基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用

摘要

本发明公开一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。通过基因重组得到的RMP16，与天然TNF-α相比，在血液中具有更高的稳定性和生理活性，可显著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的生长，对DU145的抑制效果尤为突出，且可抑制显著Du145细胞移植瘤的生长，其药效学作用与雌莫司汀相似，Du145细胞移植瘤裸鼠，结果显示，重组多肽RMP16的毒副作用明显小于雌莫司汀，无明显的毒副作用表现。该基因重组TNF-α衍生物RMP16可应用于制备具有如下功能的药物：治疗前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组TNF-α衍生物 RMP16及其制备方法与应用。

背景技术

TNF-α是较早发现的、研究最为深入的肿瘤坏死因子家族成员之一，抗肿 瘤作用强，参与多种生理病理过程的调节。人TNF-α为单拷贝基因，定位在第 六号染色体上(6P^12-13)，与MHC基因群紧密连锁；TNF-α的cDNA大小约 2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α前体由233个氨基酸残基 组成，包括由第1、2号外显子编码的76个氨基酸残基的信号肽；切除信号肽 后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，为157个氨基酸残基，相对分子量为17kDa.。 其中第69位和101位为两个半胱氨酸，可形成分子内二硫键，对维持其空间结 构有重要意义。

TNF-α作为一种蛋白类因子，其生物学活性主要是通过和细胞膜上特异受 体结合实现的。TNF-α有两种受体，一种是存在于大部分细胞表面的分子量为 55-60kDa.的肿瘤坏死因子受体Ⅰ(tumor necrosis factor receptor Ⅰ，TNFR Ⅰ)， 另一种是主要存在于造血细胞表面的分子量为75-80kDa.的肿瘤坏死因子受体 Ⅱ(tumor necrosis factor receptor Ⅱ，TNFR Ⅱ)。两类TNFR均为跨膜糖蛋白， 氨基酸序列分析显示这两种受体的胞外结构域的序列高度相似，都有保守的富 含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞内结构域却差异很大，TNFR Ⅰ胞内段含 有死亡结构域(death domain，DD)，而TNFR Ⅱ没有DD。TNFR Ⅰ在大多数种 类细胞的表面都表达，且大部分生物学功能是由TNFR Ⅰ介导，包括杀细胞、抗 病毒、诱导ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖、激活NF-κB等。TNFRII 主要传递胸腺细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNF-α与TNFR  Ⅰ结合而增加TNFR Ⅰ诱导的作用。根据细胞及其微环境的不同，激活TNFR Ⅰ 后可通过激活不同的信号途径介导细胞增殖、凋亡、坏死性凋亡等程序。

TNF-α具有很好抗肿瘤作用，被认为是最具潜质的癌症治疗药物。但TNF-α 在体内易被肾快速排泄和被各种蛋白酶分解，很不稳定，半衰期较短(15-30min)。 若希望达到疗效，则必须频繁注射大剂量TNF-α，进而导致严重的不良反应， 甚至引起休克死亡。TNF-α的上述缺陷，严重限制了其实际临床应用，

研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、无免疫原性、 结构简单、易于穿透肿瘤细胞等特点，已成为肿瘤药物研发的新热点。这些都 预示着小分子TNF-α衍生物在临床方面将有良好的应用前景。设计高稳定性、 高生物活性的TNF-α衍生物，特别是能与血浆中的载体蛋白结合的小分子TNF-α 衍生物，可提高其生物利用度，发挥天然TNF-α抗肿瘤的同时，也极大降低了 天然TNF-α具有的副作用。具有重要的药用价值和产业化前景。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重 组TNF-α衍生物RMP16。该衍生物RMP16具有更高稳定性和更高生物活性。

本发明的另一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方 法。该制备方法根据TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏 好性，设计RMP16在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白 内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽RMP16的高效制备；该制备方 法生产效率高，生产成本低。

本发明的再一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基因重组TNF-α衍生物RMP16， 其氨基酸序列如下所示：MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。

编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列为：

ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCA TACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG；

所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成RMP16基因：

采用3条引物两步法合成RMP16基因：

引物F1：

5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCC TG-3'；

引物F2：

5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；

引物F3：

5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTC ACCGCAAT-3'；

其中，CATATG为Nde Ⅰ酶切位点，GCTCTTCCGCA为Sap Ⅰ酶切位点； GGTGGT和CCACCAT为保护碱基；

首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以 F1和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因；

(2)构建重组载体pTXB1-RMP16：

用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXB1和步骤(1)制得的RMP16基因进 行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXB1连接，得到 重组载体pTXB1-RMP16；

