌1h，通过 Amicon膜(Ultracell10K MWCO,5000g)过滤(通过离心)，用水洗涤(4x 7mL，5000g，1-2h)。每次的渗余物(0.5-1mL)为浅黄色非常粘稠的油状物， 具有粘稠浆状物或蜂蜜状物的稠度，小心确保在离心之前完全混合。将终 渗余物溶解于～20mL水中，转移至两个20mL小瓶，经周末冻干，得到为白 色固体的Cs(NM)-VLA₄配体2-叔丁酯(26mg，其按原样使用用于下一步骤)。

步骤2：Cs(NM)-VLA₄配体2酸(4％负载率)(壳聚糖衍生物K)

向Cs(NM)-VLA₄-配体2-叔丁酯(26mg，来自上述反应)添加HCl水溶液 (0.2M,10mL)，于RT在振荡下在20mL中搅拌。材料溶胀，变为浅黄色， 具有“肥皂泡沫”外观。该材料未完全溶解，用抹刀搅动以将材料破坏成 更小的碎片，将反应容器密封，放置于于100℃的加热块中，10分钟后所有 物质溶解，肥皂泡沫消失。1.5h后，将小瓶从热源移除，允许冷却至RT。 溶液中存在颗粒，将溶液通过沃特曼(#1)滤纸过滤，将滤液通过Amicon膜 (Ultracell10K MWCO,5000g)过滤(经由离心)而纯化，用稀HCl(10mL 0.01M HCl和10mL0.005M HCl10mL)洗涤。将渗余物冻干3.5天，得到为 白色固体的Cs(NM)-VLA₄配体2酸(13mg，144nmol/mg，N3.15μmol/mg)。

实施例12

Cs(NM)-Pr-S-PEG12(0.14％负载率)(壳聚糖衍生物L)

Cs(NM)-Pr-S-Peg12(0.14％负载率)(壳聚糖衍生物L)

通过与用于制备壳聚糖衍生物D的方法类似的方法制备产物(白色纤维 状固体，12mg)。但是在该方法中，将Cs(NM)-Pr-SH(0.26％)(26.8mg， 13.3nmol/mg，0.356μmol)与缺少任何靶向元件并以甲氧基封端的PEG试剂 反应：3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- 甲氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙基]丙酰胺(2.5mg，3.5μmol,Eq.10)，产生壳聚糖衍生 物L(0.14％,6.9nmol/mg，N4.3μmol/mg)。

Cs(NM)-Pr-S-Peg12(0.83％负载率)(壳聚糖衍生物M)

通过与用于制备壳聚糖衍生物D的方法类似的方法制备产物(白色纤维 状固体，12mg)。但是在该方法中，将Cs(NM)-Pr-SH(0.47％)(27mg， 23.7nmol/mg，0.640μmol)与缺少任何靶向元件并以甲氧基封端的PEG试剂 反应：3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- 甲氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙基]丙酰胺(4.6mg，6.4μmol,Eq.10)，产生壳聚糖衍生 物M(0.83％,40.3nmol/mg，N4.16μmol/mg)。

Cs(NM)-Pr-S-Peg12(1.4％负载率)(壳聚糖衍生物N)

通过与用于制备壳聚糖衍生物D的方法类似的方法制备产物(白色纤维 状固体，13mg)。但是在该方法中，将Cs(NM)-Pr-SH(1.9％)(24.3mg， 95.3nmol/mg，2.32μmol)与缺少任何靶向元件并以甲氧基封端的PEG试剂 反应：3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- 甲氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙基]丙酰胺(16.5mg，23.2μmol,Eq.10)，产生壳聚糖衍 生物N(1.4％,65.3nmol/mg，N4.05μmol/mg)。

Cs(NM)-Pr-S-Peg12(5.3％负载率)(壳聚糖衍生物O)

通过与用于制备壳聚糖衍生物D的方法类似的方法制备产物(白色纤维 状固体，7mg)。但是在该方法中，将Cs(NM)-Pr-SH(6.1％)(25.5mg， 300.1nmol/mg，7.65μmol)与缺少任何靶向元件并以甲氧基封端的PEG试剂 反应：3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- 甲氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙基]丙酰胺(27.3mg，38.4μmol,Eq.5)，产生壳聚糖衍 生物O(5.3％,220nmol/mg，N3.39μmol/mg)。

Cs(NM)-Pr-S-Peg12(9.6％负载率)(壳聚糖衍生物P)

