VEGF/DLL4结合剂及其应用

摘要

本发明涉及VEGF结合剂、DLL4结合剂、VEGF/DLL4双特异性结合剂以及利用所述结合剂治疗如癌症等疾病的方法。本发明提供了特异性结合人VEGF的抗体、特异性结合人DLL4的抗体以及特异性结合人VEGF和/或人DLL4的双特异性抗体。本发明还提供了利用所述试剂抑制肿瘤生长的方法。此外，还描述了癌症治疗方法，该方法包括对患有肿瘤或癌症的患者施用治疗有效量的本发明的试剂或抗体。

说明书

技术领域

本发明一般性涉及结合VEGF、DLL4或VEGF和DLL4两者的抗体和其它试剂， 特别是抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体，以及利用所述抗体或其它试剂来治疗如癌症 等疾病的方法。

背景技术

血管发生在包括实体瘤和肿瘤转移的许多病症的发病机理中起着重要作用。新的 血管的产生对于为肿瘤的生长和扩散提供氧和养分至关重要，因而血管发生是癌治疗 的好靶标。

血管发生涉及充当血管发生活化剂的蛋白家族，包括血管内皮生长因子 (VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-E以及它们各自的受体(VEGFR-1、 VEGFR-2和VEGFR-3)。VEGF-A也称为VEGF或血管通透因子(VPF)，其以由单个 VEGF基因的替代选择性mRNA剪接而产生的数种亚型存在，以VEGF₁₆₅是最为生 物相关的亚型。

抗VEGF抗体在体外和体内已显示出对肿瘤细胞生长的抑制。已开发出人抗 VEGF单克隆抗体贝伐单抗(AVASTIN)，且其已在美国批准作为癌治疗剂。

Notch信号传导途径是普遍保守的信号转导体系。其涉及包括胚胎模式形成和胚 胎后组织维持在内的发育期间的细胞命运的决定。另外，Notch信号传导已被鉴定为 造血干细胞的维持中的关键因素。

Notch途径已与血液和实体肿瘤及癌联系起来。许多与肿瘤发生相关的细胞功能 和微环境线索据显示会受Notch途径信号传导的调节，包括细胞增殖、凋亡、粘附和 血管发生(Leong等，2006,Blood,107:2223-2233)。另外，Notch受体和/或Notch配体 据显示在许多人类癌中起着潜在致癌性作用，所述癌包括急性髓系白血病、B细胞慢 性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、 脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌(Leong等，2006, Blood,107:2223-2233)。

δ样4配体(DLL4)是Notch途径的重要成分，且已被鉴定为癌治疗的靶标。DLL4 是Notch配体，其特征是N端结构域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)结构域和胞外结构域 内的串联EGF样重复片段。据报道，DLL4受VEGF诱导并且DLL4可以充当血管 增生的负反馈调节剂。

抗DLL4抗体据显示会增强血管新生萌发和支化，这会导致非生产性血管发生并 减少肿瘤生长(Noguera-Troise等，2006,Nature,444:1032-1037)。另外，抗DLL4抗体 21M18据显示会抑制肿瘤生长并降低异种移植肿瘤模型中的癌干细胞频率(Hoey等， 2009,Cell Stem Cell,5:168-177；美国专利7,750,124号)。

虽然在用于癌治疗的单克隆抗体的开发方面已经取得显著进展，然而对于进一步 的改进仍然有巨大的潜力。一类具有提高的效能和/或降低的副作用(例如，毒性)的前 景的抗体分子是双特异性抗体。

早期双特异性抗体主要利用两种抗体的化学交联产生，或为杂合杂交瘤或“四源 杂交瘤(quadroma)”。四源杂交瘤的一个成功形式是Triomabs，其为小鼠/大鼠组合， 展示出优先物种特异性重链/轻链配对。更近期以来，抗体工程化的发展已提供了多 种多样的新抗体形式，包括但不限于串联scFv(bi-scFv)、双功能抗体、串联双功能抗 体(四功能抗体)、单链双功能抗体和双可变区抗体。

本发明的目标之一在于提供用于癌治疗的改进分子，特别是特异性结合人VEGF 和人DLL4的双特异性抗体。

发明内容

本发明提供了结合VEGF和/或DLL4的如抗体等结合剂(VEGF/DLL4结合剂)， 以及包含所述结合剂的组合物，如药物组合物。还提供了结合VEGF或DLL4以及至 少一种另外的抗原或靶标的结合剂以及此类结合剂的药物组合物。在某些实施方式 中，结合剂是新型多肽，例如抗体、抗体片段和与此类抗体相关的其它多肽。在某些 实施方式中，结合剂是特异性结合人VEGF的抗体。在一些实施方式中，结合剂是特 异性结合人DLL4的抗体。在一些实施方式中，结合剂是特异性结合人VEGF和人 DLL4的双特异性抗体。本发明还提供了通过对具有肿瘤的受试对象施用所述结合剂 来抑制肿瘤生长的方法。本发明还提供了通过对有需要的受试对象施用所述结合剂来 治疗癌的方法。在一些实施方式中，治疗癌或抑制肿瘤生长的方法包括用所述结合剂 靶向癌干细胞。在某些实施方式中，所述方法包括减少肿瘤中癌干细胞的频率、减少 肿瘤中癌干细胞的数目、降低肿瘤的致瘤性和/或通过减少肿瘤中癌干细胞的数目或 频率来降低肿瘤的致瘤性。

在一方面，本发明提供了特异性结合人VEGF的结合剂，如抗体。在一些实施方 式中，所述结合剂抑制VEGF与至少一种VEGF受体的结合。在一些实施方式中， 所述结合剂抑制VEGF与VEGFR-1和/或VEGFR-2的结合。在一些实施方式中，所 述结合剂调节血管发生。在某些实施方式中，抗体或其它结合剂除人VEGF外还特异 性结合和/或抑制人DLL4。

在一些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17) 的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；以及包含RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：与SEQ ID NO:11具有至少80％ 序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的轻链可 变区。在某些实施方式中，结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性 的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在某 些实施方式中，结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的重链可变 区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式 中，结合剂是一种抗体，该抗体包含：SEQ ID NO:11的重链可变区；和/或SEQ ID  NO:12的轻链可变区。

在一些实施方式中，结合剂是抗体219R45、219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75或219R45-MB-21R83。

在另一方面，本发明提供了特异性结合人DLL4的结合剂，如抗体。在一些实施 方式中，所述结合剂抑制DLL4与至少一种Notch受体的结合。在一些实施方式中， 所述结合剂抑制DLL4与Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4的结合。在一些实施 方式中，所述结合剂抑制Notch信号传导。在一些实施方式中，所述结合剂促进非生 产性血管发生(unproductive angiogenesis)。在某些实施方式中，所述抗体或其它结合 剂除人DLL4外还特异性结合和/或抑制人VEGF。

在一些实施方式中，所述结合剂是结合人DLL4的抗体，该抗体包含：包含 TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1；包含 YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链CDR2，其中，X₁是丝氨酸或丙 氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、 精氨酸或天冬氨酸；和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及 包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在一 些实施方式中，所述抗体包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID  NO:79)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链CDR2 和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：与SEQ ID NO:10具有至少90％ 或至少95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％或至少 95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂是包含SEQ ID NO:10的 重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区的抗体。

在一些实施方式中，结合剂是抗体21R79或抗体219R45-MB-21R79。

在一些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:59)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及 包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：与SEQ ID NO:58具有至少90％ 或至少95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％或至少 95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂是包含SEQ ID NO:58的 重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区的抗体。

在某些实施方式中，结合剂是抗体21R75或抗体219R45-MB-21R75。

在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及 包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：与SEQ ID NO:64具有至少90％ 或至少95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％或至少 95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂是包含SEQ ID NO:64的 重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区的抗体。

在一些实施方式中，结合剂是抗体21R83或抗体219R45-MB-21R83。

在前述各方面或实施方式、以及本文其它部分所述的其它方面和/或实施方式的 某些实施方式中，结合剂是双特异性抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体特异性 结合人VEGF和第二靶标。在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人DLL4 和第二靶标。在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人VEGF和人DLL4两者。 在一些实施方式中，双特异性抗体调节血管发生。在某些实施方式中，双特异性抗体 抑制Notch信号传导。在一些实施方式中，双特异性抗体调节血管发生并且抑制Notch 信号传导。在一些实施方式中，双特异性抗体减少癌干细胞的频率数。在某些实施方 式中，双特异性抗体包含两个相同的轻链。在某些实施方式中，双特异性抗体是IgG 抗体(例如，IgG2)。

在一些实施方式中，双特异性抗体包含：特异性结合人VEGF的第一抗原结合位 点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、 包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗 体还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：特异性结合人VEGF的第一抗原结 合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链 CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3，以及(b)包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，双特异性抗体包含：特异性结合人DLL4的第一抗原结合位 点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ  ID NO:79)的重链CDR1，包含YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链 CDR2，其中X₁是丝氨酸或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰 胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、精氨酸或天冬氨酸以及包含RDYDYDVGMDY(SEQ  ID NO:16)的重链CDR3；以及包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链 CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ  ID NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：特异性结合人DLL4 的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID  NO:13)的重链CDR1，包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、 YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2，和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体 还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：特异性结合人DLL4的第一抗原结 合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链 CDR1，包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)或 YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2，和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20) 的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在一些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF的第一抗原结合 位点和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包 含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ  ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其 中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID  NO:79)的重链CDR1，包含YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链 CDR2，其中X₁是丝氨酸或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰 胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、精氨酸或天冬氨酸和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID  NO:16)的重链CDR3；以及包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、 包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF 的第一抗原结合位点和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗 原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含 DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ  ID NO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链 CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第 二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、 包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF 的第一抗原结合位点和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗 原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含 DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ  ID NO:13)的重链CDR1、包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)的重链 CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第 二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、 包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF 的第一抗原结合位点和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗 原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含 DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ  ID NO:13)的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)的重链 CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第 二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、 包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF 的第一抗原结合位点和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗 原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含 DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ  ID NO:13)的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链 CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第 二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、 包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3。

在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人VEGF并且包含：与SEQ ID  NO:11具有至少90％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％ 序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人VEGF 并且包含：与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID  NO:12具有至少95％序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人DLL4并且包含：与SEQ ID  NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少90％序列同一性的 重链可变区和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实 施方式中，双特异性抗体特异性结合人DLL4并且包含：与SEQ ID NO:9、SEQ ID  NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少95％序列同一性的重链可变区和/ 或与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人VEGF和人DLL4，并且包含： (a)与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的第一重链可变区；(b)与SEQ ID  NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少90％序列同一性的 第二重链可变区；和(c)与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的第一轻链可变区 和第二轻链可变区。在一些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：(a)与SEQ  ID NO:11具有至少95％序列同一性的第一重链可变区；(b)与SEQ ID NO:9具有至少 95％序列同一性的第二重链可变区；和(c)与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性 的第一轻链可变区和第二轻链可变区。在一些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗 体包含：(a)与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的第一重链可变区；(b)与SEQ  ID NO:10具有至少95％序列同一性的第二重链可变区；和(c)与SEQ ID NO:12具有 至少95％序列同一性的第一轻链可变区和第二轻链可变区。在一些实施方式中， VEGF/DLL4双特异性抗体包含：(a)与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的第 一重链可变区；(b)与SEQ ID NO:58具有至少95％序列同一性的第二重链可变区；和 (c)与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的第一轻链可变区和第二轻链可变区。 在一些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：(a)与SEQ ID NO:11具有至少 95％序列同一性的第一重链可变区；(b)与SEQ ID NO:64具有至少95％序列同一性的 第二重链可变区；和(c)与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的第一轻链可变区 和第二轻链可变区。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该抗体包含(a)第一抗 原结合位点和(b)第二抗原结合位点，所述第一抗原结合位点以约0.1nM至约1.0nM 的K_D与人VEGF特异性结合，且所述第二抗原结合位点以约0.1nM至约20nM的 K_D与人DLL4结合。在某些实施方式中，所述双特异性抗体包含两条相同的轻链。

在一些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是选自由219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75和219R45-MB-21R83组成的组的双特异性抗 体。

在各个前述方面以及本文其它部分所述的其它方面和/或实施方式中，结合剂或 抗体是分离的。

在另一方面，本发明提供了选自由以下序列组成的组的多肽：SEQ ID NO:1、SEQ  ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID  NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID  NO:12、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID  NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID  NO:64。在一些实施方式中，所述多肽是分离的。在某些实施方式中，所述多肽是基 本纯的。在某些实施方式中，所述多肽是抗体或抗体的一部分，例如抗体片段。

在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码各个前述方面以及 本文其它部分所述的其它方面和/或实施方式所述的结合剂和/或多肽的多核苷酸。在 一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自由以下序列组成的组的序列：SEQ ID  NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ  ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID  NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ  ID NO:73和SEQ ID NO:74。本发明还提供了包含所述多核苷酸的表达载体，以及包 含所述表达载体和/或所述多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原核细 胞或真核细胞。

在其它方面，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法，其包括使肿瘤与有效量的结合 VEGF和/或DLL4的抗体(或其它结合剂)接触，所述抗体(或其它结合剂)包括本文所 述的各种抗体(或其它结合剂)。

在另一方面，本发明提供了抑制受试对象中的肿瘤生长的方法，其包括施用治疗 有效量的结合VEGF和/或DLL4的抗体(或其它结合剂)，所述抗体(或其它结合剂)包 括本文所述的各种抗体(或其它结合剂)。

在另一方面，本发明提供了调节受试对象中的血管发生的方法，其包括对受试对 象施用治疗有效量的结合VEGF和/或DLL4的抗体(或其它结合剂)，所述抗体(或其 它结合剂)包括本文所述的各种抗体(或其它结合剂)。

在另一方面，本发明提供了降低受试对象中的肿瘤的致瘤性的方法，其包括对受 试对象施用治疗有效量的结合VEGF和/或DLL4的抗体(或其它结合剂)，所述抗体(或 其它结合剂)包括本文所述的各种抗体(或其它结合剂)。

在另一方面，本发明提供了通过减小肿瘤中癌干细胞的频率来降低受试对象中的 肿瘤的致瘤性的方法，其包括对受试对象施用治疗有效量的结合VEGF和/或DLL4 的抗体(或其它结合剂)，所述抗体(或其它结合剂)包括本文所述的各种抗体(或其它结 合剂)。

在其它方面，本发明提供了治疗受试对象中的癌的方法，其包括对受试对象施用 治疗有效量的结合VEGF和/或DLL4的抗体(或其它结合剂)，所述抗体(或其它结合 剂)包括本文所述的各种抗体(或其它结合剂)。

此外，还提供了包含本文所述的结合剂(例如，抗体)和药物可接受载剂的药物组 合物，如表达和/或生产所述结合剂的细胞系。还提供了治疗受试对象(例如人)中的癌 和/或抑制肿瘤生长的方法，其包括对受试对象施用有效量的包含所述结合剂的组合 物。

虽然本发明的各方面或实施方式以马库什组或其它替代方案分组的方式进行了 描述，但本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，也单独涵盖了组的各个成员以及主 组的所有可能的子组，以及缺失一个或多个组成员的主组。本发明还考虑到在所要求 保护的发明中特别排除任何组成员的一个或多个的情形。

附图说明

图1.1A)抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21M79、219R45-MB-21M75和219R45-MB-21M83的重链和轻链CDR； 1B)重链和轻链可变区SEQ ID NO；1C)重链和轻链SEQ ID NO。

图2.双特异性抗体与人VEGF和人DLL4的同时结合的HTRF检测。结果以相 对荧光单位(RFU)报告，其表示665nm处的相对荧光强度与620nm处的相对荧光强 度之比。219R45-MB-21M18(-●-)；219R45-MB-21R79(-■-)；219R45加21M18(-▲-)； 219R45加21R79(-□-)；219R45(-▼-)；21M18(-◇-)；21R79(-○-)；对照抗体LZ-1(-Δ-)。

图3.抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对由VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制。 使用530nm的激发波长和590的发射波长读取荧光强度。219R45-MB-21M18(-●-)； 219R45-MB-21R79(-▲-)；219R45(-■-)；不带VEGF的培养基(-◇-)。

图4.抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对由DLL4诱导的Notch信号传导的抑制。 利用双重荧光素酶检测试剂盒(萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性进行标 准化)来测定荧光素酶活性。219R45-MB-21M18(-●-)；219R45-MB-21R79(-■-)；21M18 (-○-)；21R79(-□-)。

图5.抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对体内结肠肿瘤生长的抑制。将OMP-C8 结肠瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠中的人皮肤移植物内。将小鼠用对照抗体 (-■-)、抗hDLL4抗体21M18(-▲-)、抗VEGF抗体贝伐单抗(-○-)或抗VEGF/抗DLL4 双特异性抗体219R45-MB-21M18(-▼-)进行处理。数据以随处理后天数变化的肿瘤体 积(光子/秒)显示。抗体以25mg/kg的剂量每周1次经腹膜内施用。

图6.用抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体处理后的胰腺肿瘤细胞的致瘤性。将来 自小鼠的OMP-PN8肿瘤细胞用对照抗体、抗hDLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝 伐单抗或抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18或219R45-MB-21R79 在采用或不采用吉西他滨的情况下进行处理，将所述细胞加工为单细胞悬浮液，并连 续移植至NOD/SCID小鼠中。使肿瘤在没有处理的情况下进行生长。数据显示为第 55天时的肿瘤体积(mm³)。肿瘤频率以肿瘤数目与每组中受注射小鼠的总数之比显 示。

图7.双特异性抗体ELISA。将双特异性抗体219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75和219R45-MB-21R83在含2μg/ml生物素 -DLL4-hFc的封闭缓冲液(1×PBS、0.1％明胶、0.1％聚山梨酯-20,pH7.4)中稀释。将抗 体从500ng/ml至0.008ng/ml连续稀释3倍。将抗体样品在含生物素-DLL4-hFc的封 闭缓冲液中温育2小时。温育后，将抗体样品转移至VEGF涂布的检测板(100μl/孔) 并温育2小时。向各板孔添加链霉抗生物素蛋白-HRP并温育1小时。向板孔添加TMB 底物，并进行10分钟显色，用2M硫酸中止反应。在450nm至650nm读取吸光度， 并采用Softmax Pro分析程序内的4-参数拟合来分析数据。

图8.抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的成像毛细管等电聚焦。

图9.肿瘤复发模型中抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对结肠肿瘤生长的抑制。 将OMP-C8结肠肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠。将小鼠用对照抗体(-■-)、抗 hDLL4抗体21M18(-●-)、抗VEGF抗体贝伐单抗(-▲-)、21M18与贝伐单抗的组合 (-▼-)、抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18(-◇-)或抗VEGF/抗DLL4 双特异性抗体219R45-MB-21R79(-○-)进行处理(所有抗体均与伊立替康组合)。抗体 21M18和贝伐单抗每周1次以7.5mg/kg的剂量于腹膜内施用，双特异性抗体 219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79每周1次以15mg/kg的剂量于腹膜内施用， 而伊立替康在前4周以45mg/kg施用。数据显示为随处理后天数变化的肿瘤体积 (mm³)。

图10.用抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体处理后的OMP-C3结肠肿瘤细胞的致 瘤性。将来自小鼠的肿瘤用对照抗体、抗hDLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝伐单 抗、21M18与贝伐单抗的组合、或者抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 219R45-MB-21M18或219R45-MB-21R79在采用或不采用伊立替康的情况下处理，经 处理的肿瘤加工为单细胞悬浮液，并连续移植到小鼠中。将来自各处理组的150个细 胞皮下注射至NOD/SCID小鼠。使肿瘤在没有处理的情况下进行生长。数据显示为 第68天时的肿瘤体积(mm³)。

图11.抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对体内结肠肿瘤生长的抑制。将OMP-C8 结肠肿瘤细胞皮下注射至NOD/SCID小鼠。用对照抗体(-■-)、抗VEGF抗体贝伐单 抗(-▲-)或者抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18(-◇-)、 219R45-MB-21R75(-●-)、219R45-MB-21R79(-○-)或219R45-MB-21R83(-▼-)处理小 鼠。小鼠以作为单一试剂的抗体处理(图10A)，或以抗体与伊立替康的组合处理(图 10B)。抗体每周1次以15mg/kg的剂量于腹膜内施用，伊立替康每周1次以7.5mg/kg 的剂量施用。数据显示为随处理后天数变化的肿瘤体积(mm³)。

具体实施方式

本发明提供了结合VEGF和/或DLL4的包括但不限于多肽(如抗体)的新型结合 剂，例如，VEGF/DLL4结合剂。也提供了相关多肽和多核苷酸、包含所述VEGF/DLL4 结合剂的组合物以及制备所述VEGF/DLL4结合剂的方法。此外，还提供了利用所述 新型VEGF/DLL4结合剂的方法，如抑制肿瘤生长的方法、治疗癌的方法、降低肿瘤 的致瘤性的方法、减小肿瘤中的癌干细胞的频率的方法和/或调节血管发生的方法。

已鉴定出特异性结合人VEGF的单克隆抗体219R45。该抗体具有约0.67nM的 对人VEGF的结合亲和力，和约23nM的对小鼠VEGF的结合亲和力。已鉴定出数种 特异性结合人DLL4的单克隆抗体21R79、21R75和21R83。抗体21R79具有小于 0.1nM的对人DLL4的结合亲和力。已制备出特异性结合人VEGF和人DLL4的双特 异性抗体219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75和 219R45-MB-21R83(图1中的CDR序列)。如本文所用，抗体名称内的“MB”是指“单 价/双特异性”。双特异性抗体219R45-MB-21M18具有小于1.0nM的对人VEGF的结 合亲和力，和约16nM的对人DLL4的结合亲和力。双特异性抗体219R45-MB-21R79 具有小于1.0nM的对人VEGF的结合亲和力，和小于1.0nM的对人DLL4的结合亲 和力。双特异性抗体219R45-MB-21R75具有约5nM的对人DLL4的结合亲和力，而 双特异性抗体219R45-MB-21R83具有约1nM的对人DLL4的结合亲和力。双特异性 抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79结合小鼠VEGF(实施例1，表3)。抗 VEGF/抗DLL4双特异性抗体同时结合人VEGF和人DLL4(实施例2，图2)。抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖(实施例3，图3)。抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体抑制DLL4诱导的Notch信号传导(实施例4，图4)。抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体抑制肿瘤生长(实施例5、9、11和图5、9、11)。抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体抑制致瘤性(实施例6和10和图6、10)。抗VEGF/抗DLL4双特 异性抗体在双特异性ELISA中结合VEGF与DLL4(实施例7，图7)。抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体被分离和纯化位包含至少90％异源二聚体抗体的产品(实施例8， 表7)。

I.定义

为有助于理解本发明，下面对许多术语和短语进行了定义。

如本文所用，术语“抗体”是指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗 原识别位点，识别和特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或上述 物质的组合等靶标的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语包括完整的多克隆抗体、 完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链 Fv(scFv)抗体、诸如双特异性抗体等多特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合 抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白以及任何其它包含 抗原识别位点(即抗原结合位点)的经修饰免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示所需的 生物活性即可。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的抗体重链恒定域的同一性，抗体可 以是五个主要种类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同 型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同种类的免疫球蛋白具有不 同的众所周知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸露的或与诸如毒素、放射性同位 素等其它分子缀合。

如本文所用，术语“抗体片段”表示完整抗体的一部分，和表示完整抗体的抗原性 决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、 单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用的“抗体片段”包括抗原结合位 点或表位结合位点。

术语抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变 区。重链和轻链的可变区各由通过三个还称为“高变区”的互补决定区(CDR)连接的四 个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过框架区紧邻地保持在一起，并且与来自另一 链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点。至少存在两种用于确定CDR的技术： (1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等，1991，Sequences of Proteins of  Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD)；和(2) 基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，1997，J.Molec.Biol.273： 927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。