(3)制备表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：

用重组载体pTXB1-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli Strain ER2566， 得到表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽 和几丁质结合域(Chitin binding domain，CBD)组成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于 几丁质柱中，然后含有β-巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；β- 巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽；然后用洗脱几 丁质柱的溶液洗柱，收集洗脱液；

③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组TNF-α衍生物 RMP16。

步骤(1)中所述的链延伸反应的条件优选为：94℃，10min；60℃，5min； 72℃，10min；

步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为：94℃，5min；94℃、30s，60 ℃、30s，72℃、30s，31次循环；72℃延伸10min；

步骤(4)②中所述的含有β-巯基乙醇的溶液的组成如下：20mM Tris-HCI， 0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0；

步骤(4)②中所述的反应的条件优选为23℃反应24小时；

步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下：20mM Tris-HCl， 500mM NaCI，1mM EDTA，pH 8.0；

步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤 如下：

A、流动相A为在体积百分比5％乙腈(CNCH₃，溶质为纯水)中添加三 氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％乙 腈(CNCH₃)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速 1mL/min，30min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由0～58％(v/v)，收集目的多肽洗脱峰，光 吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。

所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗如下疾病的药物：前 列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。

所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗TNFR Ⅰ型受体相关 疾病的药物，有如下作用：诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤 血管生成等作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明所制备的基因重组多肽RMP16，是TNF-α衍生物，与天然TNF-α 相比，它具有天然TNF-α的活性中心序列(75～94位氨基酸)，因此具有相似 的受体激动性，即高生物活性；同时，重组多肽RMP16克服了天然TNF-α易被 各种蛋白酶分解和代谢的缺陷，稳定性高，可结合血浆载体蛋白，体内半衰期 长。

(2)基因重组多肽RMP16克服了天然TNF-α由于特定的蛋白结构而存在 的副作用，且具有天然TNF-α通过激活受体TNFRI而产生的抗肿瘤作用。

这些区别使得重组多肽RMP16在生理环境中具有更高的稳定性和对TNFRI 受体的激活活性，与TNFRI受体结合后，激活TNF-α信号传导通路，发挥诱导 肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤血管生成等作用。

(3)本发明所制备的高稳定性基因重组TNF-α衍生物RMP16在治疗前列 腺癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓原白血病、食管癌等肿瘤中有显著的疗效。

(4)本发明的所述重组多肽RMP16的制备方法效率高、成本低，应用前 景广阔。

附图说明

图1是RMP16基因合成及重组表达质粒pTXB1-RMP16构建示意图；图中： MCS—多克隆位点；CBD—几丁质结合结构域；intein—内含肽。

图2是SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-RMP16表达的鉴定图；其中， 泳道1是IPTG诱导前菌体破碎上清液；泳道2是IPTG诱导后菌体破碎上清液。

图3是制备的重组多肽RMP16的飞行质谱鉴定图。

图4为制备的重组多肽RMP16对多种肿瘤细胞的生长抑制作用的检测结 果图。

图5为重组多肽RMP16对Du145移植瘤生长的抑制作用的检测结果图。

图6为重组多肽RMP16对治疗裸鼠的肝脏(图6A)、肾脏(图6B)的毒 副作用检测的病理切片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566的构建和表达

具体步骤如下：

(1)RMP16编码序列的获得：

按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码RMP16的cDNA，设计3条引物，采用 两步法获得该序列(如图1所示)：

引物F1：

5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCC TG-3'；

引物F2：

5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；

引物F3：

5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCA CCGCAAT-3'；

其中，CATATG为Nde Ⅰ酶切位点，GCTCTTCCGCA为Sap Ⅰ酶切位点； GGTGGT和CCACCAT为保护碱基。

①链延伸反应：

反应体系为：引物F1(250μM/L)2μL，引物F2(250μM/L)2μL，10×TaKaRa  Buffer(含有4mmol/L MgCl₂)2μL，dNTP 2μL，H₂O 11.5μL，TaKaRa Taq酶 0.5μL；

反应条件为：94℃，10min；降至60℃，5min；72℃，10min；

得到延伸反应液。

②PCR反应：

反应体系为：以延伸反应液为DNA模板，引物F1(25μM/L)2μL，F3(25μM /L)2μL，延伸反应液1.5μL，dNTP 2μL，10×TaKaRa Ex Buffer 2μL，TaKaRa Taq 酶0.5μL，H₂O 10μL；

反应条件为：94℃，5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，31次循 环；72℃延伸10min；