通过与Cs(NM)-Pr-S-αvβ3配体3(0.3％)类似的方法制备产物(白色纤 维状固体，13mg)，只是将Cs(NM)-Pr-SH(8.8％)(27.2mg，435.4nmol/mg， 11.8μmol)与缺少任何靶向元件并以甲氧基封端的PEG试剂反应：3-(2,5-二 氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-甲氧基乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙基]丙酰胺(42.9mg，60.4μmol,Eq.5)，产生壳聚糖衍生物P(9.6％, 353nmol/mg，N2.82μmol/mg)。

VLA-4(α4β1)结合测定

对具有下式IA的通用结构、与小分子α4β1拮抗剂共价连接的壳聚糖评 估其α4β1(VLA-4)结合亲和性：

其中R1为

且其中剩余变量如式I中所定义。

先前已报道下列粘附测定并经微小变更用于本发明。参见美国专利No. 6,229,011和6,380,387，两者均通过引用以其整体并入本文。使用Jurkat基 于细胞的测定(以下)确定连接于VLA-4(α4β1)靶向化合物(来自实施例)的 壳聚糖聚合物衍生物的功能体外效力，因为Jurkat细胞在其膜表面上表达 高水平的VLA-4。在96孔板中进行每个测定，VCAM-1用作细胞的反配体 (即VCAM-1结合于孔的表面)。

更具体而言，用25ng/孔的VCAM-1涂敷96孔高结合F96Maxisorp  Immuno微量滴定板(Nunc)。试验当天，用含有1％无脂奶粉的PBS缓冲液 将平板封闭1小时以消除非特异性结合。然后将平板用DPBS(Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水)洗涤并印迹干燥。小心地从孔抽吸任意过量液体。

作为对照，将在含有4％DMSO的缓冲液中的用于抑制VLA-4的小分子 拮抗剂(27)：

添加至对照孔并稀释平板，通常为1000nM至0.2nM的浓度范围。Jurkat克 隆E6-1细胞(ATCC)用100μg/ml6-羧基荧光素二乙酸盐(一种荧光染料)标 记，然后用含有0.5mM二价阳离子Mn²⁺和0.05％牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基活化。注意到，需要这种活化以实现最高结合，因为配体可刺 激细胞因子和趋化因子体内对整联蛋白的活化。确定对照化合物(27)具有 约12nM的IC₅₀(即50％的细胞未结合于各孔表面上的VCAM-1，因为细胞 的VLA-4受体可能结合于或缔合于对照化合物)。

为了评估VLA-4靶向壳聚糖(来自实施例)的VLA-4抑制作用，将Jurkat 细胞(表达高水平的LA-4)添加至VCAM-1涂敷的平板，以在96孔板中达到2 x10⁵个细胞/孔的最终浓度，允许于37℃与测试壳聚糖(来自实施例)一起孵 育45分钟。通过用PBS温和洗涤孔来去除未结合细胞后，来自结合细胞的 荧光信号在Tecan Safire2酶标仪上于450nm读数。将各点作图，并通过回 归分析、使用浓度-响应曲线的线性部分来确定每种衍生化壳聚糖聚合物的 IC₅₀。这些结果在下面示于表1中：

表1

α-V-β-3(αVβ3)结合测定

对具有下式IA的通用结构、与小分子αVβ3拮抗剂共价连接的壳聚糖评 估其的αVβ3结合亲和性：

其中R1为：

且其中剩余变量如在式I中所定义。

人αVβ3固相测定：

通过向各孔添加100uL avβ3(1x)并将平板在4℃孵育过夜，将 Immuno96孔板(NUNC,Part#439454)用avβ3(R&D,Cat#3050-AV)涂 敷。所用缓冲液为缓冲液A：20mM Tris、150mM NaCl、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂,pH7.4。去除涂敷剂后，在37℃向各孔添加150uL3.5％在缓冲液A 中的BSA以封闭平板105分钟。封闭后，将平板用200uL缓冲液B(缓冲液A +1mM MnCl₂)洗涤5次。然后向各孔添加50uL在5％DMSO中的化合物溶 液(2x)和50uL纤维蛋白原(2x)(Innovative Research,Cat#IFIB)。将平板振 摇2分钟，然后在37℃孵育2小时。将平板用200uL缓冲液B洗涤5次后，将 100uL/孔的量的第1抗体兔抗人纤维蛋白原(Innovative Research,Cat  IASHFBGN-GF)，以及50uL/孔的量的第2抗体山羊抗兔IgG辣根过氧化物 酶缀合物(Invitrogen,Cat#G21234)分别添加至平板。在添加第1抗体后以及 在添加第2抗体后，将平板振摇2分钟，在37℃孵育60分钟，然后相应地用 200uL缓冲液B洗涤5次。固相测定的最终条件为：[avβ3]＝1.25ug、[纤维 蛋白原]＝0.75ug/mL、[抗-FG]＝1/2400(经稀释的)、[HPR-抗兔]＝1/1000 (经稀释的)。当结合测定结束时，向平板添加100uL/孔检测试剂ABTS(试 剂A和试剂B的混合物)(KPL,Cat#50-62-00)。将平板在RT振摇5-8min，逐 渐呈现绿色。被添加100uL/孔终止缓冲液(1.0M磷酸(HPO4))后，以吸光率 模式450nm在Envision上对平板读数。确定对照化合物(28)的IC₅₀为约2nM (即50％细胞未结合于在各孔表面上的αVβ3，因为细胞的αVβ3受体可能结 合于或缔合于对照化合物)：