本文所用的“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别和结合单抗原决定簇或表位 的同源性抗体群。这与通常包括针对多种不同抗原决定簇的不同抗体的混合物的多克 隆抗体相对。术语“单克隆抗体”包括完整的全长单克隆抗体以及抗体片段(例如，Fab、 Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和任何其它包含抗 原识别位点(抗原结合位点)的经修饰免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指以包 括但不限于通过杂交瘤制备、噬菌体选择、重组表达和转基因动物在内的任何数量的 技术制得的此类抗体。

如本文所用的术语“人源化抗体”是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有最 小非人类序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常而言，人源化 抗体是其中CDR的残基被非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的具有所需特异 性、亲和性和/或结合能力的CDR的残基置换的人类免疫球蛋白(Jones等，1986,Nature, 321:522-525；Riechmann等，1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等，1988,Science, 239:1534-1536)。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人类物种 的具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的抗体中的相应残基置换。可以通过在Fv 框架区中和/或在经置换的非人类残基内取代另外的残基而进一步修饰所述人源化抗 体，从而改进和优化抗体特异性、亲和性和/或结合能力。通常，人源化抗体会包含 基本上不少于(all of)至少一个、通常两个或三个可变域，所述可变域含有所有、或基 本上所有的与非人类免疫球蛋白对应的CDR，而所有、或基本上所有的框架区是人 类免疫球蛋白共有序列的框架区。所述人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人 类免疫球蛋白)恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例 描述于例如美国专利第5,225,539号。

本文使用的术语“人抗体”是指由人类产生的抗体或具有与由人类产生的抗体相 应的氨基酸序列的抗体。人抗体可以使用本领域已知的任何技术制备。人抗体的该定 义特别排除了包含非人类CDR的人源化抗体。

本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个以 上物种的抗体。通常而言，轻链和重链的可变区对应于源自一个哺乳动物物种(例如， 小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的抗体的可变区，而恒 定区对应于源自另一物种(通常是人类)的抗体中的序列。

本文所用的短语“亲和力成熟的抗体”是指在其一个或多个CDR中具有一个或多 个变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有这些变化的亲本抗体相比对于抗原的 亲和力得到提高。该定义也包括与对CDR残基的变化结合的非CDR残基的变化。优 选的亲和力成熟的抗体会具有纳摩尔甚至皮摩尔级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟 的抗体通过本领域已知的程序来制备。例如，Marks等，1992,Bio/Technology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域混编的亲和力突变。Barbas等，1994,PNAS, 91:3809-3813；Schier等，1995,Gene,169:147-155；Yelton等，1995,J.Immunol. 155:1994-2004；Jackson等，1995,J.Immunol.,154:3310-9；和Hawkins等，1992,J. Mol.Biol.,226:889-896中描述了CDR和/或框架区残基的随机诱变。定点诱变也可用 于获得亲和力成熟的抗体。

术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可相互替换地使用，并且是指抗原的能够被 特定抗体识别和特异性结合的那部分。当抗原是多肽时，表位可由连续的氨基酸形成 和由通过蛋白的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成。当蛋白变性时通常会保留由连 续的氨基酸形成的表位(也称为线性表位)，而当蛋白变性时通常会失去通过三级折叠 形成的表位(也称为构象性表位)。在单独空间构象中表位通常包括至少3个，或更经 常至少5个或8个至10个氨基酸。

术语“异源多聚体分子”或“异源多聚体(heteromultimer)”或“异源多聚体复合物”或 “异源多聚体多肽”在本文被可相互替换地用来指代包含至少第一多肽和第二多肽的 分子，其中所述第二多肽在氨基酸序列上与所述第一多肽具有至少一个氨基酸残基的 差异。异源多聚体分子可以包括由第一和第二多肽形成的“异源多聚体”，或能在存在 额外的多肽时形成更高级的三级结构。

本文所用的术语“拮抗剂”和“拮抗性”是指部分或全部阻断、抑制、降低或中和靶 标的生物学活性和/或信号传导途径(例如，Notch途径)的任何分子。术语“拮抗剂”在 本文被用于包括部分或全部阻断、抑制、降低或中和蛋白活性的任何分子。合适的拮 抗剂分子特别包括但不限于拮抗性抗体或抗体片段。

本文所用的术语“调节(modulation/modulate)”是指生物活性的变化或改变。调 节包括但不限于对活性的刺激或抑制。调节可以是活性的增加或减少(例如，血管发 生的减少或血管发生的增加)、结合特性的变化或与蛋白、途径或其它受关注的生物 学点的活性相关的生物学、功能性或免疫学性质的任何变化。

术语“选择性结合”或“特异性结合”是指结合剂或抗体与表位、蛋白或靶分子的反 应或结合比与其它物质(包括不相关蛋白)的反应或结合更频繁、更迅速、持久性更高、 亲和性更高或上述情况的某些组合。在某些实施方式中，“特异性结合”例如是指，抗 体与蛋白结合的K_D为约0.1mM以下，但更通常为小于约1μM。在某些实施方式中， “特异性结合”是指，抗体与靶标结合的K_D有时为至少约0.1μM以下，其它情况下为 至少约0.01μM以下，且在其它情况下为至少约1nM以下。由于不同物种中同源性 蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别超过一个物种中的蛋白(例如，人 VEGF和小鼠VEGF)的抗体。类似地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内的同源 性，特异性结合可以包括识别多于一种蛋白(例如，人VEGF-A和人VEGF-B)的抗体 (或其它多肽或结合剂)。应该理解，在某些实施方式中，与第一靶标特异性结合的抗 体或结合部分可以与第二靶标特异性结合或不与第二靶标特异性结合。这样，“特异 性结合”不必然地要求(尽管其可以包括)专一性结合，即，与单个靶标的结合。因此， 在某些实施方式中，抗体可能特异性结合多于一个靶标。在某些实施方式中，多个靶 标可以被抗体上的相同抗原结合位点结合。例如，在某些情形中，抗体可以包含两个 相同的抗原结合位点，所述抗原结合位点各自特异性结合两个以上的蛋白上的相同表 位。在某些替代性实施方式中，抗体可以是多特异性抗体，且包含具有不同特异性的 至少两个抗原结合位点。以非限制性实例为例，双特异性抗体可以包含识别一个蛋白 (例如，人VEGF)上的表位的一个抗原结合位点，并且还包含识别第二蛋白(例如，人 DLL4)上的不同表位的第二个不同的抗原结合位点。通常而言，但不是必然地，提及 结合是指特异性结合。

术语“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可相互替换地使用，并且是指氨基酸残基的 聚合物。聚合物可以是线性或支化的，其可以包括修饰的氨基酸，并且其可以为非氨 基酸所中断。该属于还包括已经被天然修饰或经人工干预修饰的氨基酸聚合物；例如， 二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰(例如，以标记 性组分缀合)。所述定义还包括例如，含有一种以上的氨基酸类似物(包括例如，非天 然氨基酸)以及本领域内已知的其它修饰的多肽。应该理解，由于本发明的多肽可以 基于抗体，在某些实施方式中，所述多肽可以以单条链或相连链出现。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可相互替换地使用，并且是指任何长度的核苷 酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰 的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者能被DNA或RNA聚合酶引入聚合物内的 任何底物。

“高度严谨条件”可以由以下来确定：(1)采用低离子强度和高温用于洗涤，例 如在50℃时，15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间 采用如甲酰胺等变性剂，例如，在42℃，50％(v/v)甲酰胺，以及与0.1％牛血清白蛋 白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，在pH6.5的5×SSC(0.75M  NaCl,75mM柠檬酸钠)；或(3)在杂交期间在42℃采用在5×SSC中的50％甲酰胺、 50mM柠檬酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、经超声的鲑鱼精DNA (50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并在42℃在0.2×SSC和50％甲酰胺中进行 洗涤，随后进行在55℃在由含EDTA的0.1×SSC构成的高度严谨洗涤。

在两个以上的核酸或多肽的背景下，术语“同一性”或百分比“同一性”是指两 个以上的相同或具有指定的核苷酸或氨基酸百分比的序列或子序列，其中当在不考虑 任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分的情况下，当出于最大对应性进行比较 和比对(必要时引入空位)时所述序列或子序列相同。百分比同一性可以利用序列比较 软件或算法或者通过可视化检查进行测定。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对结 果的各种算法和软件是本领域公知的。这包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、 BestFit、GCG Wisconsin程序包以及它们的各种变化形式。在某些实施方式中，本发 明的两个核酸或多肽是基本同一性的，这是指在当针对最大对应性进行比较和比对 时，所述核酸或多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％的 核苷酸或氨基酸残基同一性(利用序列比较算法或可视化检查测定)，且在某些实施方 式中，具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在某 些实施方式中，同一性存在于长度为至少约10个、至少约20个、至少约40至60个 残基、至少约60至80个残基或者上述数值之间的任何整数值的序列的区域。在某些 实施方式中，同一性存在于大于60至80个残基的更长的区域，例如，至少约80至 100个残基，且在某些实施方式中，序列在进行比较的序列(例如，核苷酸序列的编码 区)的全长中是基本同一性的。

“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残 基所替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域进行了定义， 包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、 不带电荷的剂型侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳 香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，以酪氨酸取代苯丙氨酸 是保守性取代。优选地，本发明的多肽和抗体的序列中的保守性取代不会破坏含有该 氨基酸序列的多肽或抗体与该多肽或抗体所结合的抗原的结合。对不会消除抗原结合 的核苷酸和氨基酸保守性取代的鉴定方法是本领域所公知的。

本文所用的术语“载体”是指能够在宿主细胞中输送、且通常能表达一种或多种 所关注基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或RNA 表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂连接的DNA或RNA表达载 体以及包封在脂质体内的DNA或RNA表达载体。

“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于非天然存在的形 式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、 载体、细胞或组合物包括已被纯化至不再处于其天然存在的形式的程度的那些。在某 些实施方式中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本纯的。

本文所用术语“基本纯”是指至少50％纯(即，不含杂质)、至少90％纯、至少95％ 纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。

本文所用的术语“癌(cancer)”或“癌性的(cancerous)”是指或描述其中一群细胞的 特征在于失调的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌的实例包括，但不限于，癌 (carcinoma)、母细胞瘤、肉瘤和血液癌(如淋巴瘤和白血病)。

本文所用的术语“肿瘤”和“赘生物”是指任何由过度的细胞生长或增殖导致的组 织的团块，其可以是良性的(非癌性的)或恶性的(癌性的)，包括癌前病变。

本文所用的术语“转移”是指癌从原始位点扩散或转移到身体的其它区域的过程， 并且伴随着位于新位置处的类似的癌病变的发生。“转移”或“转移性”细胞是失去与相 邻细胞的粘附接触并且经由血流或淋巴从疾病的原发位点迁移从而侵袭邻近的身体 结构的细胞。

术语“癌干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”和“肿瘤起始细胞”在本文中可相互替 换地使用，并且指具有以下性质的来自癌或肿瘤的细胞：(1)具有广泛的增殖能力； 2)能够进行不对称细胞分裂从而产生增殖或发育潜能减少的一种以上分化细胞子代； 和(3)能够进行对称分裂以用于自我更新或自我维持。当连续移植到免疫妥协宿主(例 如，小鼠)时，与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，这些性质赋予癌干细胞以形 成或建立肿瘤或癌的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新而不是分化，从而形成 具有异常细胞类型的肿瘤，当发生突变时所述异常细胞类型可以随时间而改变。

术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指源自癌或肿瘤或癌前病变的全部细胞群体，包括 占癌细胞群大部分的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞(癌干细胞)。如本文所用，当用术 语“癌细胞”或“肿瘤细胞”仅指代缺乏更新和分化能力的那些细胞时，将其用术语“非 致瘤性”进行修饰，以便将那些肿瘤细胞与癌干细胞相区分。

本文所用的术语“致瘤性的”是指癌干细胞的功能特征，包括自我更新(产生另外 的致瘤性癌干细胞)的性质和增殖以产生所有其它肿瘤细胞(产生分化的因而非致瘤 性的肿瘤细胞)的性质。

本文所用的术语“致瘤性”是指当连续移植到免疫妥协宿主(例如，小鼠)时，来自 肿瘤的细胞的随机样品形成可察觉的肿瘤的能力。该定义还包括在连续移植到免疫妥 协宿主(例如，小鼠)时形成可察觉的肿瘤的富集的癌干细胞和/或其分离群体。

如本文所用，术语“受试对象”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、 非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物和啮齿类动物等，其是特定治疗的接收者。通 常而言，提及人类受试对象时，术语“受试对象”和“患者”在本文中可相互替换地使用。

术语“药物可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构已批准的(或可批准的) 或在美国药典或其它公知的药典中列出的用于包括人类在内的动物的产品或化合物。

术语“药物可接受的赋性剂、载剂或佐剂”或“可接受的药物载剂”是指可以与本文 公开的至少一种结合剂(例如，抗体)一起对受试对象施用的赋性剂、载剂或佐剂，并 且其不破坏所述结合剂的药理学活性。当以足以实现治疗效果的剂量施用所述结合剂 时，所述赋性剂、载剂或佐剂应该是无毒的。

术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试对象或哺乳动物 中的疾病或病症有效的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其它药物的量。 在癌的情况下，治疗有效量的药物(例如，抗体)具有治疗效果并因此可以减少癌细胞 的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌干细胞的数量或频率；减少肿瘤 尺寸；减少癌细胞群；抑制或停止癌细胞向周围器官中的浸润(例如包括癌向软组织 和骨中的扩散)；抑制和停止肿瘤或癌细胞转移；抑制和/或停止肿瘤或癌细胞生长； 某种程度上减轻与癌有关的一种或多种症状；减少发病率和死亡率；改进生活质量； 或所述效应的组合。在诸如抗体等试剂防止现有的癌细胞生长和/或将其杀死的情况 下，可将其称为具有细胞抑制性和/或细胞毒性。

术语“治疗”或“处理”或“要治疗”或“缓解”或“要缓解”是指：1)治愈、减慢、减轻 诊断的病理性状况或病症的症状的治疗措施，和/或使诊断的病理性状况或病症的进 展停止的治疗措施；和2)防止或减缓所靶向的病理性状况或病症的发展的预防性或 防备性措施。因此需要治疗的受试对象包括：已经患有疾病的受试对象；有倾向患疾 病的受试对象；和要预防疾病的受试对象。如果所述患者显示出以下情况的一种或多 种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受试对象：癌细胞的数量减少或完全不存在、 肿瘤尺寸的减少；对癌细胞向周围器官的浸润(包括癌向软组织和骨的扩散)的抑制或 不存在；肿瘤或癌细胞转移的抑制或不存在；癌生长的抑制或不存在；减轻一种或多 种与特定癌相关的症状；发病率和致死率降低；生活质量改进；致瘤性降低；癌干细 胞的数量或频率减少；或上述效应的某些组合。

如本公开和权利要求中所用，除非上下文明确相反地指出，单数形式“一个”、“这 个”和“那个”包括复数形式。

应该理解，当在本文中以语言“包含”来描述实施方式时，也另外提供了以“由… 组成”和/或“基本由…组成”的方式描述的其它类似实施方式。还应理解，只要在 本文中以语言“基本由…组成”描述了实施方式，则也就提供了以“由…组成”的方 式描述的其它类似实施方式。

用在如“A和/或B”等短语中的术语“和/或”在本文旨在包括：A和B两者； A或B；A(单独)；和B(单独)。类似地，用在如“A、B和/或C”等短语中的术语 “和/或”旨在涵盖以下实施方式的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B； B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

II.抗体

本发明提供了特异性结合人VEGF蛋白和/或人DLL4蛋白的试剂。这些试剂在 本文被称作“VEGF/DLL4结合剂”。短语“VEGF/DLL4结合剂”涵盖了仅与VEGF结合 的试剂、仅与DLL4结合的试剂以及既与VEGF结合又与DLL4结合的试剂。在某些 实施方式中，除了特异性结合VEGF和/或DLL4以外，所述VEGF/DLL4结合剂还 特异性结合至少一种额外的靶标或抗原。在某些实施方式中，所述VEGF/DLL4结合 剂是抗体。在某些实施方式中，所述VEGF/DLL4结合剂是多肽，在某些实施方式 中，所述VEGF/DLL4结合剂特异性结合人VEGF。在某些实施方式中，所述 VEGF/DLL4结合剂特异性结合人DLL4。在某些实施方式中，所述VEGF/DLL4结合 剂是双特异性抗体。在某些实施方式中，所述VEGF/DLL4结合剂是特异性结合人 VEGF和人DLL4的双特异性抗体。人VEGF(VEGF-A)和人DLL4的全长氨基酸(aa) 序列是本领域已知的，并且在本文中作为SEQ ID NO:27(VEGF)和SEQ ID NO:23 (DLL4)提供。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和/或DLL4结合的解离 常数(K_D)为约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM 以下、约1nM以下或约0.1nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体 与VEGF和/或DLL4结合的K_D为约20nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂与VEGF和/或DLL4结合的K_D为约10nM以下。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和/或DLL4结合的K_D为约1nM以下。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和/或DLL4结合的K_D为约0.1nM以 下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与人VEGF和小鼠VEGF结合的K_D为 约100nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与人VEGF和小鼠VEGF 结合的K_D为约50nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与人DLL4和小 鼠DLL4结合的K_D为约100nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与人 DLL4和小鼠DLL4结合的K_D为约50nM以下。在某些实施方式中，结合剂(例如， 抗体)与VEGF的解离常数是利用包含固定于Biacore芯片上的至少一部分VEGF的 VEGF融合蛋白确定的解离常数。在某些实施方式中，结合剂(例如，抗体)与DLL4 的解离常数是利用包含固定于Biacore芯片上的至少一部分DLL4的DLL4融合蛋白 确定的结合常数。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含特异性结合VEGF的第一抗原结 合位点和特异性结合DLL4的第二抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和DLL4结合的K_D为约100nM以下。在某 些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和DLL4结合的K_D为约50nM以 下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和DLL4结合的K_D为 约20nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF和DLL4结 合的K_D为约10nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体与VEGF 和DLL4结合的K_D为约1nM以下。在某些实施方式中，所述抗原结合位点之一的亲 和力可能比另一个抗原结合位点的亲和力更弱。例如，一个抗原结合位点的K_D可以 为约1nM，而第二抗原结合位点的K_D可以为约10nM。在某些实施方式中，所述两 个抗原结合位点的亲和力的差异可以为约2倍以上、约3倍以上、约5倍以上、约8 倍以上、约10倍以上、约15倍以上、约20倍以上、约30倍以上、约50倍以上或 约100倍以上。对两个抗原结合位点的亲和力的调节可能影响所述双特异性抗体的生 物活性。例如，降低抗原结合位点对于DLL4或VEGF的亲和力可能具有希望的效果， 例如，降低结合剂的毒性或提高治疗指数。

非限制性举例而言，双特异性抗体可以包含：(a)与人VEGF结合的K_D为约0.1nM 至约1.0nM第一抗原结合位点，和(b)与人DLL4特异性结合的K_D为约0.1nM至约 20nM、约0.5nM至约20nM、约1.0nM至约10nM第二抗原结合位点。在某些实施 方式中，双特异性抗体包含两个相同的轻链。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与VEGF和/或DLL4结合 的半最大有效浓度(EC₅₀)为约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM 以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂(例如，抗体)与VEGF和/或DLL4结合的半最大有效浓度(EC₅₀)(EC₅₀)为约1μM 以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下、约1nM以下 或约0.1nM以下。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗体。在某些实施方式中，抗体是重 组抗体。在某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗体是嵌合抗 体。在某些实施方式中，抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，抗体是人抗体。在 某些实施方式中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方式中，抗 体是IgG1抗体。在某些实施方式中，抗体是IgG2抗体。在某些实施方式中，抗体是 包含抗原结合位点的抗体片段。在某些实施方式中，抗体是双特异性抗体。在某些实 施方式中，抗体是单价、单特异性、双功能或双特异性的。在某些实施方式中，抗体 与细胞毒性部分缀合。在某些实施方式中，抗体是分离的。在某些实施方式中，抗体 是基本纯的。

可以通过本领域已知的任何方法对本发明的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的 特异性结合进行检测。可以采用的免疫检测包括但不限于采用以下技术的竞争性和非 竞争性检测系统：例如，Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白 质印迹分析、放射免疫检测、ELISA、“夹心”免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀反应、 凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检测、凝集检测、补体固定检测、免疫放射度检测、荧 光免疫检测、同源性时间分辨荧光检测(HTRF)和蛋白A免疫检测。这类检测在本领 域中是常规的并且是众所周知的(参见，例如Ausubel等编著，1994至今，Current  Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY)。

例如，与人VEGF和/或人DLL4特异性结合的抗体可以使用ELISA来确定。 ELISA检测可以包括：制备抗原、用抗原涂布96孔微滴定板的板孔、向板孔添加缀 合有可检测化合物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗体或其它结合剂、温育 一段时间和检测结合至所述抗原的结合剂的存在。在某些实施方式中，结合剂或抗体 不与可检测化合物缀合，而是向板孔添加识别所述结合剂或抗体的第二抗体(例如， 抗Fc抗体)缀合，所述第二抗体缀合有可检测化合物。在某些实施方式中，不是用抗 原涂布板孔，而是可以用结合剂或抗体涂布板孔，并在向经涂布的板孔添加抗原之后， 添加缀合有可检测化合物的第二抗体。本领域技术人员了解可以改变以增加所检测的 信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变化形式。

在另一实例中，可以利用FACS来确定抗体与人VEGF和/或人DLL4的特异性 结合。FACS筛选检测可以包括：产生表达作为融合蛋白的抗原的cDNA构建体、将 该构建体转染至细胞内、在细胞表面表达所述抗原、将结合剂或抗体与转染的细胞混 合，和温育一段时间。被结合剂或抗体结合的细胞可以通过使用缀合有可检测化合物 的第二抗体(例如，PE缀合的抗Fc抗体)和流式细胞仪来鉴定。本领域技术人员了解 可以改变以优化所检测的信号的参数以及可以增强筛选(例如，针对封闭性抗体的筛 选)的FACS的其它变化形式。

抗体或其它结合剂与抗原(例如，VEGF或DLL4)的结合亲和力以及抗体-抗原相 互作用的解离速率(off-rate)可以通过竞争性结合检测来确定。竞争性结合检测的一个 实例是放射免疫检测，其包括：将标记的抗原(例如，³H或¹²⁵I)或其片段或变体与所 关注抗体在递增量的未经标记的抗原的存在下温育，随后检测与标记的抗原结合的抗 体。抗体对抗原的亲和力和结合解离速率可以通过Scatchard图分析从数据确定。在 某些实施方式中，使用Biacore动力学分析来确定与抗原(例如，VEGF或DLL4)结合 的抗体或试剂的结合和解离速率。Biacore动力学分析包括对抗体与在其表面固定有 抗原(例如，VEGF或DLL4)的芯片的结合和从该芯片的解离进行分析。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人VEGF的VEGF结合剂(例如， 抗体)，其中所述VEGF结合剂(例如，抗体)包含抗体219R45的CDR中的1个、2 个、3个、4个、5个和/或6个(参见表1)。在某些实施方式中，VEGF结合剂包含1 个以上的219R45的CDR、2个以上的219R45的CDR、3个以上的219R45的CDR、 4个以上的219R45的CDR、5个以上的219R45的CDR或者219R45的所有6个CDR。 在某些实施方式中，VEGF结合剂结合人VEGF和小鼠VEGF。