得到PCR产物。

(2)构建重组载体pTXB1-RMP16，如图1所示：

用NdeI和SapI进行酶切步骤(1)得到的PCR产物，利用PCR产物纯化 试剂盒进行纯化(根据说明书进行操作)。

用Nde Ⅰ和BspQ Ⅰ【Sap Ⅰ的同功酶，New England Biolabs(NEB)公司】对 上一步得到的PCR纯化产物进行酶切。先进行Nde Ⅰ单酶切，酶切反应体系： DNA(PCR纯化产物)2μg，10×NEB Buffer 5μL，Nde Ⅰ酶(20000U/mL)1μL， 补足超纯水至50μL，37℃酶切1.5h；Nde Ⅰ单酶切完成后，加入BspQ Ⅰ酶 (10000U/mL)1μL，50℃酶切1.5h。

质粒pTXB1(New England Biolabs(NEB)公司)也用Nde Ⅰ和BspQ Ⅰ(Sap  Ⅰ的同功酶)进行酶切，酶切条件同上。

将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXB1连接，连接体系和连 接时间、大肠杆菌DH5α(购自大连宝生物公司)感受态细胞的制作、转化以及 筛选(卡那霉素)，根据《分子克隆》进行操作。将RMP16基因克隆到质粒pTXB1 的NdeI和SapI位点间，得到重组载体pTXB1-RMP16。

(3)表达和纯化：

①将重组质粒pTXB1-RMP16转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566(New  England Biolabs(NEB)公司)，得到表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；挑取单 克隆于5mL含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(broth)培养基(简称LB培养 基)，摇菌培养过夜，再扩大，以体积比为1:100的比例接于1L含50mg/L卡那霉 素的LB培养基，37℃摇菌至OD₆₀₀为0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)) 至终浓度0.8mmol/L，37℃诱导表达6h。6000rpm离心20min收集菌体，将菌体重 悬于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl，500mM NaCI，1mM EDTA，pH 8.0) 中，然后用低温超高压连续流细胞破碎仪进行破碎，破碎条件为：Buffer A溶液 稀释菌体的浓度为18％(m/v)，破碎压力为1700bar，制冷温度为4℃。

破碎产物在4℃，20000rpm离心30min，收集上清，该上清称为破碎上清液。 SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-RMP16的表达，鉴定结果如图2所示。

实施例2

重组TNF-α衍生物RMP16的纯化、制备和鉴定

取20mL几丁质珠(NEB公司产品#S6651L)装填1.5×20cm层析柱，以10 倍柱体积的Buffer A溶液洗柱；实施例1中的破碎上清液以0.5mL/min的流速上 注；用10倍柱体积的Buffer A溶液以2mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结 合的融合蛋白，用60mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，1mM EDTA， 50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)自然过柱，使β-巯基乙醇均匀分布并浸泡柱内填料， 然后封闭进、出口端，上述反应体系在23℃反应24h，以诱导蛋白内含肽的N端 切割，释放目的多肽RMP16。用Buffer A溶液洗脱并用洁净的烧杯收集目的多肽 溶液，再经高效液相色谱(HPLC)纯化、制备得到纯度为质量百分比96％以上 的重组多肽RMP16，目的多肽的制备条件为：流动相A(5％CNCH₃:95％H₂O， 0.1％TFA)，流动相B(100％CNCH₃，0.1％TFA)，流速l mL/min，线性梯度 洗脱，收集目的多肽洗脱峰，检测波长218nm。目的多肽RMP16的纯度通过分 析性HPLC测定(条件同目的多肽的制备条件)。制备的目的多肽RMP16利用质 谱技术鉴定(结果如图3所示)，质谱检测分子量为3.786kDa.，与其理论值相符 合。

实施例3

制备的重组多肽RMP16对多种肿瘤细胞的生长的抑制作用

前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562细胞株(均购自美国菌种保藏 中心(ATCC))培养于RPMI-1640+10％FBS培养液(美国Gibco公司产品)中。 宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7细胞株(均购自美国菌种保藏中心(ATCC))培养 于DMEM+10％FBS培养液(美国Gibco公司产品)中。所有细胞株均培养在 37℃、饱和湿度及体积分数为5％的CO₂培养箱中，每隔2～3天换液或传代一 次，取对数生长期细胞，以6×10³个/孔接种于96孔板，每孔100μL，置CO₂培 养箱培养24h贴壁后，用一定浓度的药物进行处理48h，每浓度设6复孔，设置 实验组、对照组及空白组，倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。处理 结束采用CCK-8法进行细胞活力检测，每孔加入10μL CCK-8溶液(Yeasen公 司)，在培养箱内孵育1～2h(控制对照组细胞的OD值约1.0左右)，酶标仪 测定吸光度OD值(波长450nm，参考波长630nm)。

按下列公式计算药物对细胞的生长抑制率：生长抑制率IR(％)＝[1－(实 验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)]×100％。计算 各浓度的抑制率。