结果示于下面表2中。

表2

在细胞系统中用于敲低AHA1mRNA的、与共价连接与小分子整联蛋白拮抗剂的壳聚糖一起形成的siRNA纳米粒子的测定

在数种系统中对用于靶向递送siRNA的与小分子整联蛋白拮抗剂共价 连接的壳聚糖评价它们促进靶向RNA信使的细胞内敲低的效力。在测定中 使用靶向管家基因AHA1的mRNA的siRNA，以在A549、KB和 MDA-MB0435细胞(因为此类细胞可用于评价假定的抗癌活性)中根据下列 方法测试该siRNA敲低其表达的能力。

材料和方法

siRNA：30nM的siAHA

细胞：A549、KB,MDA-MB435

转染剂：将壳聚糖重悬浮于0.2M乙酸钠(ph5.5)中，以达到以mg/ml计 的N/P重量比，如下表所示。将小瓶放置于振荡器上过夜。

制备壳聚糖溶液在0.2M乙酸钠(ph5.5)中的十倍浓度储备液。类似地， 制备储备液siRNA在OptiMEM中的十倍浓度储备液。将等体积的壳聚糖和 siRNA组合以在24孔板中制备5x siRNA/壳聚糖络合物，将它们在振摇器上 混合两小时。

正向转染(forward transfection)：将细胞以7x10⁴个细胞/mL和80ul/孔 铺板于96孔中，得到在含有10％血清的培养基中的终浓度为5x10³个细胞/ 孔。将这些平板在37℃孵育过夜。此时，将20ul siRNA/壳聚糖络合物转移 至所铺板的细胞。然后在37℃将所铺板的细胞孵育48小时。

用如供应商所报道的Quanti Gene(QG)测定法测量siRNA敲低的效力。 用Cell Titer Glow对用于Quantigene测定(来自Panomics of Affymetrix, Santa Clara,CA)的同一孔的细胞进行Quanti Gene Cell活力(CV)试验。结 果示于表3和图1、2和3中。

图1、2和3显示在A549、KB和MDA MB-54细胞中当用通过siRNA和衍 生化壳聚糖的组合产生的siRNA纳米粒子处理时AHA1表达减少。y轴指示 所观察到的AHA1的表达水平。较低的条柱指示较高的敲低度(较高的 siRNA转染度)；较高的条柱，指示较低的敲低度(即较低的siRNA转染度)。 壳聚糖衍生物L、M、N、O和P不含靶向配体；而衍生化在PEG中终止。 壳聚糖衍生物L、M、N、O和P的装入该PEG改性的程度不同：分别为0.14％、 0.83％、1.4％、5.3％和9.6％。壳聚糖衍生物D、E、F、G和H含有αVβ3 靶向配体3，其已被装入以达到下列水平：分别为0.3％、0.6％、2％、6％ 和5％。根据这些敲低数据，在A549和MDA MB-549中，αVβ3-衍生化壳聚 糖壳聚糖衍生物D和壳聚糖衍生物E比用单独PEG连接体以任意衍生化百 分比衍生化的那些壳聚糖更有效。αVβ3-衍生化壳聚糖壳聚糖衍生物D和壳 聚糖衍生物E两者也比未改性的壳聚糖更有效。在KB细胞中，αVβ3-衍生 化壳聚糖壳聚糖衍生物D和壳聚糖衍生物E比其它壳聚糖制品相对更有效。 Dharmafect为商购可得的转染试剂，其为广泛使用的转染剂。

表3