表1

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人VEGF的VEGF结合剂(例如， 抗体)，其中所述VEGF结合剂包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、 包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3。在某些实施方式中，VEGF结合 剂还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含 AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22) 的轻链CDR3。在某些实施方式中，VEGF结合剂包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID  NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2 和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；以及(b)包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人VEGF的VEGF结合剂(例如， 抗体)，其中所述VEGF结合剂包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)包含DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取 代的变体；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1或其包含 1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在某些实施方式 中，所述氨基酸取代是保守性取代。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合VEGF的VEGF结合剂(例如，抗 体)，其中所述VEGF结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约80％序列同一性的 重链可变区，和与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些 实施方式中，VEGF结合剂包含与SEQ ID NO:11具有至少约85％、至少约90％、至 少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的重链可变区。在某些实施方式 中，VEGF结合剂包含与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、 至少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF结 合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约95％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID  NO:12具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF结合剂 包含：包含SEQ ID NO:11的重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在 某些实施方式中，VEGF结合剂包含：基本由SEQ ID NO:11构成的重链可变区，和 基本由SEQ ID NO:12构成的轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF结合剂包含： 包含SEQ ID NO:49的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻链。在某些实施方式中，VEGF 结合性抗体或其它试剂包含：包含SEQ ID NO:7的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻 链。

在某些实施方式中，VEGF结合剂与VEGF结合的K_D为约10nM以下。在某些 实施方式中，VEGF结合剂与VEGF结合的K_D为约1nM以下。在某些实施方式中， VEGF结合剂与VEGF结合的K_D为约0.1nM以下。在某些实施方式中，VEGF结合 剂与VEGF结合的K_D为约0.01nM以下。在某些实施方式中，VEGF结合剂的至少 一个CDR中的至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸所取代，从而使VEGF结合剂对 VEGF的亲和力改变。在某些实施方式中，VEGF结合剂的亲和力增加。在某些实施 方式中，VEGF结合剂的亲和力减小。在某些实施方式中，VEGF结合剂结合人VEGF。 在某些实施方式中，VEGF结合剂结合人VEGF和小鼠VEGF。

在某些实施方式中，VEGF结合剂包含219R45抗体的重链可变区和轻链可变区。 在某些实施方式中，VEGF结合剂包含219R45抗体的重链和轻链(具有或不具有前导 序列)。在某些实施方式中，VEGF结合剂是219R45抗体。

在某些实施方式中，VEGF结合剂包含219R45抗体、基本由其构成或由其构成。

在某些实施方式中，VEGF结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合VEGF上的 相同表位或基本相同表位。在另一个实施方式中，VEGF结合剂是下述抗体：该抗体 所结合的VEGF上的表位与本发明的抗体所结合的VEGF上的表位重叠。在某些实 施方式中，VEGF结合剂(例如，抗体)与抗体219R45结合VEGF上的相同表位或基 本相同表位。在另一个实施方式中，VEGF结合剂是下述抗体：该抗体所结合的VEGF 上的表位与抗体219R45结合所结合的VEGF上的表位重叠。

在某些实施方式中，VEGF结合剂抑制VEGF与至少一种VEGF受体的结合。在 某些实施方式中，VEGF结合剂抑制人VEGF与VEGFR-1或VEGFR-2的结合。在 某些实施方式中，VEGF结合剂特异性结合VEGF并调节血管发生。在某些实施方式 中，VEGF结合剂特异性结合VEGF并抑制血管发生。在某些实施方式中，VEGF结 合剂特异性结合VEGF并抑制肿瘤生长。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂(例如，抗体)包含抗体21R79的CDR中的1个、2个、 3个、4个、5个和/或6个(见表2)。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R79的 1个以上CDR、21R79的2个以上CDR、21R79的3个以上CDR、21R79的4个以 上CDR、21R79的5个以上CDR或21R79的所有6个CDR。在某些实施方式中， 本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如，抗体)，其中所述DLL4结 合剂(例如，抗体)包含抗体21R75的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6 个(见表2)。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R75的1个以上CDR、21R75 的2个以上CDR、21R75的3个以上CDR、21R75的4个以上CDR、21R75的5个 以上CDR或21R75的所有6个CDR。在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合 人DLL4的DLL4结合剂(例如，抗体)，其中所述DLL4结合剂(例如，抗体)包含抗 体21R83的CDR中的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个(见表2)。在某些实施 方式中，DLL4结合剂包含21R83的1个以上CDR、21R83的2个以上CDR、21R83 的3个以上CDR、21R83的4个以上CDR、21R83的5个以上CDR或21R83的所 有6个CDR。在某些实施方式中，DLL4结合剂结合人DLL4和小鼠DLL4。

表2

在某些实施方式中，DLL4结合抗体的重链CDR1是包含AYYIH(SEQ ID NO:79) 的最小HC CDR1。

在某些实施方式中，结合剂是结合人DLL4的抗体，并且包含：包含TAYYIH (SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1；包含 YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链CDR2，其中X₁是丝氨酸或丙 氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、 精氨酸或天冬氨酸；和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及 包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、 包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂 还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及(b)包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)包含YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取 代的变体；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1或其包含 1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在某些实施方式 中，所述氨基酸取代是保守性取代。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合DLL4的DLL4结合剂(例如，抗 体)，其中所述DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:10具有至少约80％序列同一性的重 链可变区，和与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实 施方式中，DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约90％、至少 约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中， DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至 少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合 剂包含：与SEQ ID NO:10具有至少约95％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID  NO:12具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂 包含：包含SEQ ID NO:10的重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在 某些实施方式中，DLL4结合剂包含：基本由SEQ ID NO:10构成的重链可变区，和 基本由SEQ ID NO:12构成的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含： 包含SEQ ID NO:48的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻链。在某些实施方式中，DLL4 结合抗体或其它试剂包含：包含SEQ ID NO:6的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻链。 在某些实施方式中，抗体是双特异性抗体。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、 包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂 还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)的重链CDR2和包 含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及(b)包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)包含YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取 代的变体；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1或其包含 1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在某些实施方式 中，所述氨基酸取代是保守性取代。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合DLL4的DLL4结合剂(例如，抗 体)，其中所述DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:58具有至少约80％序列同一性的重 链可变区，和与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实 施方式中，DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:58具有至少约85％、至少约90％、至少 约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中， DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至 少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合 剂包含：与SEQ ID NO:58具有至少约95％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID  NO:12具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂 包含：包含SEQ ID NO:58的重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在 某些实施方式中，DLL4结合剂包含：基本由SEQ ID NO:58构成的重链可变区，和 基本由SEQ ID NO:12构成的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含： 包含SEQ ID NO:56的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻链。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、 包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂 还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及(b)包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人DLL4的DLL4结合剂(例如， 抗体)，其中所述DLL4结合剂包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)包含YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取 代的变体；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1或其包含 1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2 或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID  NO:22)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在某些实施方式 中，所述氨基酸取代是保守性取代。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合DLL4的DLL4结合剂(例如，抗 体)，其中所述DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:64具有至少约80％序列同一性的重 链可变区，和与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实 施方式中，DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％、至少约90％、至少 约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中， DLL4结合剂包含与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至 少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合 剂包含：与SEQ ID NO:64具有至少约95％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID  NO:12具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂 包含：包含SEQ ID NO:64的重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在 某些实施方式中，DLL4结合剂包含：基本由SEQ ID NO:64构成的重链可变区，和 基本由SEQ ID NO:12构成的轻链可变区。在某些实施方式中，DLL4结合剂包含： 包含SEQ ID NO:62的重链，和包含SEQ ID NO:8的轻链。在某些实施方式中，所述 试剂是双特异性抗体。

在某些实施方式中，DLL4结合剂是包含以下的抗体：包含SEQ ID NO:5的重链， 包含SEQ ID NO:8的轻链。在某些实施方式中，抗体是双特异性抗体。

在某些实施方式中，DLL4结合剂与DLL4结合的K_D为25nM以下。在某些实 施方式中，DLL4结合剂与DLL4结合的K_D为10nM以下。在某些实施方式中，DLL4 结合剂与DLL4结合的K_D为约1nM以下。在某些实施方式中，DLL4结合剂与DLL4 结合的K_D为约0.1nM以下。在某些实施方式中，DLL4结合剂与DLL4结合的K_D为约0.01nM以下。在某些实施方式中，DLL4结合剂的至少一个CDR的至少一个氨 基酸残基被不同的氨基酸所取代，从而DLL4结合剂对DLL4的亲和力被改变。在某 些实施方式中，DLL4结合剂的亲和力提高。在某些实施方式中，DLL4结合剂的亲 和力降低。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R79抗体的重链可变区和轻链可变区。 在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R79抗体的重链和轻链(具有或不具有前导 序列)。在某些实施方式中，DLL4结合剂是21R79抗体。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含抗体21R79、基本由其构成或由其构成。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R75抗体的重链可变区和轻链可变区。 在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R75抗体的重链和轻链(具有或不具有前导 序列)。在某些实施方式中，DLL4结合剂是21R75抗体。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含抗体21R75、基本由其构成或由其构成。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R83抗体的重链可变区和轻链可变区。 在某些实施方式中，DLL4结合剂包含21R83抗体的重链和轻链(具有或不具有前导 序列)。在某些实施方式中，DLL4结合剂是21R83抗体。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含抗体21R83、基本由其构成或由其构成。

在某些实施方式中，DLL4结合剂与人DLL4的N端片段(SEQ ID NO:24的1位 至191位氨基酸)结合。在某些实施方式中，DLL4结合剂与包含SEQ ID NO:25的40 位至47位氨基酸的表位结合。在某些实施方式中，DLL4结合剂与包含SEQ ID NO:25 的113位至120位氨基酸的表位结合。在某些实施方式中，DLL4结合剂与包含SEQ  ID NO:25的40位至47位氨基酸和SEQ ID NO:25的113位至120位氨基酸的表位结 合。

在某些实施方式中，DLL4结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合DLL4上的 相同的表位或基本相同的表位。在另一个实施方式中，DLL4结合剂是下述抗体：该 抗体所结合的DLL4上的表位与本发明的抗体所结合的DLL4上的表位重叠。在某 些实施方式中，DLL4结合剂(例如，抗体)与抗体21R79结合DLL4上的相同的表位 或基本相同的表位。在另一个实施方式中，DLL4结合剂是下述抗体：该抗体所结合 的DLL4上的表位与抗体21R79所结合的DLL4上的表位重叠。在某些实施方式中， DLL4结合剂(例如，抗体)与抗体21R75结合DLL4上的相同的表位或基本相同的表 位。在另一个实施方式中，DLL4结合剂是下述抗体：该抗体所结合的DLL4上的表 位与抗体21R75所结合的DLL4上的表位重叠。在某些实施方式中，DLL4结合剂(例 如，抗体)与抗体21R83结合DLL4上的相同的表位或基本相同的表位。在另一个实 施方式中，DLL4结合剂是下述抗体：该抗体所结合的DLL4上的表位与抗体21R83 所结合的DLL4上的表位重叠。

在某些实施方式中，DLL4结合剂抑制DLL4与至少一种Notch受体的结合。在 某些实施方式中，Notch受体是Notch1、Notch2、Notch3或Notch4。在某些实施方 式中，DLL4结合剂特异性结合DLL4并抑制DLL4活性。在某些实施方式中，DLL4 结合剂特异性结合DLL4并抑制Notch信号传导。在某些实施方式中，DLL4结合剂 特异性结合DLL4并调节血管发生。在某些实施方式中，DLL4结合剂特异性结合 DLL4并抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，DLL4结合剂特异性结合DLL4并抑制 致瘤性。在某些实施方式中，DLL4结合剂特异性结合DLL4并减少肿瘤中CSC的数 目或频率。

在某些实施方式中，本发明提供了作为双特异性抗体的VEGF/DLL4结合剂。在 某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF 的第一抗原结合位点。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，其 包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和结合肿瘤相关靶标的第二抗原结合 位点。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，其包含特异性结合 人VEGF的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ  ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2 和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3。在某些实施方式中，双特 异性抗体还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含 AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22) 的轻链CDR3。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，其包含特 异性结合人VEGF的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：(a)包含 NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；以及 (b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ  ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含 与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性的第一重链可变区。在某些实施方式中， 双特异性抗体还包含与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某 些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约85％、 至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的第一重链可变 区，和与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或 至少约99％的序列同一性的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供了作为双特异性抗体的VEGF/DLL4结合剂。在 某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含特异性 结合人DLL4的第一抗原结合位点。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特 异性抗体，该双特异性抗体包含特异性结合人DLL4的第一抗原结合位点和结合肿瘤 相关靶标的第二抗原结合位点。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性 抗体，该双特异性抗体包含特异性结合人DLL4的第一抗原结合位点，其中所述第一 抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链 CDR1，包含YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链CDR2，其中X₁是丝氨酸或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且 X₄是甘氨酸、精氨酸或天冬氨酸，和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链 CDR3；以及包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含 AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22) 的轻链CDR3。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异 性抗体包含特异性结合人DLL4的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包 含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)、 YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含：包 含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:14)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含：包 含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:15)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含：包 含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:59)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含：包 含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体还包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20) 的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：特异性结合人DLL4的第一抗原结合 位点，其中所述第一抗原结合位点包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链 CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)或 YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20) 的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含 与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少约80％ 序列同一性的第一重链可变区。在某些实施方式中，双特异性抗体还包含与SEQ ID  NO:12具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性 VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID  NO:64具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序 列同一性的第一重链可变区；和/或与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、 至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供了特异性结合人VEGF和人DLL4的VEGF/DLL4 结合剂(例如，双特异性抗体)。在某些实施方式中，双特异性抗体包含：a)特异性结 合人VEGF的第一抗原结合位点，和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点， 其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包 含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；其中所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ  ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1，包含 YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链CDR2，其中X₁是丝氨酸或丙 氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、 精氨酸或天冬氨酸，和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；以及 包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO：21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性 结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH (SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链 CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3，且所述第二抗原结 合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链 CDR3；且其中第一和第二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID  NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位 点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包 含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所 述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体是219R45-MB-21R79。

在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位 点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包 含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所 述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体是219R45-MB-21M18。

在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位 点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包 含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所 述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体是219R45-MB-21R75。

在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位 点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包 含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所 述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体是219R45-MB-21R83。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，双特异性抗体)包含：与SEQ ID  NO:11具有至少约80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:9、SEQ ID  NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少约80％序列同一性的第二重链可变 区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的第一和第二轻链可变区。在 某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的第一重 链可变区；与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有 至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的 第二重链可变区；以及与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、 至少约97％或至少约99％的序列同一性的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式 中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约95％序列同一 性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:9具有至少约95％序列同一性的第二重链可变 区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约95％序列同一性的第一和第二轻链可变区。在 某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约 95％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:10具有至少约95％序列同一性的 第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约95％序列同一性的第一和第二轻 链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与SEQ ID NO:11 具有至少约95％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:58具有至少约95％序 列同一性的第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约95％序列同一性的第 一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：与 SEQ ID NO:11具有至少约95％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:64具 有至少约95％序列同一性的第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约95％ 序列同一性的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结 合剂包含：包含SEQ ID NO:11的第一重链可变区，包含SEQ ID NO:9的第二重链可 变区，和包含SEQ ID NO:12的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，双特异 性VEGF/DLL4结合剂包含：包含SEQ ID NO:11的第一重链可变区，包含SEQ ID  NO:10的第二重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的第一和第二轻链可变区。在某些 实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：包含SEQ ID NO:11的第一重链可 变区，包含SEQ ID NO:58的第二重链可变区，和包含SEQ ID NO:12的第一和第二 轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：包含SEQ ID  NO:11的第一重链可变区，包含SEQ ID NO:64的第二重链可变区，和包含SEQ ID  NO:12的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂 包含：基本由SEQ ID NO:11构成的第一重链可变区，基本由SEQ ID NO:9构成的第 二重链可变区，和基本由SEQ ID NO:12构成的第一和第二轻链可变区。在某些实施 方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：基本由SEQ ID NO:11构成的第一重链 可变区，基本由SEQ ID NO:10构成的第二重链可变区，和基本由SEQ ID NO:12构 成的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含： 基本由SEQ ID NO:11构成的第一重链可变区，基本由SEQ ID NO:58构成的第二重 链可变区，和基本由SEQ ID NO:12构成的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式 中，双特异性VEGF/DLL4结合剂包含：基本由SEQ ID NO:11构成的第一重链可变 区，基本由SEQ ID NO:64构成的第二重链可变区，和基本由SEQ ID NO:12构成的 第一和第二轻链可变区。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗VEGF抗体219R45的重 链可变区的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗 DLL4抗体21M18的重链可变区的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂是包含来自抗DLL4抗体21R79的重链可变区的双特异性抗体。在某些实施方 式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗DLL4抗体21R75的重链可变区的双特异性 抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗DLL4抗体21R83的重 链可变区的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体， 该双特异性抗体包含：来自抗VEGF抗体219R45的重链可变区、来自抗DLL4抗体 21R79的重链可变区和两条相同的轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结 合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：来自抗VEGF抗体219R45的重链可变 区、来自抗DLL4抗体21M18的重链可变区和两条相同的轻链可变区。在某些实施 方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：来自抗VEGF 抗体219R45的重链可变区、来自抗DLL4抗体21R75的重链可变区和两条相同的轻 链可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗 体包含：来自抗VEGF抗体219R45的重链可变区、来自抗DLL4抗体21R83的重链 可变区和两条相同的轻链可变区。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含第一CH3结构域和第二CH3结 构域的双特异性抗体，所述第一和第二CH3结构域各自经修饰以便促进异源多聚体 的形成。在某些实施方式中，所述第一和第二CH3结构域利用引钮入孔 (knobs-into-holes)技术进行修饰。在某些实施方式中，所述第一和第二CH3结构域包 括会导致静电相互作用被改变的氨基酸变化。在某些实施方式中，所述第一和第二 CH3结构域包括会导致疏水/亲水相互作用被改变的氨基酸变化。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含选自由以下组成的组的重链恒定 区的双特异性抗体：(a)第一人IgG1恒定区(其中253位和292位的氨基酸被谷氨酸 或天冬氨酸取代)和第二人IgG1恒定区(其中240位和282位的氨基酸被赖氨酸取代)； (b)第一人IgG2恒定区(其中249位和288位的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸取代)和第 二人IgG2恒定区(其中236位和278位的氨基酸被赖氨酸取代)；(c)第一人IgG3恒 定区(其中300位和339位的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸取代)和第二人IgG3恒定区 (其中287位和329位的氨基酸被赖氨酸取代)；以及(d)第一人IgG4恒定区(其中250 位和289位的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸取代)和第二人IgG4恒定区(其中237位和 279位的氨基酸被赖氨酸取代)。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含第一人IgG1恒定区(在253位和 292位具有氨基酸取代，所述氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸)和第二人IgG1恒定区(在 240位和282位具有氨基酸取代，所述氨基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。在某些实施 方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含第一人IgG2恒定区(在249位和288位具有氨基 酸取代，所述氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸)和第二人IgG2恒定区(在236位和278位 具有氨基酸取代，所述氨基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是包含第一人IgG3恒定区(在300位和339位具有氨基酸取代， 所述氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸)和第二人IgG2恒定区(在287位和329位具有氨基 酸取代，所述氨基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结 合剂是包含第一人IgG4恒定区(在250位和289位具有氨基酸取代，所述氨基酸为谷 氨酸或天冬氨酸)和第二人IgG4恒定区(在237位和279位具有氨基酸取代，所述氨 基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含第一人IgG2恒定区(在249位和 288位具有氨基酸取代，所述氨基酸为谷氨酸)和第二人IgG2恒定区(在236位和278 位具有氨基酸取代，所述氨基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是包含第一人IgG2恒定区(在249位和288位具有氨基酸取代， 所述氨基酸为天冬氨酸)和第二人IgG2恒定区(在236位和278位具有氨基酸取代， 所述氨基酸为赖氨酸)的双特异性抗体。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:7的重链的双特异性 抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:5的重链的双特异 性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:56的重链的双 特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:62的重链 的双特异性抗体。在某些实施方式中，双特异性抗体还包含SEQ ID NO:12的轻链。 在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:7的重链、SEQ ID NO:5 的重链和两条SEQ ID NO:8的轻链的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂是包含SEQ ID NO:7的重链、SEQ ID NO:6的重链和两条SEQ ID NO:8的轻 链的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:7的 重链、SEQ ID NO:56的重链和两条SEQ ID NO:8的轻链的双特异性抗体。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含SEQ ID NO:7的重链、SEQ ID NO:62的重链 和两条SEQ ID NO:8的轻链的双特异性抗体。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与VEGF结合的K_D为约50nM以下、 约25nM以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的双特异性抗体。在某 些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与DLL4结合的K_D为约50nM以下、约25nM 以下、约10nM以下、约1nM以下或约0.1nM以下的双特异性抗体。在某些实施方 式中，VEGF/DLL4结合剂是与VEGF结合的K_D为约50nM以下且与DLL4结合的 K_D为约50nM以下的双特异性抗体。在某些实施方式中，双特异性抗体与VEGF结 合的K_D为约25nM以下且与DLL4结合的K_D为约25nM以下。在某些实施方式中， 双特异性抗体与VEGF结合的K_D为约10nM以下且与DLL4结合的K_D为约10nM以 下。在某些实施方式中，双特异性抗体与VEGF结合的K_D为约1nM以下且与DLL4 结合的K_D为约1nM以下。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体，该双特异性抗体包含 的一个抗原结合位点的结合亲和力并第二抗原结合位点的结合亲和力更弱。例如，在 某些实施方式中，双特异性抗体可以与VEGF以约0.1nM至1nM范围内的K_D结合， 且可以与DLL4以约1nM至10nM范围内的K_D结合。或者，所述双特异性抗体可以 与VEGF以约1nM至10nM范围内的K_D结合，且可以与DLL4以约0.1nM至1nM 范围内的K_D结合。在某些实施方式中，双特异性抗体可以与DLL4以约0.1nM至 1nM范围内的K_D结合，且可以与VEGF以约1nM至10nM范围内的K_D结合。或者， 所述双特异性抗体可以与DLL4以约1nM至10nM范围内的K_D结合，且可以与VEGF 以约0.1nM至1nM范围内的K_D结合。在某些实施方式中，两个抗原结合位点的亲 和力差异可以为约2倍以上、约3倍以上、约5倍以上、约8倍以上、约10倍以上、 约15倍以上、约30倍以上、约50倍以上或约100倍以上。在某些实施方式中，针 对VEGF的抗原结合位点的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基被不同氨基酸所 取代，从而VEGF结合位点的亲和力被改变。在某些实施方式中，VEGF结合位点的 亲和力提高。在某些实施方式中，VEGF结合位点的亲和力降低。在某些实施方式中， 针对DLL4的抗原结合位点的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基被不同氨基酸 所取代，从而DLL4结合位点的亲和力被改变。在某些实施方式中，DLL4结合位点 的亲和力提高。在某些实施方式中，DLL4结合位点的亲和力降低。在某些实施方式 中，VEGF和DLL4抗原结合位点的亲和力均被改变。

本发明提供了特异性结合VEGF和/或DLL4的多肽，包括但不限于抗体。在某 些实施方式中，多肽结合人VEGF。在某些实施方式中，多肽结合人DLL4。在某些 实施方式中，多肽结合人VEGF和小鼠VEGF。在某些实施方式中，多肽结合人DLL4 和小鼠DLL4。

在某些实施方式中，VEGF结合剂包含含有选自由以下组成的组的序列的多肽： SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ  ID NO:12、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49。

在某些实施方式中，DLL4结合剂包含含有选自由以下组成的组的序列的多肽： SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ NO ID:6、SEQ ID  NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:46、SEQ ID  NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID  NO:63和SEQ ID NO:64。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂包含含有选自由以下组成的组的序列的 多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ  ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ  ID NO:49、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ  ID NO:63和SEQ ID NO:64。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂包含含有选自由以下组成的组的序列的 多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、 SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂还包含含有选自由以下组成的组的序列的多肽：SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂还包含含有选自由以下组成的组的序列的多肽：SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂包含含有选自由以下组成的组的序列的 多肽：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49。 在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂还包含含有选自由以下组成的组的序列的多 肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID  NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂还包含含有选自由以下组成的组的序列的多肽：SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与以下抗体竞争对VEGF 的特异性结合：所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的重链可变区和含有SEQ ID NO:12 的轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与抗体219R45竞争对人VEGF 的特异性结合。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体在体外竞争性结合检 测中竞争对于VEGF的特异性结合。在某些实施方式中，VEGF是人VEGF。在某些 实施方式中，VEGF是小鼠VEGF。