实验结果如图4所示，选取的5株肿瘤细胞株为研究对象，RMP16分别在 20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM的终浓度下作用48h，检测其细 胞生长抑制作用。经CCK-8检测，RMP16对5株人肿瘤细胞的生长均有明显的 抑制作用，RMP16具有广谱的抗肿瘤活性，对前列腺癌细胞DU145的抑制效果 尤为突出，对应的IC50为17.20±1.95μM。对人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的IC50 为228.31±35.35μM；对人慢性髓原白血病K-562细胞的IC50为150.34±33.54μM； 对人宫颈癌HeLa细胞的IC50为44.63±2.85μM；对人乳腺癌MCF-7细胞的IC50 为54.29±13.70μM。

实施例4

重组多肽RMP16对Du145移植瘤生长的抑制作用

BALB/c-nu/nu裸鼠【购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证 号0110231，许可证号：SCXK(粤)2008-0002】，30只，雄性，4周龄，体重17～ 19g，由暨南大学实验动物管理中心提供SPF级【Specific Pathogen free，许可证 号：SYXK(粤)2012-0117】条件饲养，恒定温度(22～24℃)，恒定湿度(50％～ 70％)，无特定病原体，12h黑白交替，每笼6只；饲养笼、垫料、饲料和水均 经高压蒸汽灭菌。隔离一周后，动物生长状况良好，进食进水正常，无异常病 态表现。

取对数生长期的人前列腺癌Du145细胞，用无血清的RPMI-1640培养基(美 国Gibco公司产品)重悬细胞，制备成细胞浓度为1.5×10⁷个/mL的单细胞悬液。 用酒精棉球消毒实验组裸鼠右侧背部皮肤，用1mL注射器于皮下接种Du145细胞 悬液0.2mL(约3×10⁶个细胞)/只，余下6只未接种肿瘤细胞，作为空白对照组。 接种一周后，裸鼠右侧背部均明显见到瘤体，直径约3mm大小，成瘤率100％。 造模成功后，随机分为4组，每组6只，尾静脉注射给药，每天一次，总共给药4 周，即：阴性对照组：尾静脉注射0.9％NaCl 0.1mL；RMP16组：尾静脉注射40μM  RMP160.1mL。

用药4周后，处死，剖出肿瘤块，称量瘤重，计算抑瘤率(inhibition rate， IR)：抑瘤率(IR)＝(1－治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

实验结果如图5所示，RMP16组对移植瘤的平均抑瘤率为76.11％(瘤重与 0.9％NaCl组比较，P<0.01)，表明RMP16对人前列腺癌Du145裸鼠移植瘤具有 生长抑制作用。

实施例5

重组多肽RMP16对治疗裸鼠的肝脏、肾脏的毒副作用检测

Du145移植瘤裸鼠分别经重组多肽RMP16、0.9％NaCl、Estramustine(雌莫 司汀，临床用于治疗前列腺癌的药物，Phamacia公司)治疗4周后的裸鼠，处死 后迅速摘取肝脏和肾脏，以正常裸鼠作为空白对照。摘取的肝脏和肾脏用10％中 性Formalin(福尔马林)固定，经乙醇脱水和石蜡包埋后，进行HE染色，染色 步骤如下：

①烘片：60℃烘烤30min；

②脱蜡：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇 Ⅱ5min→95％乙醇Ⅰ5min→95％乙醇Ⅱ5min→80％乙醇5min→自来水洗1min；

③染色：苏木素染10min→自来水洗1min→1％盐酸酒精20s→自来水洗 1min→伊红染10min→自来水洗1min；

④透明：80％乙醇2min→95％乙醇Ⅱ2min→95％乙醇Ⅰ2min→无水乙醇 Ⅱ2min→无水乙醇Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ5min→二甲苯Ⅰ10min；

⑤固封：中性树胶封片，37℃烘烤48h。

实验结果如图6A所示，正常肝细胞以中央静脉为中心，单行排列成板状结 构，肝细胞体积大、胞质丰富，肝细胞条索之间为肝血窦。RMP16组与正常组 比较，未出现坏死、炎症等异常。而阳性对照Estramustine(雌莫司汀，临床用 于治疗前列腺癌的药物，Phamacia公司)组，门管区有较多的炎细胞浸润。

实验结果如图6B所示，正常肾皮质主要包括肾小球及其周围肾小管，肾小 球主要由毛细血管组成，球囊腔清晰可见。与正常组相比，RMP16组肾组织未 出现炎症、坏死等现象；而阳性对照Estramustine组，肾小管腔内管型均质红染， 出现透明管型，可能有一定肾毒。

实验结果表明，重组多肽RMP16的毒副作用明显小于临床用药Estramustine。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。