在某些实施方式中，VEGF-DLL4结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合VEGF 上的相同表位或基本相同的表位。在另一个实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是下述 抗体：该抗体所结合的VEGF上的表位与本发明的抗体所结合的VEGF上的表位重 叠。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与抗体219R45结合VEGF 上的相同表位或基本相同的表位。在另一个实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是下述 抗体：该抗体所结合的VEGF上的表位与抗体219R45所结合的VEGF上的表位重叠。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与抗体219R45竞争对VEGF的特异 性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与以下抗体竞争对DLL4 的特异性结合：所述抗体包含含有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或 SEQ ID NO:64的重链可变区和含有SEQ ID NO:12的轻链可变区。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂与抗体21R79竞争对人DLL4的特异性结合。在某些实施方 式中，VEGF/DLL4结合剂与抗体21R75竞争对人DLL4的特异性结合。在某些实施 方式中，VEGF/DLL4结合剂与抗体21R83竞争对人DLL4的特异性结合。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体在体外竞争性结合检测中竞争对于DLL4的特 异性结合。在某些实施方式中，DLL4是人DLL4。在某些实施方式中，DLL4是小鼠 DLL4。

在某些实施方式中，VEGF-DLL4结合剂(例如，抗体)与本发明的抗体结合DLL4 上的相同表位或基本相同的表位。在另一个实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是下述 抗体：该抗体所结合的DLL4上的表位与本发明的抗体所结合的DLL4上的表位重叠。 在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与抗体21R79结合DLL4上的 相同表位或基本相同的表位。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体) 与抗体21R75结合DLL4上的相同表位或基本相同的表位。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与抗体21R83结合DLL4上的相同表位或基本相同 的表位。在另一个实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是下述抗体：该抗体所结合的DLL4 上的表位与抗体21R79所结合的DLL4上的表位重叠。在另一个实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是下述抗体：该抗体所结合的DLL4上的表位与抗体21R75所结 合的DLL4上的表位重叠。在另一个实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是下述抗体： 该抗体所结合的DLL4上的表位与抗体21R83所结合的DLL4上的表位重叠。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与抗体21R79竞争对DLL4的特异性 结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂 是与抗体21R75竞争对DLL4的特异性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。在 某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与抗体21R83竞争对DLL4的特异性结合(例 如，在竞争性结合检测中)的试剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与抗体 21M18竞争对DLL4的特异性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与双特异性抗体219R45-MB-21M18 竞争对VEGF和/或DLL4的特异性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。在某些 实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是与双特异性抗体219R45-MB-21M79竞争对VEGF 和/或DLL4的特异性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是与双特异性抗体219R45-MB-21M75竞争对VEGF和/或DLL4 的特异性结合(例如，在竞争性结合检测中)的试剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂是与双特异性抗体219R45-MB-21M83竞争对VEGF和/或DLL4的特异性结合 (例如，在竞争性结合检测中)的试剂。

在某些实施方式中，本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)结合VEGF并 调节VEGF活性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF拮抗剂并抑制 VEGF活性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF拮抗剂并调节血管发 生。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF拮抗剂并抑制血管发生。在某 些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF拮抗剂并抑制肿瘤生长。

在某些实施方式中，本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)结合人DLL4 并调节DLL4活性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并抑制 DLL4活性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并抑制Notch 活性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并抑制Notch信号传 导。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并调节血管发生。在某 些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并促进畸变血管发生。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并抑制肿瘤生长。

在某些实施方式中，本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)是结合人VEGF 并调节VEGF活性的双特异性抗体。在某些实施方式中，本文所述的VEGF/DLL4结 合剂(例如，抗体)是结合人DLL4并调节DLL4活性的双特异性抗体。在某些实施方 式中，本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)是结合人VEGF和人DLL4并调 节VEGF和DLL4活性的双特异性抗体。在某些实施方式中，双特异性抗体是VEGF 拮抗剂和DLL4拮抗剂并且抑制VEGF活性和DLL4活性。在某些实施方式中，双特 异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4拮抗剂并且抑制VEGF活性和Notch活性。在某些 实施方式中，双特异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4拮抗剂并且抑制VEGF活性和 Notch信号传导。在某些实施方式中，双特异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4拮抗剂 并且调节血管发生。在某些实施方式中，双特异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4拮抗 剂并且促进畸变血管发生。在某些实施方式中，双特异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4 拮抗剂并且抑制血管发生。在某些实施方式中，双特异性抗体是VEGF拮抗剂和DLL4 拮抗剂并且抑制肿瘤生长。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体或双特异性抗体)是VEGF 拮抗剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF拮抗剂并抑制VEGF活性。 在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂将VEGF活性抑制了至少约10％、至少约 20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约100％。在某些 实施方式中，抑制人VEGF活性的VEGF/DLL4结合剂是抗体219R45。在某些实施 方式中，抑制人VEGF活性的VEGF/DLL4结合剂是包含219R45的抗原结合位点的 双特异性抗体。在某些实施方式中，抑制人VEGF活性的VEGF/DLL4结合剂是双特 异性抗体219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，抑制人VEGF活性的VEGF/DLL4 结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R79。在某些实施方式中，抑制人VEGF活性 的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，抑 制人VEGF活性的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R83。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)是DLL4拮抗剂。在某些 实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是DLL4拮抗剂并抑制DLL4活性。在某些实施方 式中，VEGF/DLL4结合剂将DLL4活性抑制了至少约10％、至少约20％、至少约30％、 至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约100％。在某些实施方式中，抑制人 DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R79。在某些实施方式中，抑制人DLL4 活性的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R75。在某些实施方式中，抑制人DLL4活性的 VEGF/DLL4结合剂是抗体21R83。在某些实施方式中，抑制人DLL4活性的 VEGF/DLL4结合剂是包含21R79的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式 中，抑制人DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是包含21R75的抗原结合位点的双特异 性抗体。在某些实施方式中，抑制人DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是包含21R83 的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，抑制人DLL4活性的 VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，抑制人 DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R79。在某些实施方 式中，抑制人DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R75。 在某些实施方式中，抑制人DLL4活性的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体 219R45-MB-21R83。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)是Notch信号传导的拮抗 剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂将Notch信号传导抑制了至少约10％、 至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约100％。 在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R79。在某 些实施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R75。在某些实 施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R83。在某些实施方 式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是包含21R79的抗原结合位点的双 特异性抗体。在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是包含 21R75的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的 VEGF/DLL4结合剂是包含21R83的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式 中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21M18。 在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体 219R45-MB-21R79。在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的VEGF/DLL4结合剂 是双特异性抗体219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的 VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R83。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)抑制VEGF与至少一个受 体的结合。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂抑制VEGF与VEGFR-1或 VEGFR-2的结合。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂将VEGF与至少一个VEGF 受体的结合抑制了至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％ 或至少约95％。在某些实施方式中，抑制人VEGF与至少一个VEGF受体的结合的 VEGF/DLL4结合剂是抗体219R45。在某些实施方式中，抑制人VEGF与至少一个 VEGF受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是包含219R45的抗原结合位点的双特异性 抗体。在某些实施方式中，抑制人VEGF与至少一个VEGF受体的结合的VEGF/DLL4 结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，抑制人VEGF与至 少一个VEGF受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R79。 在某些实施方式中，抑制人VEGF与至少一个VEGF受体的结合的VEGF/DLL4结合 剂是双特异性抗体219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，抑制人VEGF与至少一 个VEGF受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R83.

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)抑制DLL4蛋白与至少一 个Notch受体的结合。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂抑制DLL4与Notch1、 Notch2、Notch3和/或Notch4的结合。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂将DLL4 与至少一个Notch受体的结合抑制了至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少 约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，抑制人DLL4与至少一个 Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R79。在某些实施方式中，抑制人 DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是抗体21R75。在某些实 施方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是抗体 21R83。在某些实施方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4 结合剂是包含21R79的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，抑制人 DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是包含21R75的抗原结合 位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体的结 合的VEGF/DLL4结合剂是包含21R83的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施 方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异 性抗体219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受 体的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R79。在某些实施方 式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异性 抗体219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，抑制人DLL4与至少一个Notch受体 的结合的VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体219R45-MB-21R83。

用于确定VEGF/DLL4结合剂(或候选VEGF/DLL4结合剂)是否抑制VEGF或影 响血管发生的体内和体外检测是本领域已知的。血管发生的体外检测包括但不限于： HUVEC增殖检测、内皮细胞小管形成检测、出芽(或芽形成)检测、HUVEC细胞迁移 检测和侵袭检测。在某些实施方式中，将存在VEGF和存在VEGF/DLL4结合剂时的 细胞与存在VEGF但不存在VEGF/DLL4结合剂时的细胞进行比较，并评估对血管发 生的效果(或与血管发生相关的生物效果)。血管发生体内检测包括但不限于基质胶塞 分析(matrigel plug assay)、角膜微囊袋检测和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)检测。

用于确定VEGF/DLL4结合剂(或候选VEGF/DLL4结合剂)是否抑制Notch活化 或信号传导的体内和体外检测是本领域已知的。例如，可以使用基于细胞的荧光素酶 报告基因检测来在体外测定Notch信号传导水平，该检测利用含有萤火虫荧光素酶报 告基因上游的TCF结合结构域的多个拷贝的TCF/Luc报告基因载体(Gazit等，1999, Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在某些实施方式中，可以 使用下述基于细胞的荧光素酶报告基因检测，该检测利用含有萤火虫荧光素酶报告基 因上游的CBF结合结构域的多个拷贝的CBF/Luc报告基因载体。将存在一个或多个 Notch配体(例如，表达在转染的细胞的表面上的DLL4或可溶性DLL4-Fc融合蛋白) 和存在VEGF/DLL4结合剂时的Notch信号传导水平与不存在VEGF/DLL4结合剂时 的Notch信号传导水平进行比较。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂具有一种以上的以下效果：抑制肿瘤细 胞增殖、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性、减少肿瘤中癌干细胞的频率、触发肿瘤 细胞的细胞死亡、避免肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞的存活、调节血管发生、抑制血 管发生、抑制生产性血管发生或者促进畸变血管发生。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂能抑制肿瘤生长。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂能抑制体内肿瘤生长(例如，在异体移植小鼠模型中，和/或患癌 的人中)。在某些实施方式中，与未经处理的肿瘤相比，肿瘤生长被抑制了至少约2 倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂能减少肿瘤的致瘤性。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂或抗体能减少动物模型(如小鼠异体移植模型)中的包含癌干 细胞的肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体能通过减少肿 瘤中癌干细胞的数目或频率来减少肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细 胞的数目或频率被减少了至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100 倍或约1000倍。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数目或频率的减少通过利用 动物模型的有限稀释检测来确定。关于用以确定肿瘤中癌干细胞的数目或频率的减少 的有限稀释检测的使用的额外实例和指引可见于国际申请WO2008/042236号、美国 专利公开2008/0064049号和美国专利公开2008/0178305号。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂能调节血管发生。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂能调节体内血管发生(例如，在异体移植小鼠模型中，和/或患癌 的人中)。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂能抑制血管发生。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂能促进畸变血管发生。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结 合剂能抑制血管发生和/或促进畸变血管发生，从而导致非生产性血管化。

在某些实施方式中，本文所述的VEGF/DLL4结合剂在小鼠、食蟹猴或人中的循 环半衰期为至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约 3天、至少约1周或至少约2周。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是IgG(例 如，IgG1或IgG2)抗体，该IgG抗体在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约2 小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或 至少约2周。增加(或减少)如多肽和抗体等试剂的半衰期的方法是本领域已知的。例 如，增加IgG抗体的循环半衰期的已知方法包括在Fc区引入会增加抗体与新生Fc 受体(FcRn)在pH6.0的pH依赖性结合的突变(参见例如，美国专利公开2005/0276799 号、2007/0148164号和2007/0122403号)。增加缺乏Fc区的抗体片段的循环半衰期 的已知方法包括如聚乙二醇化(PEGylation)这类技术。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗体。可以通过任何已知方法来制备 多克隆抗体。在某些实施方式中，通过多次皮下或腹膜内注射用所关注抗原(例如， 纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)对动物(例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、驴) 进行免疫，从而制备多克隆抗体。所述抗原可以可选地与如匙孔血蓝蛋白(KLH)或血 清白蛋白等载剂缀合。将抗原(具有或不具有载蛋白)稀释于无菌盐水并通常与佐剂(例 如完全或不完全弗氏佐剂)组合以形成稳定的乳液。在一段充分的时间后，从经免疫 的动物(通常是从血液或腹水)回收多克隆抗体。可以根据本领域的标准方法从血清或 腹水中纯化多克隆抗体，所述标准方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶 电泳和透析。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是单克隆抗体。可以使用本领域技术人 员已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体(参见例如Kohler和Milstein，1975，Nature256： 495-497)。在某些实施方式中，使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠或其它合适 的宿主动物进行免疫，从而从淋巴细胞引起与免疫抗原特异性结合的抗体的产生。在 某些实施方式中，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。在某些实施方式中，免疫抗原可 以是人类蛋白或其一部分。在某些实施方式中，免疫抗原可以是小鼠抗原或其一部分。

免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与合适的骨髓瘤细胞系融合。 利用本领域已知的专用培养基选出杂交瘤细胞，而未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞不 会在选择过程中存活。可以通过各种方法鉴定出产生特异性针对所选择抗原的单克隆 抗体的杂交瘤，所述方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合检查(例如， 流式细胞术、FACS、ELISA和放射免疫检测)。可以使用标准方法(J.W.Goding,1996, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第3版，Academic Press,San Diego,CA) 进行体外培养或在动物中体内地作为腹水肿瘤使杂交瘤增殖。可以根据本领域的标准 方法从培养基或腹水中纯化单克隆抗体，所述标准方法包括但不限于亲和色谱、离子 交换色谱、凝胶电泳和透析。

在某些实施方式中，可以利用本领域技术人员已知的重组DNA技术制备单克隆 抗体。通过例如使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物的 RT-PCR，可以从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离出编码单克隆抗体的多核苷酸，且其 序列可使用标准技术确定。然后将编码重链和轻链的分离多核苷酸克隆至合适的表达 载体内，该表达载体在转染至不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如结肠杆菌、猴 COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)内时产生单克隆抗体。

在某些其他实施方式中，可以从表达所需物种的可变域或CDR的噬菌体展示文 库分离出重组单克隆抗体或其片段(参见例如，McCafferty等，1990,Nature, 348:552-554；Clackson等，1991,Nature,352:624-628；和Marks等，1991,J.Mol.Biol., 222:581-597)。

编码单克隆抗体的多核苷酸可以例如通过利用重组DNA技术进行修饰，易产生 替代性抗体。在某些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定域可以被 例如人抗体的那些区域所取代以产生嵌合抗体，或可被非免疫球蛋白多肽取代以产生 融合抗体。在某些实施方式中，所述恒定区被截短或移除，以产生单克隆抗体的所需 抗体片段。可以利用对可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、 亲和力等。

在某些实施方式中，针对VEGF和/或DLL4的单克隆抗体是人源化抗体。通常， 人源化抗体是人类免疫球蛋白，该人类免疫球蛋白中的来自CDR的残基利用本领域 技术人员已知的方法被来自非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的具有所需 特异性、亲和力和/或结合能力的CDR的残基所替换。在某些实施方式中，人免疫球 蛋白的Fv框架区残基被来自非人类物种的具有所需特异性、亲和力和/或结合能力的 抗体中的相应残基所替代。在某些实施方式中，通过取代Fv框架区中和/或所替代的 非人类残基内的额外残基，可以对人源化抗体进行修饰以增强和优化抗体特异性、亲 和力和/或能力。通常，人源化抗体包含基本上不少于(all of)至少一个、通常两个或三 个可变域，所述可变域含有所有、或基本上所有的与非人类免疫球蛋白对应的CDR 区，而所有、或基本上所有的框架区是人类免疫球蛋白共有序列的框架区。在某些实 施方式中，人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人类免疫球蛋白)恒定区或域(Fc) 的至少一部分。在某些实施方式中，此类人源化抗体被治疗性使用，因其可以在施用 于人类受试对象时降低免疫原性和HAMA(人抗小鼠抗体)响应。本领域技术人员将 能遵循已知技术获得具有降低的免疫原性的功能性人源化抗体(参见例如，美国专利 5,225,539号、5,585,089；5,693,761号和5,693,762号)。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是人抗体。人抗体可以利用本领域已知 的各种技术直接制备。在某些实施方式中，可以由经过体外免疫的永生化人B淋巴 细胞或由分离自经免疫的个体的淋巴细胞产生人抗体。在任一情形中，可以生成并分 离出产生针对靶抗原的抗体的细胞(参见例如，Cole等，1985,Monoclonal Antibodies  and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页；Boemer等，1991,J.Immunol.,147:86-95； 和美国专利5,750,373号、5,567,610号和5,229,275号)。在某些实施方式中，可以从 噬菌体文库选择人抗体，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，1996,Nature  Biotechnology,14:309-314；Sheets等，1998,PNAS,95:6157-6162；Hoogenboom and  Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等，1991,J.Mol.Biol.,222:581)。作为另一 选择，可以使用噬菌体展示技术从来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变域基因库在 体外产生人抗体和抗体片段。产生和使用抗体噬菌体文库的技术也描述于美国专利 5,969,108号、6,172,197号、5,885,793号、6,521,404号、6,544,731号、6,555,313号、 6,582,915号、6,593,081号、6,300,064号、6,653,068号、6,706,484号和7,264,963号 以及Rothe等，2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200中。一旦鉴定出抗体，便可采用本领 域已知的亲和力成熟化策略来产生高亲和力人抗体，所述亲和力成熟化策略包括但不 限于链改组(Marks等，1992,Bio/Technology,10:779-783)和定点诱变。

在某些实施方式中，可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人抗 体。在免疫后，这些小鼠能够在不存在内源性免疫球蛋白生产的情况下产生整个人抗 体库。该方法描述于美国专利5,545,807号、5,545,806号、5,569,825号、5,625,126 号、5,633,425号和5,661,016号中。

本发明还涵盖了双特异性抗体。双特异性抗体能够特异性识别并结合至少两种不 同抗原或表位。所述不同表位可以处于相同分子内(例如，同一蛋白上的两个表位)或 处于不同分子上(例如，一种蛋白上的一个表位和第二蛋白上的一个表位)。在某些实 施方式中，与单个抗体或多于一种抗体的组合相比，双特异性抗体具有提高的潜能。 在某些实施方式中，与单个抗体或多于一种抗体的组合相比，双特异性抗体具有降低 的毒性。本领域技术人员已知，任何结合剂(例如，抗体)都可以具有独特的药代动力 学(PK)(例如，循环半衰期)。在某些实施方式中，双特异性抗体具有使两种活性结合 剂的PK同步的能力，其中所述两种单独结合剂具有不同的PK模式。在某些实施方 式中，双特异性抗体具有将两种结合剂(例如，抗体)的作用结合在公共区域(例如，肿 瘤和/或肿瘤环境)的能力。在某些实施方式中，双特异性抗体具有将两种结合剂(例如， 抗体)的作用结合在公共靶标(例如，肿瘤或肿瘤细胞)的能力。双特异性抗体具有将两 种结合剂(例如，抗体)的作用靶向多于一种生物途径或功能的能力。

在某些实施方式中，双特异性抗体特异性结合VEGF和第二靶标。在某些实施方 式中，双特异性抗体特异性结合DLL4和第二靶标。在某些实施方式中，双特异性抗 体特异性结合VEGF和DLL4。在某些实施方式中，双特异性抗体特异性结合人VEGF 和人DLL4。在某些实施方式中，双特异性抗体是单克隆的人抗体或人源化抗体。在 某些实施方式中，双特异性抗体抑制血管发生并减少癌干细胞数目或频率。在某些实 施方式中，双特异性抗体抑制血管生长并抑制血管成熟。在某些实施方式中，双特异 性抗体防止内皮过度增生。在某些实施方式中，双特异性抗体具有降低的毒性和/或 副作用。在某些实施方式中，与两种单独的抗体的混合物或所述抗体作为单一试剂相 比，双特异性抗体具有降低的毒性和/或副作用。在某些实施方式中，双特异性抗体 具有提高的治疗指数。在某些实施方式中，与两种单独的抗体的混合物或所述抗体作 为单一试剂相比，双特异性抗体具有提高的治疗指数。

在某些实施方式中，双特异性抗体能特异性识别并结合第一抗原靶标(例如， DLL4)以及如白细胞上的效应分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受体(例如， CD64、CD32或CD16)等第二抗原靶标，从而将细胞防御机制集中于表达第一抗原靶 标的细胞。在某些实施方式中，双特异性抗体可以被用来将细胞毒性剂导向表达特定 的靶抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合位点(例如，与人DLL4的抗原结合位点)和 结合细胞毒性剂或放射性核螯合剂(如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的第二位 点。

双特异性抗体的制备技术是本领域技术人员已知的，例如，Millstein等，1983, Nature,305:537-539；Brennan等，1985,Science,229:81；Suresh等，1986,Methods in  Enzymol.,121:120；Traunecker等，1991,EMBO J.,10:3655-3659；Shalaby等，1992,J. Exp.Med.,175:217-225；Kostelny等，1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber等， 1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利5,731,168号；国际申请公开WO2009/089004 号；和美国专利公开2011/0123532号。在某些实施方式中，双特异性抗体包含下述 重链恒定区，所述重链恒定区的作为两条重链之间的界面的一部分的氨基酸被修饰。 在某些实施方式中，双特异性抗体可以利用“引钮入孔(knobs-into-holes)”技术产生(参 见例如，美国专利5,731,168号；Ridgway等，1996,Prot.Engin.,9:617-621)。有时候 术语“旋钮(knob)”和“孔(hole)”被术语“结节(protuberance)”和“腔(cavity)”代替。 在某些实施方式中，双特异性抗体可以包含无法在重链间形成二硫键的可变铰链区 (参见例如，WO2006/028936)。在某些实施方式中，所述修饰可以包括会导致静电相 互作用的改变的氨基酸变化。在某些实施方式中，所述修饰可以包括会导致疏水/亲 水相互作用的改变的氨基酸变化。

双特异性抗体可以是完整抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。具有超过两价的 抗体也被考虑。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，1991,J.Immunol.,147:60)。因 此，在某些实施方式中，针对VEGF和/或DLL4的抗体是多特异性的。

在某些实施方式中，本文所述的抗体(或其它多肽)是单特异性的。在某些实施方 式中，抗体所含的一种以上的抗原结合位点中的每一种均能结合(或结合)不同蛋白上 的同源性表位。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗体片段。抗体片段可以具有不同于 完整抗体的功能或能力；例如，抗体片段可以具有提高的肿瘤穿透性。已知有各种用 于制备抗体片段的技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化。在某些实施方式 中，通过对抗体分子的胃蛋白酶消化来制备包含F(ab')2片段的抗体片段。在某些实 施方式中，通过对F(ab')2片段的二硫键进行还原来产生包含Fab片段的抗体片段。 在其它实施方式中，通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子来产生包含Fab的抗体 片段。在某些实施方式中，抗体片段以重组方式制备。在某些实施方式中，抗体片段 包含Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可以在结肠杆菌或其它宿主 细胞中表达并从其分泌，从而允许制备大量的此类片段。在某些实施方式中，从本文 所述的抗体噬菌体文库中分离出抗体片段。例如，可以使用用以构建Fab表达文库的 方法(Huse等，1989,Science,246:1275-1281)，以便能够快速有效地鉴定具有所需的 对于VEGF和/或DLL4或其衍生物、片段、类似物或同源物的特异性的单克隆Fab 片段。在某些实施方式中，抗体片段是线性抗体片段。在某些实施方式中，抗体片段 是单特异性或双特异性的。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是scFv。可以使 用各种技术来制备对于VEGF或DLL4特异的单链抗体(参见例如，美国专利4,946,778 号)。

此外，尤其使在抗体片段的情形中，理想的是，对抗体进行修饰以便改变(例如， 提高或降低)其血清半衰期。这可以通过下述方式实现：例如通过在抗体片段中合适 区域的突变从而将补救受体(salvage receptor)结合表位引入到抗体片段中，或通过将 所述表位引入到肽标签中，然后所述肽标签与抗体片段在任一端或在中间融合(例如 通过DNA或肽合成)。

异源缀合抗体(heteroconjugate antibody)也在本发明的范围之内。异源缀合抗体由 两个共价结合的抗体组成。例如，已经提出此类抗体可使免疫细胞靶向不想要的细胞 (参见例如美国专利4,676,980号)。还设想可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在 体外制备异源缀合抗体，所述合成蛋白质化学包括涉及交联剂的合成蛋白质化学。例 如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适 试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(或酯)(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸盐(或酯)。

出于本发明的目的，应该理解，修饰的抗体可以包含可提供抗体与靶标(即，人 VEGF或人DLL4)的结合的任何类型的可变区。在这点上，所述可变区可以包括或源 自任何类型的哺乳动物，所述哺乳动物可以经诱导而发动体液响应和产生针对所需抗 原的免疫球蛋白。因此，经修饰抗体的可变区可以源自例如人类、鼠类、非人灵长类 (如食蟹猴、弥猴等)或兔。在某些实施方式中，经修饰免疫球蛋白的可变区和恒定区 是人类的。在其它实施方式中，可以对相容性抗体的可变区(通常源自非人类来源)进 行工程化或特殊剪裁，从而改善结合性质或减少所述分子的免疫原性。在这点上，可 以对本发明所用的可变区进行人源化，或通过包含所引入的氨基酸序列而进行改变。

在某些实施方式中，通过至少部分置换一个或多个CDR，以及必要时通过部分 框架区置换和序列修饰和/或变化，可改变重链和轻链中的可变区。虽然所述CDR可 以源自与框架区所源自的抗体相同类别或甚至相同亚类的抗体，可以设想所述CDR 源自不同类别的抗体，并且优选源自不同物种的抗体。为了将一个可变域的抗原结合 能力转移到另一个可变域，不需要将全部CDR用来自供体可变区的所有CDR置换。 相反，可以仅需要转移对于维持抗原结合位点活性所必需的那些残基。

虽然对可变区进行了改变，但本领域技术人员应该意识到，本发明的经修饰抗体 会包含下述抗体(例如，全长抗体或其免疫反应性片段)：其中一个或多个恒定区结构 域的至少一部分已经缺失或被改变从而提供所需生化特性，例如当与包含天然或未经 改变恒定区的免疫原性近似相同的抗体相比，肿瘤定位增加或血清半衰期减少。在某 些实施方式中，经修饰抗体的恒定区会包含人类恒定区。与本发明相容的对恒定区的 修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。即，本文所述 的经修饰抗体可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL) 中的一个或多个进行改变或修饰。在某些实施方式中，一个或多个结构域从经修饰抗 体的恒定区部分地或完全地缺失。在某些实施方式中，经修饰抗体会包含其中除去整 个CH2域的域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在某些实施方式中，省略的恒定区 域会被短的氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)替换，所述间隔子提供通常由所缺 少的恒定区赋予的某些分子柔性。

在某些实施方式中，对经修饰抗体进行工程化以将CH3域直接融合到抗体的铰 链区。在其它实施方式中，在铰链区和经修饰CH2和/或CH3域之间插入肽间隔子。 例如，可以表达其中CH2域已经缺失的构建体，且所述构建体中剩余的CH3域(经修 饰或未经修饰)与具有5～20个氨基酸的间隔子的铰链区连接。可以添加此类间隔子， 从而确保恒定域的调节元件保持游离并且可及，或确保铰链区保持柔性。但是，应该 注意在某些情况下，氨基酸间隔子可能据证实具有免疫原性，且会引发不想要的针对 所述构建体的免疫响应。因此，在某些实施方式中，为了维持经修饰抗体的所需生物 学品质，则向构建体添加的任何间隔子是相对非免疫原性的。

在某些实施方式中，经修饰抗体可以仅有部分恒定域缺失，或仅有几个甚至单个 氨基酸的取代。例如，在CH2域的所选区域中单个氨基酸的突变可能足以实质地减 少Fc结合并由此增加癌细胞定位和/或肿瘤穿透。类似地，理想的是可简单地缺失一 个或多个控制待调节的特定效应子功能(例如补体C1q结合)的恒定区结构域的部分。 恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选特性(血清半衰期)，同时使与受试对象恒 定区结构域有关的其它所需功能保持完整。另外，如上所述，可以通过增强所得构建 体性质的一个或多个氨基酸的突变或取代而对所公开抗体的恒定区进行修饰。在这点 上，可以破坏由保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本上保持经修饰抗 体的构造和免疫原性特征。在某些实施方式中，经修饰抗体包括添加到恒定区的一个 或多个氨基酸，从而增强所需特性(诸如降低或提高效应子功能)或提供更多的细胞毒 素或糖类粘附位点。

在本领域内已知，恒定区介导几种效应子功能。例如，补体的C1组分与IgG或 IgM抗体(结合了抗原)的结合会激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用 和裂解中很重要。补体的激活还刺激炎性响应，并且还可能涉及自体免疫超敏性。另 外，抗体的Fc区可以与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。存在许多对不同种类的抗体 具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。 抗体与位于细胞表面上Fc受体的结合触发许多重要且各异的生物学响应，包括抗体 包被颗粒的内吞和破坏、免疫复合物的清除、抗体包被靶细胞被杀伤细胞裂解(称为 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移和免疫球蛋 白产生的控制。

在某些实施方式中，经修饰抗体提供经改变的效应子功能，这进而影响所施用抗 体的生物特征。例如，在某些实施方式中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变 或其它方式)可以减少Fc受体与循环的经修饰抗体的结合，由此增加癌细胞定位和/ 或肿瘤穿透。在其它实施方式中，恒定区的修饰增加抗体的血清半衰期。在其它实施 方式中，恒定区的修饰减少抗体的血清半衰期。在某些实施方式中，对恒定区进行修 饰来消除双硫键或寡糖基团。类似地，使用本领域技术人员已知的公知生化或分子工 程化技术可以容易地进行根据本发明对恒定区的修饰。

在某些实施方式中，作为抗体的VEGF/DLL4结合剂不具有一种或多种效应子功 能。例如，在某些实施方式中，所述抗体没有ADCC活性和/或没有补体依赖性细胞 毒性(CDC)活性。在某些实施方式中，抗体不与Fc受体和/或补体因子结合。在某些 实施方式中，所述抗体不具有效应子功能。

本发明还包括与本文所述的嵌合、人源化和人抗体或其抗体片段基本同源的变体 和等价物。这些变体和等价物可以包含例如保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被 相似的氨基酸所取代。例如，保守性取代是指氨基酸被属于相同一般类别的另一个氨 基酸所取代，例如，一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代、一个碱性氨基酸被另 一个碱性氨基酸取代或一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。保守性氨基酸所应 涵盖的范畴是本领域公知的且已在本文描述。

因此，本发明提供了结合VEGF和/或DLL4的抗体、包括特异性结合VEGF和 DLL4的双特异性抗体的制备方法。在某些实施方式中，结合VEGF和/或DLL4的抗 体的制备方法包括使用杂交瘤技术。在某些实施方式中，结合VEGF或DLL4的抗体 或者结合VEGF和DLL4的双特异性抗体的生产方法包括对人类噬菌体文库进行筛 选。此外，本发明还提供了结合VEGF和/或DLL4的抗体的鉴定方法。在某些实施 方式中，所述抗体通过针对与VEGF或其一部分的结合的FACS筛选来进行鉴定。在 某些实施方式中，所述抗体通过针对与DLL4或其一部分的结合的FACS筛选来进行 鉴定。在某些实施方式中，所述抗体通过针对与VEGF和DLL4或其一部分的结合的 FACS筛选来进行鉴定。在某些实施方式中，所述抗体通过使用针对与VEGF的结合 的ELISA的筛选来进行鉴定。在某些实施方式中，所述抗体通过使用针对与DLL4 的结合的ELISA的筛选来进行鉴定。在某些实施方式中，所述抗体通过使用针对与 VEGF和DLL4的结合的ELISA的筛选来进行鉴定。在某些实施方式中，所述抗体 通过FACS筛选进行鉴定，所述FACS筛选针对对人VEGF与人VEGF受体的结合 的阻断。在某些实施方式中，所述抗体通过FACS筛选进行鉴定，所述FACS筛选针 对对人DLL4与人Notch受体的结合的阻断。在某些实施方式中，所述抗体通过针对 Notch信号传导的抑制或阻断的筛选来进行鉴定。在某些实施方式中，所述抗体通过 针对VEGF活性的抑制或阻断(例如，HUVEC增殖的诱导)的筛选来进行鉴定。在某 些实施方式中，所述抗体通过针对对血管发生的调节的筛选来进行鉴定。

在某些实施方式中，产生人VEGF的抗体的方法包括用包含人VEGF的27位至 232位氨基酸的多肽对哺乳动物进行免疫。在某些实施方式中，产生人VEGF的抗体 的方法包括用包含人VEGF的27位至232位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动 物进行免疫。在某些实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物分离出抗体或抗体 生产性细胞。在某些实施方式中，产生结合VEGF的单克隆抗体的方法包括：用包含 人VEGF的27位至232位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫，并从 经免疫的哺乳动物分离出抗体生产性细胞。在某些实施方式中，所述方法还包括将所 述抗体生产性细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合以形成杂交瘤细胞。在某些实施方式 中，所述方法还包括选出表达了结合VEGF的抗体的杂交瘤细胞。在某些实施方式中， 所述哺乳动物是小鼠。在某些实施方式中，利用包含人VEGF的27位至232位氨基 酸中的至少一部分的多肽来选择抗体。

在某些实施方式中，产生人DLL4的抗体的方法包括用包含人DLL4的27位至 529位氨基酸的多肽对哺乳动物进行免疫。在某些实施方式中，产生人DLL4的抗体 的方法包括用包含人DLL4的27位至529位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动 物进行免疫。在某些实施方式中，产生结合DLL4的单克隆抗体的方法包括：用包含 人DLL4的27位至529位氨基酸中的至少一部分的多肽对哺乳动物进行免疫，并从 经免疫的哺乳动物分离出抗体生产性细胞。在某些实施方式中，所述方法还包括将所 述抗体生产性细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合以形成杂交瘤细胞。在某些实施方式 中，所述方法还包括选出表达了结合DLL4的抗体的杂交瘤细胞。在某些实施方式中， 所述哺乳动物是小鼠。在某些实施方式中，利用包含人DLL4的27位至529位氨基 酸中的至少一部分的多肽来选择抗体。

在某些实施方式中，产生人VEGF的抗体的方法包括针对结合人VEGF的抗体 对抗体表达文库进行筛选。在某些实施方式中，产生人DLL4的抗体的方法包括针对 结合人DLL4的抗体对抗体表达文库进行筛选。产生人VEGF和/或人DLL4的抗体 的方法包括针对结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体对抗体表达文库进行筛选。 在某些实施方式中，所述抗体表达文库是噬菌体文库。在某些实施方式中，所述筛选 包括淘选(panning)。在某些实施方式中，利用人VEGF的27位至232位氨基酸中的 至少一部分来对抗体表达文库(例如，噬菌体文库)进行筛选。在某些实施方式中，在 第一次筛选中鉴定出的抗体再利用人DLL4的27位至529位氨基酸中的至少一部分 进行筛选，以鉴定出结合VEGF和DLL4的双特异性抗体。在某些实施方式中，利用 人DLL4的27位至529位氨基酸中的至少一部分来对抗体表达文库(例如，噬菌体文 库)进行筛选。在某些实施方式中，在第一次筛选中鉴定出的抗体再利用人VEGF的 27位至232位氨基酸中的至少一部分进行筛选，以鉴定出结合VEGF和DLL4的双 特异性抗体。在某些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体是VEGF拮抗剂。在某 些实施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体抑制由VEGF诱导的生物活性。在某些实 施方式中，在所述筛选中鉴定出的抗体是DLL4拮抗剂。在某些实施方式中，在所述 筛选中鉴定出的抗体抑制由DLL4诱导的Notch信号传导。在某些实施方式中，在所 述筛选中鉴定出的抗体与人VEGF和小鼠VEGF结合。在某些实施方式中，在所述 筛选中鉴定出的抗体与人DLL4和小鼠DLL4结合。

在某些实施方式中，本文所述的抗体是分离抗体。在某些实施方式中，本文所述 的抗体是基本纯的抗体。

在本发明的某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是多肽。所述多肽可以是包含 结合VEGF和/或DLL4的抗体的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在本领域中可以 认识到，本文所述的结合剂的某些氨基酸序列可以在不显著影响蛋白的结构或功能的 情况下有所变化。因此，本发明还包括显示出显著的活性或包括针对人VEGF和/或 DLL4的抗体或其片段的多肽的变化形式。VEGF/DLL4结合性多肽的氨基酸序列变 化形式包括缺失、插入、反转、重复和/或其它类型的取代。

在某些实施方式中，本文所述的多肽是分离多肽。在某些实施方式中，本文所述 的多肽是基本纯的多肽。

多肽及其类似物和变体可以得到进一步修饰，以包含并非通常作为该多肽的一部 分的额外化学部分。衍生化的部分能提高或者调节多肽的溶解性、生物半衰期和/或 吸附。所述部分还可以减少或消除多肽和变体的不为所需的副作用。关于化学部分的 综述可以见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005, University of the Sciences,Philadelphia,PA。

本文所述的多肽可以通过本领域已知的任何合适方法来制备。这类方法的范围从 直接蛋白合成方法到构建编码多肽序列的DNA序列并将这些序列在合适的宿主中表 达。在某些实施方式中，利用重组技术通过分离或合成编码所关注野生型蛋白的DNA 序列来构建DNA序列。可选地，可以通过定点诱变来使序列进行诱变以提供其功能 类似物。参见例如，Zoeller等，1984,PNAS,81:5662-5066和美国专利4,588,585号。

在某些实施方式中，编码所关注多肽的DNA序列可以利用寡核苷酸合成仪通过 化学合成来构建。寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列来设计，并且可以选择那 些在将产生所关注的重组多肽的宿主细胞中优选的密码子。可以应用标准方法来合成 编码分离的所关注多肽的多核苷酸序列。利润，可以使用完全氨基酸序列来构建回译 (back-translated)的基因。此外，可以合成含有编码特定的分离多肽的核苷酸序列的 DNA寡聚体。利润，可以合成编码所需多肽的各部分的几个小寡核苷酸，然后将其 连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补组装的5’或3’突出末端(overhang)。

一旦组装后(通过合成、定点诱变或其它方法)，可以将编码特定的所关注多肽的 多核苷酸序列插入表达载体，并将其可操作性连接至适于将蛋白表达在所需宿主中的 表达控制序列。正确组装可以通过核苷酸测序、限制酶作图(restriction enzyme mapping) 和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽来确认。如本领域所公知，为了在宿主中获 得高表达水平的转染基因，该基因必须可操作性连接至在选定的表达宿主中具有功能 的转录和翻译表达控制序列。

在某些实施方式中，使用重组表达载体来扩增和表达编码针对人VEGF和/或 DLL4的抗体或其片段的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制DNA构建体，该 DNA构建体具有编码VEGF/DLL4结合剂(例如，抗VEGF抗体或抗DLL4抗体)或其 片段的多肽链的合成的或cDNA源的DNA片段，所述合成的或cDNA源的DNA片 段可操作性连接至合适的源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的转录和/或翻译 调节元件。转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中具有调节作用的 遗传元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构性 或编码序列，和(3)合适的转录和翻译启动和终止序列。调节元件可以包括用于控制 转录的操作子序列。在宿主中复制的能力通常由复制原点赋予，并且可以另外引入便 于识别转化体的选择基因。当DNA区域相互功能上相关时，它们是“可操作性地连 接”的。例如，如果信号肽(分泌前导)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则信号 肽(分泌前导)的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制编码序列的转录， 则启动子与该序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点经定位而允许翻译，则核糖 体结合位点与编码序列可操作地连接。在某些实施方式中，旨在在酵母菌表达系统中 使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译蛋白分泌到胞外的前导序列。在其他实施 方式中，在表达不具有前导序列或转运序列的重组蛋白的情形中，其可以包括N端 甲硫氨酸残基。可选地，可以随后从表达的重组蛋白中切割下该残基以提供最终产物。

表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用各种表达宿主/载 体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头状瘤病 毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括 已知的细菌质粒，例如包括pCR1、pBR322、pMB9和它们的衍生物在内的来自大肠 杆菌的质粒，以及诸如M13和其它丝状单链DNA噬菌体等更广宿主范围的质粒。

本发明的VEGF/DLL4结合剂可以从一个或多个载体表达。例如，在某些实施方 式中，一条重链多肽由一个载体表达，而第二重链多肽由第二载体表达，且轻链多肽 由第三载体表达。在某些实施方式中，第一重链多肽和轻链多肽由一个载体表达，而 第二重链多肽由第二载体表达。在某些实施方式中，两条重链多肽由一个载体表达， 而轻链多肽由第二载体表达。在某些实施方式中，三条多肽由一个载体表达。因此， 在某些实施方式中，第一重链多肽、第二重链多肽和轻链多肽由单一载体表达。

用于表达VEGF/DLL4结合多肽或抗体(或用作抗原的VEGF或DLL4蛋白)的合 适的宿主细胞包括处于适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。 原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高级真 核细胞包括如下文所述的哺乳动物来源的已建立细胞系。还可以使用无细胞翻译系 统。Pouwels等，1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,NY 中描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。 关于蛋白制备(包括抗体制备)的方法的额外信息可以见于例如美国专利公开 2008/0187954号、美国专利6,413,746号、6,660,501号和国际专利公开WO04/009823 号。

还可以使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组多肽。可能理想的是， 可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白的表达，因为所述蛋白通常被正确折叠、经过合 适的修饰且具有生物学功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7 (源自猴肾)、L-929(源自鼠类成纤维细胞)、C127(源自鼠类乳房肿瘤)、3T3(源自鼠 类成纤维细胞)、CHO(源自中国仓鼠)、HeLa(源自人子宫颈癌)、BHK(源自仓鼠肾 成纤维细胞)、HEK-293(源自人胚肾)细胞系和这些细胞系的变体，和能够表达合适 载体的其它细胞系。哺乳动物表达载体可以包含与待表达基因连接的诸如复制原点、 合适的启动子和增强子等非转录元件和其它5'或3'侧翼非转录序列，以及诸如必需的 核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列等5'或 3'非翻译序列。重组蛋白在杆状病毒中的表达也提供了一种用于制备正确折叠和生物 功能性的蛋白的稳健方法。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白的杆状病毒系统是本领 域技术人员所公知(参见例如，Luckow and Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。

因此，本发明提供了包含本文所述的VEGF/DLL4结合剂的细胞。在某些实施方 式中，所述细胞产生本文所述的VEGF/DLL4结合剂。在某些实施方式中，所述细胞 产生抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生VEGF结合剂，例如抗VEGF抗体。 在某些实施方式中，所述细胞产生结合VEGF的双特异性抗体。在某些实施方式中， 所述细胞产生DLL4结合剂，例如抗DLL4抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生 结合DLL4的双特异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生双特异性VEGF/DLL4 结合剂，例如结合VEGF和DLL4的双特异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产 生抗体219R45。在某些实施方式中，所述细胞产生抗体21R79。在某些实施方式中， 所述细胞产生抗体21R75。在某些实施方式中，所述细胞产生抗体21R83。在某些实 施方式中，所述细胞产生包含来自抗体219R45的抗原结合位点的双特异性抗体。在 某些实施方式中，所述细胞产生包含来自抗体21R79的抗原结合位点的双特异性抗 体。在某些实施方式中，所述细胞产生包含来自抗体21R75的抗原结合位点的双特 异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生包含来自抗体21R83的抗原结合位点 的双特异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生包含来自抗体219R45的抗原结 合位点和来自抗体21R79的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，所 述细胞产生包含来自抗体219R45的抗原结合位点和来自抗体21M18的抗原结合位点 的双特异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生包含来自抗体219R45的抗原结 合位点和来自抗体21R75的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，所 述细胞产生包含来自抗体219R45的抗原结合位点和来自抗体21R83的抗原结合位点 的双特异性抗体。在某些实施方式中，所述细胞产生双特异性抗体 219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，所述细胞产生双特异性抗体 219R45-MB-21R79。在某些实施方式中，所述细胞产生双特异性抗体 219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，所述细胞产生双特异性抗体 219R45-MB-21R83。

由转化宿主产生的蛋白可以根据任何合适的方法来纯化。标准方法包括色谱(例 如，离子交换色谱、亲和色谱和尺寸柱色谱)、离心、差化溶解性或通过任何其它的 蛋白纯化用标准技术。可以将亲和标签(如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病 毒衣壳序列和谷胱甘肽S转移酶)连接至蛋白，以使能够通过行经适当的亲和柱来容 易地纯化。用于纯化免疫球蛋白的亲和色谱可以包括蛋白A、蛋白G和蛋白L色谱。 分离的蛋白可以利用如蛋白水解、尺寸排阻色谱(SEC)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)、 等电聚焦(IEF)、高效液相色谱(HPLC)和X射线晶体学等技术进行物理表征。分离蛋 白的纯度可以利用本领域技术人员已知的技术来确定，所述技术包括但不限于 SDS-PAGE、SEC、毛细管凝胶电泳、IEF和毛细管等电聚焦(cIEF)。

在某些实施方式中，可以首先使用商购的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或 Millipore Pellicon超滤单元)对来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液进行 浓缩。浓缩步骤后，将浓缩物施加到合适的纯化基质。在某些实施方式中，可以使用 阴离子交换树脂，例如具有垂挂式二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。所述 基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它种类。在某 些实施方式中，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换物包括各种含有磺丙基 或羧甲基的不溶性基质。在某些实施方式中，可以采用羟基磷灰石介质，包括但不限 于陶瓷羟基磷灰石(CHT)。在某些实施方式中，可以使用一种或多种采用疏水性 RP-HPLC介质(例如，具有垂挂式甲基或其它脂肪族基团的硅胶)的反相HPLC步骤来 进一步纯化重组蛋白(例如，VEGF/DLL4结合剂)。还可以以各种组合使用上述纯化 步骤中的一些或全部，从而提供均一性的重组蛋白。

在某些实施方式中，根据本文所述的任何方法来纯化如双特异性抗体等异源二聚 体蛋白。在某些实施方式中，利用至少一个色谱步骤来分离和/或纯化抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体。在某些实施方式中，所述至少一个色谱步骤包括亲和色谱。在 某些实施方式中，所述至少一个色谱步骤还包括阴离子交换色谱。在某些实施方式中， 分离和/或纯化的抗体产物包含至少90％的异源二聚体抗体。在某些实施方式中，分 离和/或纯化的抗体产物包含至少95％、96％、97％、98％或99％的异源二聚体抗体。 在某些实施方式中，分离和/或纯化的抗体产物包含约100％的异源二聚体抗体。

在某些实施方式中，细菌培养物中产生的重组蛋白可以例如通过起始提取从细胞 团块中分离，然后进行一步或多步浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。 对于最终纯化步骤可以使用HPLC。可以通过任何常规方法破坏重组蛋白表达中所用 的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或是使用细胞裂解剂。

本领域已知的用于纯化抗体和其它蛋白的方法还包括例如美国专利申请 2008/0312425号、2008/0177048号和2009/0187005号中所述的那些。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是不作为抗体的多肽。本领域已知有多 种用于鉴定和制备以高亲和力与蛋白靶标结合的非抗体多肽的方法。参见例如，Skerra, 2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等，2006,Protein Science,15:14-27； Gill等，2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76； 和Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在某些实施方式中，可以使用噬菌体或哺乳动 物细胞展示技术来制备和/或鉴定不是抗体的VEGF/DLL4多肽。在某些实施方式中， 多肽包含选自由蛋白A、蛋白G、脂钙蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构 域和硫氧还蛋白组成的组的类型的蛋白支架。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂或抗体可以以许多缀合形式(即免疫缀合 物或放射缀合物)或非缀合形式中的任意一种使用。在某些实施方式中，所述抗体可 以以非缀合形式使用，以束缚受试对象的包括补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞 毒性在内的天然防御机制，从而消除恶性细胞或癌细胞。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体或多肽)与细胞毒性剂缀合。 在某些实施方式中，细胞毒性剂是化学治疗剂，其包括但不限于氨甲蝶呤、阿霉素、 多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺红菌素或其它嵌入剂。在某些实 施方式中，细胞毒性剂是源自细菌、真菌、植物或动物的酶促活性毒素或其片段，其 包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A 链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii) 蛋白、石竹素蛋白、美国商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia) 抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、 有丝分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和新月毒素。在某些实施 方式中，细胞毒性剂是产生放射性缀合物或放射缀合抗体的放射性同位素。可以利用 各种放射核素来制备放射性缀合抗体，所述放射核素包括但不限于⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、 ¹²³I、¹¹¹In、¹³¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和²¹²Bi。 也可以使用抗体与一种或多种小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素例如加利车霉 素、美登醇、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍 生物。抗体与细胞毒性剂的缀合物可以利用多种双功能性蛋白偶联剂来制备，所述双 功能性蛋白偶联剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚 氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二甲基己二亚氨酯HCl)、活性酯(例如 二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮苯甲酰)己二 胺)、双重氮基衍生物(例如双(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚甲苯2,6- 二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

III.多核苷酸

在某些实施方式中，本发明包括编码特异性结合VEGF和/或DLL4的多肽(或多 肽片段)的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了仅包括该多肽的编码序列 的多核苷酸以及包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。例如，在某些实施方 式中，本发明提供了包含编码人VEGF的抗体或编码此类抗体的片段(例如，包含抗 原结合位点的片段)的多核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方式中，本发明提供了 包含编码人DLL4的抗体或编码此类抗体的片段(例如，包含抗原结合位点的片段)的 多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以处于RNA的形式或DNA的形式。 DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，且若为单 链，则可以是编码链或非编码(反义)链。

在某些实施方式中，所述多核苷酸包括编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽包含 选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID  NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、 SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。在某些实施方式中，所述多核苷 酸包括编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：SEQ  ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID  NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID  NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64。在某些实施方式中，所 述多核苷酸包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:29、SEQ ID  NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID  NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID  NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID  NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID  NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID  NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID  NO:77和SEQ ID NO:78。

在某些实施方式中，所述多核苷酸包含具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核 苷酸序列与包含选自由以下序列组成的组的的序列的多核苷酸具有至少约80％同一 性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、且在某些实施方 式中至少约96％、97％、98％或99％同一性：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID  NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:52、SEQ ID  NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID  NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID  NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID  NO:77和SEQ ID NO:78。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含具有下述核苷酸序 列的多核苷酸，所述核苷酸序列与包含选自由以下序列组成的组的序列的多核苷酸具 有至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、 且在某些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％同一性：SEQ ID NO:35、SEQ ID  NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID  NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID  NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID  NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。此外，还提供了包含与以 下序列杂交的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID  NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID  NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID  NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID  NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID  NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID  NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID  NO:78。在某些实施方式中，杂交在高度严谨条件下进行。

在某些实施方式中，核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在相同的阅读 框中与辅助例如多肽(例如，充当控制多肽从细胞的转运的分泌序列的前导序列)从宿 主细胞的表达和分泌的多核苷酸融合。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并 可以由宿主细胞将该前导序列切割下以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码蛋 白原(proprotein)，其为成熟蛋白外加额外的5’氨基酸残基。具有前序列(prosequence) 的成熟蛋白是蛋白原，且是蛋白的非活化形式。一旦前序列被切割，则留下活性成熟 蛋白。

在某些实施方式中，多核苷酸包含与标记物序列在相同阅读框内融合的成熟多肽 用编码序列，所述标记物序列允许例如对所编码的多肽进行纯化。例如，所述标记物 序列可以是pQE-9载体提供的六聚组氨酸标签，从而在细菌宿主的情况下提供对与 所述标记物融合的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时， 所述标记物序列可以是源自流感病毒血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。在某些实施方式 中，所述标记物序列是FLAG标签，其为可以与其他亲和标签联合使用的肽序列 DYKDDDDK(SEQ ID NO:45)。

本发明还涉及上文所述的编码例如片例如片段、类似物和/或衍生物的多核苷酸 的变体。

在某些实施方式中，本发明提供了具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷 酸序列与编码包含本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的多肽或其片段的多 核苷酸具有至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％ 同一性且在某些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％同一性。

如本文所用，短语“具有至少例如95％的与参照核苷酸序列的‘同一性’的的核苷 酸序列的多核苷酸”的含义在于，所述多核苷酸的核苷酸序列与所述参照序列相同， 不同之处是，对于所述参照核苷酸序列的每100个核苷酸，所述多核苷酸序列可以包 含至多5个点突变。换言之，为了获得包含与参照核苷酸序列具有至少95％同一性的 核苷酸序列的多核苷酸，可以使参照序列中的至多5％的核苷酸缺失或以另一个核苷 酸取代，或者在参照序列中插入至多占参照序列中核苷酸的5％的多个核苷酸。参照 序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或者这些末端位置之 间的任何位置，其单独间插在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个连续组处于 所述参照序列内。

多核苷酸变体可以包含在编码区和/或非编码区的变化。在某些实施方式中，多 核苷酸变体包含会产生沉默取代、添加或缺失但不会改变所编码多肽的性质或活性的 变化。在某些实施方式中，多核苷酸变体包含不会导致多肽的氨基酸序列变化的沉默 取代(由于遗传密码简并性)。可以出于各种原因制备多核苷酸变体，例如，为了针对 特定宿主优化密码子表达(即，将人类mRNA中的密码子改为如大肠杆菌等细菌宿主 所优选的那些密码子)。在某些实施方式中，多核苷酸变体包含在序列的非编码区或 编码区中的至少一个沉默突变。

在某些实施方式中，多核苷酸变体被制备用以调节或改变所编码多肽的表达(或 表达水平)。在某些实施方式中，多核苷酸变体被制备用以增加所编码多肽的表达。 在某些实施方式中，多核苷酸变体被制备用以减少所编码多肽的表达。在某些实施方 式中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的所编码多肽的表达。在某 些实施方式中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有减少的所编码多肽的表 达。

在某些实施方式中，制备了至少一种多核苷酸变体(在不改变所编码多肽的氨基 酸序列的情况下)以增加异源多聚体分子的产生。在某些实施方式中，制备了至少一 种多核苷酸变体(在不改变所编码多肽的氨基酸序列的情况下)以增加双特异性抗体 的产生。

在某些实施方式中，多核苷酸是分离的。在某些实施方式中，多核苷酸是基本纯 的。

此外，还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。在某些实施方式中，表 达载体包含多核苷酸分子。在某些实施方式中，宿主细胞包含表达载体，该表达载体 包含多核苷酸分子。在某些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸分子。

IV.使用方法和药物组合物

本发明的结合(例如，特异性结合)VEGF和/或DLL4的结合剂(包括多肽和抗体) 可用于各种应用，包括但不限于愈疗性治疗方法，如癌治疗。在某些实施方式中，所 述试剂可用于抑制VEGF活性、抑制DLL4诱导的Notch信号传导、抑制肿瘤生长、 减小肿瘤体积、减少肿瘤中癌干细胞的频率、减少肿瘤的致瘤性、调节血管发生和/ 或抑制血管发生。使用方法可以是体外、离体或体内的。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是人VEGF拮抗剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是 人DLL4拮抗剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是VEGF和DLL4两者的 拮抗剂。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂用于治疗与血管发生相关的疾病，即增 加的血管发生和/或畸变血管发生。在某些实施方式中，所述疾病是依赖于血管发生 的疾病。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂用于治疗其特征在于干细胞和/或祖 细胞水平增加的病症。

本发明提供了使用本文所述的VEGF/DLL4结合剂或抗体抑制肿瘤生长的方法。 在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤细胞与VEGF/DLL4结合剂(例 如，抗体)在体外接触。例如，在添加了抗VEGF抗体、抗DLL4抗体或抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体的培养基中培养永生化细胞系或癌细胞系，以抑制肿瘤细胞生 长。在某些实施方式中，从患者样品(例如，组织活检切片、胸腔积液或血液样品)分 离出肿瘤细胞并在添加有VEGF/DLL4结合剂的培养基中培养，以抑制肿瘤细胞生长。

在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与VEGF/DLL4 结合剂(例如，抗体)在体内接触。在某些实施方式中，使肿瘤或肿瘤细胞与VEGF/DLL4 结合剂接触的步骤在动物模型中进行。例如，可以向具有肿瘤异体移植物的免疫妥协 的宿主动物(例如，NOD/SCID小鼠)施用抗VEGF抗体、抗DLL4抗体或抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体。在某些实施方式中，可以从患者样品(例如，组织活检切片、 胸腔积液或血液样品)分离出肿瘤细胞和/或癌细胞从并注射至免疫妥协的宿主动物 (例如，NOD/SCID小鼠)，然后对该宿主动物施用VEGF/DLL4结合剂以抑制肿瘤细 胞生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂在向动物引入致瘤性细胞的同时或 稍后施用，以预防肿瘤生长(“预防性模型”)。在某些实施方式中，在肿瘤已生长至指 定尺寸后，施用作为治疗剂的VEGF/DLL4结合剂(“治疗性模型”)。在某些实施方式 中，VEGF/DLL4结合剂是特异性结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体。

在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括对受试对象施用治疗有效量的 VEGF/DLL4结合剂。在某些实施方式中，所述受试对象是人。在某些实施方式中， 所述受试对象有肿瘤或曾患有已被移除的肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包含癌 干细胞。在某些实施方式中，所述肿瘤中癌干细胞的频率通过施用VEGF/DLL4结合 剂而被减少。本发明还提供了减少肿瘤中癌干细胞频率的方法，其包括使肿瘤与治疗 有效量的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体)接触。在某些 实施方式中，减少受试对象的肿瘤中癌干细胞频率的方法包括对该受试对象施用治疗 有效量的VEGF/DLL4结合剂。

在某些实施方式中，肿瘤是实体瘤。在某些实施方式中，肿瘤是选自由以下组成 的组的肿瘤：结直肠肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺 肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶 质细胞瘤和头颈部肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是结直肠肿瘤或结肠肿瘤。在 某些实施方式中，所述肿瘤是卵巢肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是肺肿瘤。在 某些实施方式中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是乳腺肿瘤。

本发明还提供了治疗癌的方法，其包括对受试对象施用治疗有效量的 VEGF/DLL4结合剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与VEGF结合，并抑 制或减少癌的生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与DLL4结合，并抑制 或减少癌的生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是结合VEGF和DLL4的 双特异性抗体，并抑制或减少癌的生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与 VEGF结合，干扰VEGF/VEGF受体的相互作用，并抑制或减少癌的生长。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂与DLL4结合，干扰DLL4/Notch的相互作用，并抑 制或减少癌的生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与VEGF和DLL4结合， 干扰VEGF/VEGF受体的相互作用且干扰DLL4/Notch的相互作用，并抑制或减少癌 的生长。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与DLL4结合，并减少癌中癌干细 胞的频率。

本发明提供了治疗癌的方法，其包括向受试对象(例如，需要治疗的受试对象)施 用治疗有效量的VEGF/DLL4结合剂。在某些实施方式中，所述受试对象是人。在某 些实施方式中，所述受试对象具有癌性肿瘤。在某些实施方式中，所述受试对象已将 肿瘤移除。

在某些实施方式中，所述受试对象的癌/肿瘤可能对于某些治疗具有不应性 (refractory)。作为非限制性实例，所述受试对象的癌(或肿瘤)可能具有化学不应性。 在某些实施方式中，所述受试对象的癌可能对抗VEGF治疗和/或抗DLL4治疗具有 耐受性。

在某些实施方式中，癌是选自由以下组成的组的癌：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、 卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑色素瘤、宫颈癌、膀胱癌、 成胶质细胞瘤和头颈癌。在某些实施方式中，所述癌是卵巢癌。在某些实施方式中， 所述癌是结直肠癌或结肠癌。在某些实施方式中，所述癌是胰腺癌。在某些实施方式 中，所述癌是乳腺癌。在某些实施方式中，所述癌是前列腺癌。在某些实施方式中， 所述癌是肺癌。在某些实施方式中，所述癌是血液癌，如白血病或淋巴瘤。在某些实 施方式中，所述白血病或淋巴瘤是B细胞白血病或淋巴瘤。在某些实施方式中，所 述白血病或淋巴瘤是T细胞白血病或淋巴瘤。在某些实施方式中，所述血液癌是急性 髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴性白血病、毛细胞白血病、 慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤或T细胞急性淋巴性白血病。

本发明还提供了治疗受试对象中的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症与血 管发生相关。在某些实施方式中，所述疾病或病症与畸变血管发生相关。在某些实施 方式中，所述疾病或病症与血管发生的增加相关。因此，本发明提供了调节受试对象 中血管发生的方法，其包括对所述受试对象施用治疗有效量的本文所述的任何 VEGF/DLL4结合剂。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是结合人VEGF的抗 体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是结合人DLL4的抗体。在某些实施方 式中，VEGF/DLL4结合剂是结合人VEGF的双特异性抗体。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是结合人DLL4的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂是结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体。

还提供了治疗受试对象中的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于 干细胞和/或祖细胞的水平的增加。在某些实施方式中，所述治疗方法包括对受试对 象施用治疗有效量的VEGF/DLL4结合剂、多肽或抗体。

在本文所述的任何方法的某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是特异性结合人 VEGF和人DLL4的双特异性抗体。在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结 合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所 述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含 DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID  NO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、 YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第二抗原结合位 点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。在某些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合 位点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含： 包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID  NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所 述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性 结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH (SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链 CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所述第二抗原结 合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含 YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其中所述第一和第二抗原结合位点均包含：包含 RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID  NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某 些实施方式中，双特异性抗体包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性 结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH (SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链 CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且第二抗原结合位 点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链 CDR3；且其中所述第一和第二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在某些实施方式中，双特异性抗体 包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人DLL4的第二抗原结合 位点，其中所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、 包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；且所述第二抗原结合位点包含： 包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3；且其 中所述第一和第二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20) 的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

在本文所述的任何方法的某些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：与 SEQ ID NO:11具有至少约80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少约80％序列同一性的第二重链 可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的第一和第二轻链可变区。 在某些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：与SEQ ID NO:11具有至少约 80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:9具有至少约80％序列同一性的第 二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的第一和第二轻链 可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：与SEQ ID NO:11具 有至少约80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:10具有至少约80％序列 同一性的第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的第一 和第二轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含：与SEQ ID  NO:11具有至少约80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:58具有至少约 80％序列同一性的第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一 性的第一和第二轻链可变区。在某些实施方式中，VEGF/DLL4双特异性抗体包含： 与SEQ ID NO:11具有至少约80％序列同一性的第一重链可变区，与SEQ ID NO:64 具有至少约80％序列同一性的第二重链可变区，以及与SEQ ID NO:12具有至少约 80％序列同一性的第一和第二轻链可变区。

在本文所述的任意方法的某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗体。在某些 实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗VEGF抗体。在某些实施方式中，所述抗VEGF 抗体是抗体219R45。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是抗DLL4抗体。在某 些实施方式中，所述抗DLL4抗体是抗体21R79。在某些实施方式中，所述抗DLL4 抗体是抗体21R75。在某些实施方式中，所述抗DLL4抗体是抗体21R83。在某些实 施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体219R45的抗原结合位点的双特异性 抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体21R79的抗原结合位 点的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体21R75 的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来 自抗体21R83的抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结 合剂是包含来自抗体219R45的第一抗原结合位点和来自抗体21R79的第二抗原结合 位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体 219R45的第一抗原结合位点和来自抗体21M18的第二抗原结合位点的双特异性抗 体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体219R45的第一抗原结 合位点和来自抗体21R75的第二抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中， VEGF/DLL4结合剂是包含来自抗体219R45的第一抗原结合位点和来自抗体21R83 的第二抗原结合位点的双特异性抗体。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双 特异性抗体219R45-MB-21M18。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性 抗体219R45-MB-21R79。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体 219R45-MB-21R75。在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂是双特异性抗体 219R45-MB-21R83.

本发明还提供了包含本文所述的结合剂的药物组合物。在某些实施方式中，所述 药物组合物还包含药物可接受载具。这些药物组合物可应用于抑制肿瘤生长和/或治 疗受试对象(例如，人类受试对象)的癌等方面。

在某些实施方式中，本发明提供了包含双特异性抗体的药物组合物，其中所述组 合物中至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％的抗体是双特异性抗体 或异源二聚体抗体。在某些实施方式中，所述双特异性抗体是IgG(例如，IgG2或IgG1) 抗体。在某些实施方式中，所述组合物中的总抗体的少于约10％、少于约5％、少于 约2％或少于约1％是单特异性抗体或同二聚体抗体。在某些实施方式中，所述组合 物中的抗体的至少约98％是异源二聚体。

在某些实施方式中，通过将本发明的纯化的抗体或试剂与药物可接受的载具(例 如载剂、赋形剂等)组合，制备用于贮存和使用的制剂。合适的药学上可接受的载剂 包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等无毒缓冲剂；诸如氯化钠等盐； 包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵等防腐 剂；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；诸如尼泊金甲酯或尼泊 金丙酯等尼泊金烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；低分子量 多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白； 诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、 精氨酸或赖氨酸等氨基酸；诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精等糖类；诸如 EDTA等螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等糖；诸如钠等成盐对离子 (counter-ion)；诸如Zn-蛋白复合物等金属复合物；和/或诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG) 等非离子表面活性剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，2005, University of the Sciences,Philadelphia,PA)。

可以以用于局部治疗或系统性治疗的任何方式施用本发明的药物组合物。施用可 以是通过表皮或透皮贴剂、膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉 末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气溶胶(包括通过喷雾器)等肺部施用、气管内、 鼻内施用；口服；包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内或肌肉内(例如，注 射或输注)的胃肠外施用；或颅内施用(例如，脑膜内或脑室内)。

治疗制剂可以是单位剂量形式。所述制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗 粒剂、水中或非水性介质中的溶液或悬浮液、或栓剂。在诸如片剂等固体组合物中主 要活性成分与药物载剂混合。常规的制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、 滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它稀释剂(例如水)。这些可以用于形 成含有本发明化合物或其无毒性药物可接受盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。然 后所述固体预制剂组合物再被分成上述种类的单位剂型。可以对制剂或组合物的片 剂、丸剂等进行包衣或配制，从而提供具有延长作用优点的剂型。例如，所述片剂或 丸剂可以包括被外部组分覆盖的内部组合物。另外，两种组分可以通过肠溶层分隔， 所述肠溶层起到抵抗崩解并且允许内部组分完整地通过胃或延迟释放的作用。对于所 述肠溶层或包衣可以使用各种材料，所述材料包括许多聚合酸以及聚合酸与虫漆、十 六烷醇和乙酸纤维素等材料的混合物。

还可以将本文所述的VEGF/DLL4结合剂或抗体包埋在微胶囊中。如Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版，2005,University of the Sciences in  Philadelphia,PA中所述，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、 纳米颗粒和纳米胶囊)中或在大乳液(macroemulsion)中分别例如通过凝聚技术或通过 界面聚合来制备所述微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯) 微胶囊。

在某些实施方式中，药物制剂包括与脂质体复合的本发明的VEGF/DLL4结合剂 (例如，抗体)。脂质体的制备方法是本领域技术人员所已知的。例如，可以利用脂质 组合物通过反相蒸发生产某些脂质体，所述脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和 PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。可以将脂质体通过规定孔径的过滤器挤出，从 而产生具有所需直径的脂质体。

在某些实施方式中，可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有 VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中所述基质 是成型物的形式(例如膜或微胶囊)。缓释基质的额外实例包括：聚酯、诸如聚(2-羟乙 基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)等水凝胶、聚交酯、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酰胺的 共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸乙醇酸共聚 物以及乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)等可降解乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸异丁 酸酯和聚-D(-)-3-羟基丁酸。

在某些实施方式中，除了施用VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)以外，所述方法 或治疗还包括施用至少一种额外的治疗剂。额外治疗剂可以在施用VEGF/DLL4结合 剂之前、与其同时和/或在其之后施用。还提供了包含VEGF/DLL4结合剂和所述额外 治疗剂的药物组合物。在某些实施方式中，所述至少一种额外的治疗剂包括1、2或 3种以上的额外治疗剂。

采用至少两种治疗剂的组合治疗通常采用以不同作用机制起效的试剂，但这并非 必须的。利用具有不同作用机制的试剂的组合治疗可能产生加合性或协同性效应。组 合治疗可能允许采用比单一治疗中所用更低剂量的每种试剂，由此降低毒副作用和/ 或提高所述试剂中至少一种的治疗指数。组合治疗可能减低会发展出耐药性癌细胞的 可能性。在某些实施方式中，组合治疗包括主要影响(例如，抑制或杀死)非致瘤性细 胞的治疗剂和主要影响(例如，抑制或杀死)致瘤性CSC的治疗剂。

有用的治疗剂类型包括例如：抗微管蛋白剂、奥瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结 合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如，铂络合物，如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核 铂络合物以及卡铂),蒽环类化合物、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化学治疗敏化剂、 倍癌霉素(duocarmycin)、足叶乙甙、氟化嘧啶、离子载体、莱西妥辛(lexitropsin)、亚 硝基脲、顺氯氨铂、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射敏化剂、类固醇、紫衫烷、拓扑 异构酶抑制剂或长春花生物碱等。在某些实施方式中，第二治疗剂是烷基化剂、抗代 谢药、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管发生抑制剂。在某些实施方式中，第 二治疗剂是铂络合物，例如卡铂或顺铂。在某些实施方式中，所述额外治疗剂是与紫 衫烷组合的铂络合物。

可以与VEGF/DLL4结合剂组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在某些实 施方式中，所述方法或治疗涉及将本发明的抗VEGF结合剂或抗体与化学治疗剂或多 种不同化学治疗剂的鸡尾酒混合物组合施用。在某些实施方式中，所述方法或治疗涉 及将本发明的抗DLL4结合剂或抗体与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒 混合物组合施用。在某些实施方式中，所述方法或治疗涉及将本发明的与VEGF和 DLL4结合的双特异性抗体与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒混合物组合 施用。

可用在本发明中的化学治疗剂包括但不限于：诸如噻替派和环磷酰胺 (CYTOXAN)等烷基化剂；诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡等烷基磺酸酯；诸如苯 佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)等氮丙啶； 包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基 硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamime)氮芥 在内的乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，所述三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamime)氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代环磷酰胺、雌氮芥、异环 磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、 曲磷胺、尿嘧啶氮芥；诸如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司 汀、尼莫司汀、雷莫司汀等硝基脲；诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素 (authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星(carabicin)、 洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺红菌素、地托比星 (detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、 麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤 霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他 丁、佐柔比星等抗生素；诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗代谢药；诸如二甲叶 酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪 嘌呤、硫鸟嘌呤等嘌呤类似物；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿 糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；诸如 卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯等雄激素；诸如氨鲁米特、米 托坦、曲洛司坦等抗肾上腺药；诸如亚叶酸(frolinic acid)等叶酸补充剂；醋葡醛内酯； 醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百托布(bestrabucil)；比山群；依达曲沙、得 福安(defofamine)；脱羧秋水仙碱；地吖醌；艾福敏(elformithine)；依利醋铵(elliptinium  acetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌； 莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙 卡巴肼；PSK；雷佐生；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌； 2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫 矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇 (TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤； 诸如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；足叶乙甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉 素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；异长春花碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷； 道诺霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐；CPT l1；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基 鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨(XELODA)；和上述任何一种的药 物可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的 抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如，三苯氧胺、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑 制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬盐酸盐(keoxifene)、LY l17018、 奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；以及抗雄激素剂，如氟他米特、尼鲁米特、比卡 鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。在某 些实施方式中，所述第二治疗剂是顺铂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是卡铂。 在某些实施方式中，所述第二治疗剂是紫衫醇。

在特定实施方式中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是 干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括， 但不限于，盐酸多柔比星，道诺红菌素柠檬酸盐、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、足叶 乙甙、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康，以及这些中任何一种的药物可 接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是伊立替康。

在某些实施方式中，所述化学治疗剂是抗代谢药。抗代谢药是具有以下结构的化 学药品，所述结构与正常生化反应所需的代谢物类似，但是不同之处足够干扰细胞的 一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括，但不限于，吉西他滨、氟尿嘧 啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉 伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6-巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、 氟达拉滨磷酸盐和克拉屈滨，以及这些中任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。 在某些实施方式中，所述第二治疗剂是吉西他滨。

在某些实施方式中，所述化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于与微管蛋白 结合的试剂。在某些实施方式中，所述试剂是紫衫烷。在某些实施方式中，所述试剂 是紫杉醇或多西他赛或者紫杉醇或多西他赛的药物可接受盐、酸或衍生物。在某些实 施方式中，所述试剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合紫杉醇 (ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代性实施方式中，所述抗有丝 分裂剂包括长春花生物碱，例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或者它 们的药物可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋 白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶(如Aurora A或Plk1)的抑制剂。在某些实施方式中， 当与VEGF/DLL4结合剂组合施用的化学治疗剂是抗有丝分裂剂时，被治疗的癌或肿 瘤是乳腺癌或乳腺瘤。

在某些实施方式中，第二治疗剂可以包含如小分子等试剂。例如，治疗可以涉及 将本发明的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与充当针对另外的肿瘤相关蛋白(包括但 不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF)的抑制剂的小分子组合施用。在某些实施 方式中，所述第二治疗剂是抑制癌干细胞途径的小分子。在某些实施方式中，所述第 二治疗剂是抑制Notch途径的小分子抑制剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是 Wnt途径的小分子抑制剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是BMP途径的小分 子抑制剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是抑制β-钙联蛋白信号传导的小分子。

在某些实施方式中，第二治疗剂包含生物分子，如抗体。例如，治疗可能涉及本 发明的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与针对另外的肿瘤相关蛋白的其它抗体(包括 但不限于结合EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF的抗体)的组合施用。在某些实施方 式中，所述第二治疗剂是作为抗癌干细胞标记物抗体的抗体。在某些实施方式中，所 述第二治疗剂是结合Notch途径的组分的抗体。在某些实施方式中，所述第二治疗剂 是结合Wnt途径的组分的抗体。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是抑制癌干细 胞途径的抗体。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是Notch途径的抗体抑制剂。在 某些实施方式中，所述第二治疗剂是Wnt途径的抗体抑制剂。在某些实施方式中， 所述第二治疗剂是BMP途径的抗体抑制剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是 抑制β-钙联蛋白信号传导的抗体。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是血管发生抑 制剂或调节剂(例如，抗VEGF或VEGF受体的抗体)。在某些实施方式中，所述第二 治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥单抗(HERCEPTIN)、帕尼单抗(VECTIBIX)或西 妥昔单抗(ERBITUX)。组合施用可以包括以单一药物制剂或利用不同制剂的共施用， 或以任一顺序但通常在一定时间内以便所有活性剂能同时发挥其生物活性的连续施 用。

此外，采用本文所述的VEGF/DLL4结合剂的治疗可以包括与如一种或多种细胞 因子(例如，淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)等其它生物分子的 组合治疗，或者可以伴以肿瘤或癌细胞的手术移除或者治疗医师认为必要的任何其它 疗法。

在某些实施方式中，所述治疗涉及本发明的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)与 放射疗法的组合施用。采用VEGF/DLL4结合剂的治疗可以发生于放射疗法的实施之 前、与之同时或在其之后。用于此类放射疗法的给药方案可由医务实践技术人员确定。

可以理解，VEGF/DLL4结合剂与额外治疗剂的组合可以以任意顺序或者同时地 施用。采用VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的治疗可以发生在化学疗法的实施之前、 与之同时或在其之后。组合施用可以包括以单一药物制剂或利用不同制剂的共施用， 或以任一顺序但通常在一定时间内以便所有活性剂能同时发挥其生物活性的连续施 用。此类化学治疗剂的准备和给药方案可以根据制造商说明使用或由实践技术人员根 据经验确定。此类化学疗法的准备和给药方案也描述于The Chemotherapy Source Book, 第4版，2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。

在某些实施方式中，将VEGF/DLL4结合剂施用于此前已用第二治疗剂进行过治 疗的患者。在某些其它实施方式中，VEGF/DLL4结合剂与第二治疗剂将基本同时或 同期施用。例如，可以在受试对象进行采用第二治疗剂(例如，化学疗法)的治疗疗程 的同时，对其给予VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂将在采用第二治疗剂的治疗的1年内施用。在某些替代性实施方式中， VEGF/DLL4结合剂将在采用第二治疗剂的任何治疗的10个月、8个月、6个月、4 个月或2个月内施用。在某些其它实施方式中，VEGF/DLL4结合剂将在采用第二治 疗剂的任何治疗的4周、3周、2周或1周内施用。在某些实施方式中，VEGF/DLL4 结合剂将在采用第二治疗剂的任何治疗的5天、4天、3天、2天或1天内施用。还 应理解，两种(或多于两种)试剂或治疗可以在数小时或数分钟内(即，基本同时)施加 于受试对象。

对于疾病的治疗，本发明的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的合适剂量取决于 待治疗疾病的类型、疾病的严重性和进展、疾病的响应性、是否为了治疗或预防目的 施用所述抗体、之前的治疗、患者临床史等，所有这些都由治疗医师判断。VEGF/DLL4 结合剂或抗体可以施用一次，或在持续几天到几个月的一系列治疗中施用，或施用直 到实现治愈或直到达到疾病状态消退(例如肿瘤尺寸减少)。最佳给药方案可以由对患 者体内的累积药物的测定来计算，并且可以根据各抗体或试剂的相对效力而变化。施 用医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复速率。通常，VEGF/DLL4结合剂或抗体 的剂量为约0.01μg～约100mg/千克体重、约1μg～约100mg/千克体重、约1mg～ 约100mg/千克体重、约1mg～约80mg/千克体重、约10mg～约100mg/千克体重、 约10mg～约75mg/千克体重或约10mg～约50mg/千克体重。在某些实施方式中， 所述抗体或其它VEGF/DLL4结合剂的剂量为约0.1mg～约20mg/千克体重。在某些 实施方式中，剂量可以每天、每周、每月或每年给予1次或多次。在某些实施方式中， 所述抗体或其它VEGF/DLL4结合剂每周给予1次、每两周给予1次、每3周给予1 次或每月给予一次。

在某些实施方式中，VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)可以以初始较高的“加载 (loading)”剂量并随后以一剂或多剂较低剂量进行施用。在某些实施方式中，所述施用 的频率也可以改变。在某些实施方式中，给药方案可以包括施用初始剂量并随后每周 1次、每2周1次、每3周1次或每月1次施用额外剂量(或“维持”剂量)。例如， 给药方案可以包括施用初始加载剂量并随后施用每周维持剂量(例如，初始剂量的一 半)。或者，给药方案可以包括施用初始加载剂量并随后每2周施用维持剂量(例如， 初始剂量的一半)。或者，给药方案可以包括以3周3次施用初始加载剂量并随后每2 周施用维持剂量(例如，相同量)。或者，给药方案可以包括施用初始加载剂量并随后 每3周或每月1次施用额外剂量。治疗医师可以基于所测定的药物在体液或组织中的 停留时间和浓度来估计给药的重复速率。治疗进程可以通过常规技术和检测来监督。

本领域技术人员已知，任何治疗剂的施用都可能导致副作用和/或毒性。在某些 情形中，副作用和/或毒性非常严重以致妨碍将特定试剂以治疗有效的剂量施用。在 某些情形中，必须停止药物治疗，并可能尝试其它试剂。然而，相同治疗类型中的许 多试剂往往显示出类似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么必须停止治疗，否则 如果可能，则承受与治疗剂相关的令人不快的副作用。

来自治疗剂的副作用可以包括但不限于：风团、皮疹、发痒、恶心、呕吐、食欲 减退、腹泻、寒战、发烧、疲劳、肌肉酸痛、头痛、低血压、高血压、低血钾症、低 血细胞计数、出血和心脏问题。

因此，本发明的一方面针对包括利用间歇式给药方案施用抗VEGF/抗DLL4双特 异性抗体的治疗受试对象的癌的方法，所述间歇式给药方案可以降低与抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体的施用相关的副作用和/或毒性。如本文所用，“间歇式给药”是 指采用多于一周每次的给药方案，例如，每2周1次、每3周1次或每4周1次给药 等。在某些实施方式中，用于治疗人类患者的癌的方法包括对该患者以间歇式给药方 案施用有效剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体。在某些实施方式中，用于治疗人 类患者的癌的方法包括对该患者以间歇式给药方案施用有效剂量的抗VEGF/抗DLL4 双特异性抗体并提高抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的治疗指数。在某些实施方式 中，所述间歇式给药方案包括对患者施用初始剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 并约每2周1次施用后续剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体。在某些实施方式中， 所述间歇式给药方案包括对患者施用初始剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体并 约每3周1次施用后续剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体。在某些实施方式中， 所述间歇式给药方案包括对患者施用初始剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体并 约每4周1次施用后续剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体。

在某些实施方式中，间歇式给药方案中的后续剂量与初始剂量为大致相同量或比 后者少。在其它实施方式中，后续剂量是比初始剂量更大的量。如本领域技术人员已 知，使用的剂量将取决于待实现的临床目标。在某些实施方式中，初始剂量为约 0.25mg/kg至约20mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约0.5mg/kg、1mg/kg、2 mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、 11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、 19mg/kg或20mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方 式中，初始剂量为约1mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约2.5mg/kg。在某些 实施方式中，初始剂量为约5mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约7.5mg/kg。 在某些实施方式中，初始剂量为约10mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约 12.5mg/kg。在某些实施方式中，初始剂量为约15mg/kg。在某些实施方式中，初始剂 量为约20mg/kg。在某些实施方式中，后续剂量为约0.25mg/kg至约15mg/kg。在某 些实施方式中，后续剂量为约0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、 6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、 14mg/kg或15mg/kg。在某些实施方式中，后续剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方式 中，后续剂量为约1mg/kg。在某些实施方式中，后续剂量为约2.5mg/kg。在某些实 施方式中，后续剂量为约5mg/kg。在某些实施方式中，后续剂量为约7.5mg/kg。在 某些实施方式中，后续剂量为约10mg/kg。在某些实施方式中，后续剂量为约 12.5mg/kg.

在某些实施方式中，间歇式给药方案包括：(a)对患者施用约2.5mg/kg的初始剂 量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体和(b)每2周1次施用约2.5mg/kg的后续剂量。 在某些实施方式中，间歇式给药方案包括：(a)对患者施用约5mg/kg的初始剂量的抗 VEGF/抗DLL4双特异性抗体和(b)每2周1次施用约5mg/kg的后续剂量。在某些实 施方式中，间歇式给药方案包括：(a)对患者施用约2.5mg/kg的初始剂量的抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体和(b)每3周1次施用约2.5mg/kg的后续剂量。在某些实施方 式中，间歇式给药方案包括：(a)对患者施用约5mg/kg的初始剂量的抗VEGF/抗DLL4 双特异性抗体和(b)每3周1次施用约5mg/kg的后续剂量。在某些实施方式中，间歇 式给药方案包括：(a)对患者施用约2.5mg/kg的初始剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异 性抗体和(b)每4周1次施用约2.5mg/kg的后续剂量。在某些实施方式中，间歇式给 药方案包括：(a)对患者施用约5mg/kg的初始剂量的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 和(b)每4周1次施用约5mg/kg的后续剂量。在某些实施方式中，初始剂量和维持剂 量不同，例如，初始剂量为约5mg/kg而后续剂量为约2.5mg/kg。在某些实施方式中， 间歇式给药方案可以包括加载剂量，例如，初始剂量为约20mg/kg，且后续剂量为每 2周1次、每3周1次或每4周1次施用的约2.5mg/kg或约5mg/kg。

本发明的另一方面针对降低人类患者中抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的毒性 的方法，其包括使用间歇式给药方案对该患者施用所述抗VEGF/抗DLL4双特异性抗 体。本发明的再一方面针对降低人类患者中抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的副作用 的方法，其包括使用间歇式给药方案对该患者施用所述抗VEGF/抗DLL4双特异性抗 体。本发明的又一方面针对提高人类患者中抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的治疗指 数的方法，其包括使用间歇式给药方案对该患者施用所述抗VEGF/抗DLL4双特异性 抗体。

根据动物或人类患者耐受被引入体内的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的能力， 对初始和后续剂量的输送方法做出选择。因此，在本文所述的任何方面和/或实施方 式中，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的施用可以通过静脉注射或在静脉内施用。在 某些实施方式中，施用通过静脉输注进行。在本文所述的任何方面和/或实施方式中， 抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体的施用可以通过非静脉内途径。

V.包含VEGF/DLL4结合剂的试剂盒

本发明提供了包含本文所述的VEGF/DLL4结合剂(例如，抗体)的试剂盒，所述 试剂盒能用于执行本文所述的方法。在某些实施方式中，试剂盒包含处于一个或多个 容器中的针对VEGF和/或DLL4的至少一种纯化抗体。在某些实施方式中，所述试 剂盒包含对于进行检测测试必需和/或充分的所有组分，包括所有对照、检测执行说 明，以及任何用于分析和呈现结果所必须的软件。本领域技术人员易于认识到，本发 明所公开的VEGF/DLL4结合剂可以被容易地并入本领域公知的已建立试剂盒形式的 任意一者中。

此外，还提供了包含VEGF/DLL4结合剂(例如，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗 体)以及至少一种额外治疗剂的试剂盒。在某些实施方式中，第二(或更多)治疗剂是化 学治疗剂。在某些实施方式中，第二(或更多)治疗剂是血管发生抑制剂。

可以通过参考下述非限制性实施例来进一步限定本公开的实施方式，所述实施例 详细描述了本公开的某些抗体的制备以及使用本公开的抗体的方法。对于本领域技术 人员显而易见的是，可以在不背离本公开的范围的情况下对材料和方法施以许多变 化。

实施例

实施例1

抗VEGF/抗DLL4抗体的结合亲和力

利用来自Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore2000系统测定了亲本抗 体抗VEGF的219R45(IgG形式)、抗DLL4的21R79(IgG形式)、抗DLL4的21M18 (IgG形式)以及双特异性抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79的K_D。利用 标准的基于胺的化学(NHS/EDC)使重组人DLL4-Fc或小鼠DLL4-Fc蛋白固定在CM5 羧基芯片上并用乙醇胺封闭。重组人VEGF₁₆₅或小鼠VEGF₁₆₅经生物素化并被固定在 链霉抗生物素蛋白芯片上。对所述抗体进行在HBS-P(0.01M HEPES pH7.4、0.15M  NaCl、0.005％v/v聚山梨酸酯20)中从100nM至0.78nM的连续2倍稀释。对于每种 抗体，将所有8种稀释液依次注射至特定的芯片上。对于每种双特异性抗体，采集随 时间推移的动力学数据，并利用同步全局拟合方程(simultaneous global fit equation)进 行拟合以得到亲和力常数(K_D值)。

表3

如表3所示，双特异性抗体219R45-MB-21M18对于人VEGF的亲和力常数(K_D值)为0.36nM，且对人DLL4的K_D为16nM。双特异性抗体219R45-MB-21R79对于 人VEGF的K_D为0.68nM，且对人DLL4的K_D为0.53nM。两种双特异性抗体均展示 出对小鼠VEGF比对人VEGF更弱的结合，且两种抗体均不与小鼠DDL4结合。因 此，两种双特异性抗体展示出对人VEGF相似的结合亲和力，且219R45-MB-21R79 展示出比219R45-MB-21M18强约30倍的对人DDL4的结合。此外，虽然事实上， 与双价的亲本抗体相比，双特异性抗体219R45-MB-21R79对于VEGF是单价的，但 该双特异性抗体对人VEGF具有类似的结合亲和力。

鉴定出了数种另外的结合亲和力介于21M18和21R79的K_D之间的抗DDL4抗 体。这些抗DDL4抗体中的两种被用于制备抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 219R45-MB-21R75和19R45-MB-21R83。利用上文所述的Biacore2000系统，测定了 双特异性抗体219R45-MB-21R75和19R45-MB-21R83对于人DDL4的K_D。对这四种 抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对于人DDL4的结合亲和力的比较如表4所示。

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、 219R45-MB-21R75和219R45-MB-21R83的CDR如图1A所示。重链和轻链可变区 的SEQ ID NO示于图1B，而重链和轻链的SEQ ID NO(带有或不带信号序列)示于图 1C。

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18包含：(a)由包含SEQ ID  NO:75的DNA编码的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约条件保藏于美 国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA，美国)且所 分配的指定保藏号为PTA-13233；(b)由包含SEQ ID NO:33的DNA编码的重链，其 于2012年9月21日根据布达佩斯条约条件保藏于ATCC且所分配的指定保藏号为 PTA-13236；和(c)由包含SEQ ID NO:34的DNA编码的轻链，其于2012年9月21 日根据布达佩斯条约条件保藏于ATCC且所分配的指定保藏号为PTA-13235。

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R79包含：(a)由包含SEQ ID  NO:31的DNA编码的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于 ATCC且所分配的指定保藏号为PTA-13232；(b)由包含SEQ ID NO:33的DNA编码 的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配的 指定保藏号为PTA-13236；和(c)由包含SEQ ID NO:34的DNA编码的轻链，其于2012 年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配的指定保藏号为 PTA-13235。

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R83包含：(a)由包含SEQ ID  NO:72的DNA编码的重链，其于2012年10月24日根据布达佩斯条约的条件保藏 于ATCC且所分配的指定保藏号为PTA-13278；(b)由包含SEQ ID NO:33的DNA编 码的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配 的指定保藏号为PTA-13236；和(c)由包含SEQ ID NO:34的DNA编码的轻链，其于 2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配的指定保藏号为 PTA-13235。

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R75包含：(a)由包含SEQ ID  NO:74的DNA编码的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于 ATCC且所分配的指定保藏号为PTA-13234；(b)由包含SEQ ID NO:33的DNA编码 的重链，其于2012年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配的 指定保藏号为PTA-13236；和(c)由包含SEQ ID NO:34的DNA编码的轻链，其于2012 年9月21日根据布达佩斯条约的条件保藏于ATCC且所分配的指定保藏号为 PTA-13235。

表4

实施例2

对于双特异性抗体与人VEGF和人DLL4的同时结合的HTRF检测

为了表征某些抗体和/或抗体混合物同时结合VEGF和DLL4的能力，进行了均 相时间分辨荧光(HTRF)检测。受测抗体为：抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79；亲本抗体219R45(抗VEGF)、21M18(抗 DLL4)、21R79(抗DLL4)；219R45和21M18的组合；或219R45与21R79的组合。 对抗体或抗体混合物在结合缓冲液(1X PBS、0.1％明胶、0.1％聚山梨酸酯20、400mM 氟化钾)中进行从3000nM至2.9nM的连续2倍稀释，并置于白色96孔板中。向各板 孔添加等同体积的含4μg/ml的d2标记的hDLL4-Fc和21.4ng/ml的铕穴状络合物 (Europium crypate)标记的hVEGF₁₆₅的溶液，至最终体积为100μl(受体和供体荧光团 的最终浓度分别为2μg/ml和10.7ng/ml)。将检测板温育2小时至过夜，并在SpectraMax  M5e微孔板读板器(Molecular Devices,Sunnyvale，CA)上于314nm的激发波长进行读 数。

如图2所示，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18和 219R45-MB-21R79能同时结合hVEGF和hDLL4两者。重要的是，亲本抗体的组合(即， 219R45与21M18，或219R45与21R79)均不能同时结合VEGF和DLL4。这些结果 明确显示，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79 能起到与仅仅是两种单独抗体的混合物不同的功能。

实施例3

抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体对HUVEC增殖的抑制

HUVEC细胞获自Lonza(Walkersville，MD)并在生长培养基(M199、10％热灭活 FBS(HI-FBS)、50μg/ml EGS、1X肝素、1mM L-谷氨酰胺)中培养。对于HUVEC增 殖检测，将96孔板以50μl的10μg/ml大鼠尾部I型胶原蛋白溶液(胶原蛋白I的0.02N 乙酸溶液)预先涂布，并在4℃温育过夜。温育后，将板彻底地抽吸以除去未结合的胶 原蛋白I溶液并用200μl DPBS洗涤一次。利用内皮细胞亚克隆试剂从生长瓶的表面 移走HUVEC细胞，并在1200rpm于4℃离心5分钟。将细胞以105细胞/ml的密度 重悬于饥饿/检测培养基(M199和2％HI-FBS、1X肝素、5U/ml肝素-谷氨酰胺)中。 将细胞以5000细胞/孔、50μl/孔接种至经胶原蛋白涂布的检测板内。将细胞在37℃温 育3小时，洗涤1次，重新给予100μl检测培养基，并在37℃温育过夜。次日，制备 双特异性抗体219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、亲本抗体219R45或对照抗 体LZ1的与人VEGF(R&D Biosystems,Minneapolis，MN)的混合物。将抗体连同 hVEGF(最终浓度为5ng/ml)在检测缓冲液中进行从20μM至0.25nM的5倍连续稀释。 将混合物在37℃预温育2小时。从检测板除去培养基，并向各板孔添加100μl的抗体 /hVEGF混合物。在3至4天温育后，除去培养基，并将新鲜的抗体/hVEGF混合物 等分试样添加至各板孔，并使其再进行4天温育。在第7日，向各板孔添加20μl的 Alamar Blue试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)并在37℃温育5至6小时。对板使用539nm 的激发波长和590nm的发射波长用SpectraMax M5e微孔板读板器(Molecular Devices, Sunnyvale CA)进行读数。

如图3所示，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18和 219R45-MB-21R79以及亲本抗VEGF抗体219R45抑制了HUVEC增殖。这些结果表 明，所述双特异性抗体能够抑制由VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

实施例4

双特异性抗体对DLL4诱导的Notch信号传导的抑制

将人PC3细胞用编码全长人Notch2受体的表达载体以及响应于Notch信号传导 的萤火虫荧光素酶报告载体(8xCBF-荧光素酶报告基因)进行转染。所述细胞还用海肾 荧光素酶报告基因(Promega,Madison，WI)进行了转染以作为转染效率的内部对照。 将纯化的人DLL4蛋白以100ng/孔涂布于96孔板上，并向板孔添加表达Notch2的 PC3-luc细胞。将抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体(219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21R79)、亲本抗DLL4抗体(21M18、21R79)或对照抗体LZ1从20μg/ml 至0.064μg/ml连续5倍稀释，添加至适当的板孔，并温育过夜。利用其中将萤火虫 荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性归一化的双重荧光素酶检测试剂盒(Promega, Madison,WI)对荧光素酶活性进行了测定。

如图4所示，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R79和亲本抗DDL4 抗体21M18和21R79抑制了DLL4诱导的Notch信号传导。双特异性抗体 219R45-MB-21M18仅在高抗体浓度时抑制DLL4诱导的Notch信号传导。这些结果 表明，双特异性抗体219R45-MB-21R79能够抑制DLL4诱导的Notch信号传导，且 双特异性抗体219R45-MB-21M18能够以较低的程度抑制。因此，结合实施例3中所 呈现的结果，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R79和 219R45-MB-21M18已显示出抑制VEGF诱导的和DLL4诱导的信号传导和/或增殖功 能的能力。

实施例5

双特异性抗体在人皮肤移植物模型中对体内肿瘤生长的抑制

报道了包含人皮肤移植物和人肿瘤细胞的人皮肤移植物模型。先建立人皮肤移植 物，再将人肿瘤细胞植入该皮肤移植物，从而使所述肿瘤细胞在具有人间质和脉管结 构的环境中生长(Tahtis等，2003,Mol.Cancer Ther.2:229-737)。人皮肤样品获自新生 儿包皮组织并被移植到NOD-SCID小鼠的侧肋。在建立皮肤移植物后，将经荧光素 酶标记的OMP-C8结肠肿瘤细胞(20,000个细胞)于皮下注射至所述人皮肤内。利用 IVIS成像系统(Caliper Life Sciences,Mountain View,CA)通过生物荧光成像来监测肿 瘤生长。允许肿瘤生长直至其达到1.2×10⁶光子/秒。将携带肿瘤的小鼠(n＝6只小鼠/ 组)随机化并用对照Ab、抗hDLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝伐单抗或抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18进行处理。对动物每周进行一次处理并以 25mg/kg的剂量经腹膜内施用抗体。在所指定的天数通过生物荧光成像来监测肿瘤生 长。

如图5所示，抗hDLL4抗体21M18和抗VEGF抗体贝伐单抗在该人皮肤移植物 /人肿瘤模型中均抑制了肿瘤生长。此外，双特异性的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗 体219R45-MB-21M18比单独的抗DLL4抗体或抗VEGF抗体更为有效。这些数据展 示出利用双特异性抗体同时靶向DLL4和VEGF的功用性。

实施例6

OMP-PN8胰腺肿瘤细胞在经抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体处理后的致瘤性

使用用对照抗体(15mg/kg)、抗hDLL4抗体21M18(15mg/kg)、抗VEGF抗体贝 伐单抗(15mg/kg)或抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18或 219R45-MB-21R79(30mg/kg)，在采用或不采用吉西他滨(70mg/kg)的情况下，处理 携带OMP-PN8胰腺肿瘤的小鼠。在处理4周后，收集肿瘤，加工为单细胞悬浮液并 通过将鼠类细胞免疫磁性耗尽而纯化人肿瘤细胞。将来自每个处理组的90个人肿瘤 细胞转移至新的小鼠同期组(n＝10只小鼠/组)。允许肿瘤在没有任何处理的情况下生 长55天，并用电子卡尺测定肿瘤尺寸。

图6显示出来自每个组的个体小鼠的肿瘤体积。与分离自用对照抗体治疗的小鼠 (其中，10只小鼠中的9只具有肿瘤)的细胞相比，分离自用抗hDLL4抗体21M18处 理的小鼠(其中，10只小鼠中的5只具有肿瘤)的细胞具有大大降低的致瘤性。肿瘤生 长频率的减少表明癌干细胞频率的减少。相比之下，贝伐单抗处理未导致任何肿瘤生 长频率的减少，其中，10只小鼠中的10只均具有肿瘤。与贝伐单抗相似，采用吉西 他滨作为单一试剂的处理也对肿瘤生长频率没有影响，其中，10只小鼠中的10只均 具有肿瘤。抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79 均减少了肿瘤生长频率(分别是，10只小鼠中的5只具有肿瘤，和10只小鼠中的4 只具有肿瘤)。采用吉西他滨的组合治疗似乎对肿瘤生长频率没有影响。这些数据表 明，靶向DLL4降低了癌干细胞频率，而单独靶向VEGF则不会。重要的是，这些数 据表明抗DLL4抗体的抗CSC活性在双特异性抗体中得以保留。

实施例7

双特异性抗体ELISA

将VEGF(ATGEN，韩国)以2μg/ml(100μl/孔)涂布于Nunc maxisorb板上并在2 ℃至8℃温育过夜。将双特异性抗体219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、 219R45-MB-21R75和219R45-MB-21R83在含有2μg/ml生物素-DLL4-hFc的封闭缓冲 液(1x PBS,0.1％明胶，0.1％聚山梨酯-20,pH7.4)中稀释。将抗体在500ng/ml至 0.008ng/ml进行3倍连续稀释。将抗体样品在含生物素-DLL4-hFc的封闭缓冲液中温 育2小时。温育后，将抗体样品转移至经VEGF涂布的检测板(100μl/孔)并温育2小 时。向各板孔添加链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA) 并温育1小时。向板孔添加TMB底物，并用10分钟进行显色，然后用2M硫酸中止 反应。读取450nm至650nm的吸光度，并采用Softmax Pro分析程序(Molecular  Devices,Sunnyvale,CA)中的4-参数拟合对数据进行分析。

图7显示了双特异性抗体219R45-MB-21M18(空心圆)、219R45-MB-21R79(空心 正方形)、219R45-MB-21R75(空心三角形)和219R45-MB-21R83(空心菱形)的与参照 抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体(实心圆)相比的滴定曲线。与参照双特异性抗体相比 的上述双特异性抗体的相对效力如表5所示。

表5

抗体 相对效力(％) 219R45-MB-21M18 67 219R45-MB-21R79 501 219R45-MB-21R75 422 219R45-MB-21R83 222

双特异性抗体219R45-MB-21R79效力最强，其比219R45-MB-21M18强约7倍， 这反映出21R79抗原结合位点的亲和力更高。

实施例8

双特异性抗体的制备

利用GS-CHO细胞系来制备双特异性抗体。将CHOK1SV细胞(Lonza Biologics) 用所关注的基因通过电穿孔转染，所述基因偶联有作为可选择标记物的谷氨酰胺合成 酶(GS)。将转染物和亚克隆物针对抗体生产力进行筛选，并选择高产者进行放大生产。 使用分批进料工艺和分批进料生物反应器来生长细胞。将收集的细胞培养液(HCCF) 中累积的抗体利用色谱技术进行分离和纯化。

将双特异性抗体细胞系219R45-MB-21M18.010.017和 219R45-MB-21R79.017.003在5L经搅拌的罐式生物反应器中培养14天。细胞系 219R45-MB-21M18.010.017产生3.0g/L的最终抗体滴度，而细胞系 219R45-MB-21R79.017.003产生0.8g/L的最终抗体滴度。将细胞系 219R45-MB-21R75.101和219R45-MB-21R83.113在25L WAVE生物反应器系统(GE  Healthcare)中利用分批进料工艺进行培养，实现了0.4g/L的最终抗体滴度。双特异性 抗体细胞系219R45-MB-21M18AG.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、 219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014和 219R45-MB-21R83AG.129.003在5L经搅拌的罐式生物反应器中培养14至15天。细 胞系219R45-MB-21M18AG.138.007在14天后产生1.0g/L的最终抗体滴度。细胞系 219R45-MB-21M18AG.038.009在14天后产生1.6g/L的最终抗体滴度。细胞系 219R45-MB-21M18AG.142.002在14天后产生2.6g/L的最终抗体滴度。细胞系 219R45-MB-21R79AG.072.014在15天后产生2.1g/L的最终抗体滴度。细胞系 219R45-MB-21M18AG.038.009在15天后产生2.4g/L的最终抗体滴度。通过过滤从 这4种细胞系的每一种中收集培养液并进行蛋白A亲和色谱分析。蛋白A柱采用一 系列缓冲液冲洗，且抗体用低pH洗脱缓冲液来洗脱。双特异性抗体的初始表征利用 尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)和等电聚焦(IEF)来进行。

尺寸排阻色谱(SEC)用于确定抗体产品的纯度。SEC是其中将溶液中的分子(例 如，抗体)按照其尺寸进行分离的公知色谱方法。SEC可以用于将抗体产品与凝集物 和/或杂质区分，并确定抗体产品相比于总混合物的百分比。如本文所用，SEC不区 分同源聚集抗体和异源二聚体双特异性抗体。

成像毛细管等电聚焦(icIEF)用于确定双特异性抗体异源二聚体的身份和纯度。利 用icIEF，将抗体的电荷同型根据其pI进行分离，且结果是抗体的电荷分布的“指纹”。 icIEF方法的作用还有：将双特异性抗体异源二聚体借助其不同于任何同源二聚体产 物或杂质的pI而进行分离，从而确定其纯度。

通过icIEF在ProteinSimple ICE280instrument(ProteinSimple,Santa Clara,CA)上 分析双特异性抗体。对于该分析，将蛋白混合物导入毛细管，沿毛细管施加高电压， 且两性电解质沿着毛细管的长度方向建立线性pH梯度。在电场的影响下，pI标记物 和蛋白混合物均沿毛细管长度方向迁移，直至达到净电荷为0的pH值。一旦聚焦， ICE280仪器使用全柱成像检测并用280-nm UV照相机检测毛细管内蛋白同型的模 式。所产生的电泳图(electropherogram)利用内部pI标记物进行校正，并进行积分以确 立蛋白混合物的不同带电同型的对应百分比面积。来自数种抗VEGF/抗DLL4双特异 性抗体的电荷图如图8所示。对于该实验，用MilliQ水将蛋白A洗脱液稀释至 6.6mg/ml的浓度。将总共18μl样品与100μL的8M脲、70μl的0.5％甲基纤维素、8μL 的3-10Pharmalyte、2μl的高pI标记物和2μl的低pI标记物混合，至最终体积为200μl。 表6显示了在蛋白A亲和色谱后由SEC-HPLC所确定的来自细胞系 219R45-MB-21M18.010.017、219R45-MB-21R79.017.002、219R45-MB-21R75.101、 219R45-MB-21R83.113、219R45-MB-21M18.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、 219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014和 219R45-MB-21R83AG.129.003的抗体产品百分比。表6还显示了在蛋白A亲和色谱 后由icIEF分析出的来自细胞系219R45-MB-21M18.010.017、 219R45-MB-21R79.017.002、219R45-MB-21R75.101、219R45-MB-21R83.113、 219R45-MB-21M18.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、 219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014和 219R45-MB-21R83AG.129.003的异源二聚体抗体百分比。

表6

通过额外的色谱步骤可以进一步提高双特异性抗体产品的纯度。在蛋白A亲和 色谱后，将洗脱级分在室温于低pH保持不多于60分钟，以使病毒失活。将抗体溶 液(蛋白A柱洗脱液，pH已调整)加载至强阴离子交换柱上。产品相关杂质和工艺相 关杂质结合至阴离子交换色谱树脂，并收集流通级分(抗体产品)。在一些情况下，通 过使用多模态色谱树脂(例如，陶瓷羟基磷灰石)来进一步提高纯度。在一些情况下， 使用超滤和渗滤技术对抗体产品进行缓冲液交换，其后添加赋形剂。将配制得的抗体 无菌过滤至无菌容器中并冷藏或冷冻保存。利用SEC-HPLC和IEF进行再次评估双 特异性抗体的纯度。

表7

如表7所示，在蛋白A步骤后采用了额外的色谱步骤的抗VEGF/抗DLL4双特 异性抗体的纯化进行抗体产品的分离，其通过SEC分析具有95％至约99％的纯度。 通过IEF的分析确定，来自细胞系219R45-MB-21M18.010.017的纯化抗VEGF/抗 DLL4双特异性抗体具有98.5％的异源二聚体，来自细胞系219R45-MB-21R79.017.002 的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体具有99.3％的异源二聚体，来自细胞系 219R45-MB-21R75.101的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体具有98.2％的异源二聚体， 来自细胞系219R45-MB-21R83.113的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体具有91.4％的 异源二聚体，来自细胞系219R45-MB-21M18.138.007的抗VEGF/抗DLL4双特异性 抗体具有100％的异源二聚体，来自细胞系219R45-MB-21M18AG.142.002的抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体具有100％的异源二聚体，来自细胞系 219R45-MB-21R79AG.072.014的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体具有100％的异源二 聚体，而来自细胞系219R45-MB-21R83AG.129.003的抗VEGF/抗DLL4双特异性抗 体具有100％的异源二聚体。这些结果证实，与仅采用蛋白A色谱的纯化相比，阴离 子交换色谱加大提高了异源二聚体抗体的百分比。多模态色谱步骤(如陶瓷羟基磷灰 石)的添加也能提高单体纯度(如SEP-HPLC所测定)。

实施例9

OMP-C8肿瘤生长体内肿瘤复发模型的抑制

将OMP-C8结肠肿瘤异体移植物的单细胞悬浮液(20,000个细胞)皮下注射至6至 8周龄NOD/SCID小鼠的肋下。允许肿瘤生长33天，直至其达到240mm³的平均体 积。将小鼠随机化(n＝10只小鼠/组)并用抗hDLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝伐 单抗、抗体21M18与贝伐单抗的组合、抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 219R45-MB-21M18、抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R79或对照抗体 处理，其均与依立替康组合。抗体与依立替康每周通过注射至腹膜内腔中给药。抗体 21M18和贝伐单抗以7.5mg/kg给药，双特异性抗体219R45-MB-21M18和 219R45-MB-21R79以15mg/kg给药，而依立替康以45mg/kg给药。将依立替康给药 4周，此时将其停用，并继续施用抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺 测定肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M.表达。

如图9所示，在停止依立替康治疗后抗hDLL4抗体21M18继续抑制肿瘤生长。 相比之下，抗VEGF抗体贝伐单抗在停用依立替康后未能抑制肿瘤生长。抗DLL4 抗体21M18与抗VEGF抗体贝伐单抗的组合导致比单独的任一试剂更大的对肿瘤再 生长的抑制。此外，抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18在抑制肿瘤 再生长方面比两种抗体的混合物更为有效。

实施例10

OMP-C8结肠肿瘤致瘤性的降低

将OMP-C8结肠肿瘤异体移植物的单细胞悬浮液(20,000个细胞)皮下注射至6至 8周龄的NOD/SCID小鼠的肋下。允许肿瘤生长33天，直至其达到300mm³的平均 体积。将小鼠随机化(n＝5只小鼠/组)并用抗DLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝伐 单抗、抗体21M18与贝伐单抗的组合、抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体 219R45-MB-21M18、抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21R79或对照抗体 进行处理，其与依立替康组合或不与之组合。抗体与依立替康每周通过注射至腹膜内 腔中给药。抗体21M18和贝伐单抗以7.5mg/kg给药，双特异性抗体219R45-MB-21M18 和219R45-MB-21R79以15mg/kg给药，而依立替康以45mg/kg给药。4周后收集肿 瘤，加工为单细胞悬浮液，并分离出人类肿瘤细胞。将150个来自每个实验组的肿瘤 细胞皮下注射至新的小鼠同期组(n＝10/组)并让肿瘤在没有处理的情况下生长。监测 肿瘤生长并用电子卡尺测定肿瘤体积。

第68天时的个体肿瘤体积如图10所示。抗DLL4抗体21M18、21M18与抗VEGF 抗体贝伐单抗的组合、双特异性抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R79以及 依立替康作为单一试剂均降低了肿瘤生长频率。相比之下，作为单一试剂的抗VEGF 贝伐单抗与对照抗体相比对肿瘤生长频率没有影响。在用依立替康和抗体组合处理的 组中，双特异性抗体219R45-MB-21M18在降低肿瘤生长频率方面最为有效。

实施例11

OMP-C8结肠肿瘤体内生长的抑制

将OMP-C8结肠肿瘤异体移植物的单细胞悬浮液(50,000个细胞)皮下注射至6至 8周龄的NOD/SCID小鼠的肋下。使肿瘤生长21天，直至其达到80mm³的平均体积。 将小鼠随机化(n＝8/组)并用抗DLL4抗体21M18、抗VEGF抗体贝伐单抗、抗VEGF/ 抗DLL4双特异性抗体219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R75、219R45-MB-21R79、 219R45-MB-21R83或对照抗体进行处理，其单独使用或与依立替康组合。抗体与依 立替康每周通过注射至腹膜内腔中给药。贝伐单抗和双特异性抗体 219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R75、219R45-MB-21R79和219R45-MB-21R83 以15mg/kg给药，而依立替康以7.5mg/kg给药。监测肿瘤生长并在指定的时间点用 电子卡尺测定肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M.表达。

作为单一试剂，所有4种抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体均显示出比抗VEGF 抗体贝伐单抗提高的抗肿瘤活性。与依立替康结合时，采用抗VEGF/抗DLL4双特异 性抗体219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R83的处理导致对肿瘤生长的最大抑制 (图11)。

在处理期之后，制备肿瘤切片并通过苏木精和曙红(H&E)染色进行分析。用 219R45-MB-21M18和219R45-MB-21R83与依立替康的组合处理的肿瘤显示出深粉 色染色区，这提供了深度钙化的证据。这是高度坏死肿瘤组织的特征。

实施例12

食蟹猴中的双特异性抗体非GLP毒性研究

在食蟹猴中启动了非GLP毒性研究，以评估和比较某些双特异性抗体的毒性状 况。对动物每2周经IV输注给药0mg/kg(对照)、5mg/kg(低剂量)或30mg/kg(高剂 量)的抗DLL4/抗VEGF双特异性抗体(219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R83或 219R45-MB-21R79)。在每组中对3只雄性和3只雌性给药。15周后，接受高剂量 219R45-MB-21R79的动物的平均体重低于接受高剂量的219R45-MB-21R18或 219R45-MB-21R83的动物。另外，接受219R45-MB-21R79的动物中的平均血清白蛋 白水平低于那些接受219R45-MB-21R18或219R45-MB-21R83的动物。虽然尚属初步， 但这些早期数据表明219R45-MB-21R18和219R45-MB-21R83可能具有比 219R45-MB-21R79更优异的毒性模式。

应该理解，本文所述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，且本领域技术人员 能根据其得到启示进行各种改变或变化，且这些各种改变或变化应该包括在本申请的 主旨和范围内。

本文引用的所有公开物、专利、专利申请、互联网网址以及登录号/数据库序列(包 括多核苷酸和多肽序列)出于所有目的通过援引并入本文，其程度等同于每个单独的 公开物、专利、专利申请、互联网网址或登录号/数据库序列均专门且单独地指明如 此通过援引并入。

序列

具有信号序列(下划线)的21M18重链(SEQ ID NO:1)

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具有信号序列(下划线)的21R79重链(SEQ ID NO:2)

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具有信号序列(下划线)的219R45重链(SEQ ID NO:3)

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具有信号序列(下划线)的轻链(SEQ ID NO:4)

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWF QQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPW TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

不具有预测信号序列的21M18重链(SEQ ID NO:5)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

不具有预测信号序列的21R79重链(SEQ ID NO:6)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

不具有预测信号序列的219R45重链(SEQ ID NO:7)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

不具有预测信号序列的轻链(SEQ ID NO:8)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

21M18重链可变区(SEQ ID NO:9)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS

21R79重链可变区(SEQ ID NO:10)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS

219R45重链可变区(SEQ ID NO:11)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYWGQGTLVTVSS

轻链可变区(SEQ ID NO:12)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK

21R75、21R79、21R83和21M18重链CDR1(SEQ ID NO:13)

TAYYIH

替代性21R75、21R79、21R83和21M18重链CDR1(SEQ ID NO:79)

AYYIH

21R79重链CDR2(SEQ ID NO:14)

YIANYNRATNYNQKFKG

21M18重链CDR2(SEQ ID NO:15)

YISSYNGATNYNQKFKG

21R75、21R79、21R83和21M18重链CDR3(SEQ ID NO:16)

RDYDYDVGMDY

219R45重链CDR1(SEQ ID NO:17)

NYWMH

219R45重链CDR2(SEQ ID NO:18)

DINPSNGRTSYKEKFKR

219R45重链CDR3(SEQ ID NO:19)

HYDDKYYPLMDY

轻链CDR1(SEQ ID NO:20)

RASESVDNYGISFMK

轻链CDR2(SEQ ID NO:21)

AASNQGS

轻链CDR3(SEQ ID NO:22)

QQSKEVPWTFGG

具有信号序列(下划线)的人DLL4(SEQ ID NO:23)

MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRV CLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIE AWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYY GDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECL CRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATC SNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCE HSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNR GPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTS IDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVG

不具有预测信号序列的人DLL4(SEQ ID NO:24)

SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQ GSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNL SCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCST PWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELS ECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANY ACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCAR NPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVC NCPYGFVGSRCEFPVG

人DLL4N-末端区(SEQ ID NO:25)

SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQ GSLAVGQN

人DLL4DSL结构域(SEQ ID NO:26)

WLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTG EYC

具有信号序列(下划线)的人VEGF-A(SEQ ID NO:27)

MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVD IFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEM SFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPG PHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR

不具有预测信号序列的人VEGF-A(SEQ ID NO:28)

APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGC CNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRG KGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSC KNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR

21M18重链核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:29)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGCGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCTGCCTCC ACCAAGGGCCCATCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG

21R79重链核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:30)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTGAAACAGGCACCA GGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGGGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACAGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCCTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG

21R79重链核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:31)

ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG

219R45重链核苷酸序列(13A版本1)(SEQ ID NO:32)

ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTGTTGCTCGTGGCGGCACCCAGATGGGTGTTGTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCAAGCGTAAAAGTATCG TGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGGTGCGGCAGGCTCCG GGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGCAGAACATCATATAAG GAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCTCGACTGCGTACATG GAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGCACCATCCATTATGAT GACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCAGC GCGTCGACGAAAGGTCCCTCGGTATTTCCCCTCGCCCCCTGCTCGAGGTCGACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCGGTAACGGTGTCG TGGAACTCGGGAGCGCTTACGTCCGGAGTCCACACATTTCCGGCGGTACTGCAATCCTCG GGACTGTATTCGTTGTCGTCAGTGGTGACTGTCCCGTCCTCCAATTTCGGGACTCAGACC TATACGTGCAACGTCGACCACAAACCCTCAAACACCAAGGTGGATAAGACAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCGTGTCCGGCACCCCCTGTCGCCGGACCCTCAGTCTTT TTGTTTCCGCCGAAGCCCAAAGATACACTCATGATCTCAAGAACGCCCGAGGTAACATGC GTGGTGGTCGATGTAAGCCACGAGGATCCAGAAGTACAATTCAATTGGTATGTAGACGGG GTCGAGGTCCATAACGCAAAGACGAAACCGAGGGAAGAGCAGTTCAATTCGACTTTCCGG GTGGTGTCGGTGCTTACAGTCGTACATCAGGACTGGTTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGT AAAGTATCGAATAAGGGCCTTCCAGCGCCGATTGAAAAGACCATCTCCAAGACCAAAGGA CAGCCACGAGAGCCGCAAGTCTATACGCTTCCTCCCAGCCGAGAAAAGATGACTAAAAAC CAGGTATCGCTTACGTGTCTCGTCAAGGGTTTCTACCCTTCGGACATCGCGGTGGAATGG GAGAGCAATGGACAACCGGAAAACAACTACAAGACGACACCGCCTATGTTGAAAAGCGAT GGATCGTTTTTCCTCTATTCGAAACTCACGGTCGATAAGTCACGGTGGCAGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCAGTGATGCACGAGGCGCTCCACAATCACTATACCCAGAAAAGCCTG TCACTTTCCCCGGGAAAATGA

219R45重链核苷酸序列(13A版本2)(SEQ ID NO:33)

ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTGCTCCTCGTGGCTGCTCCTCGGTGGGTCCTCTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCTTCCGTCAAAGTCTCC TGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTCCT GGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGCAGAACCTCCTACAAG GAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCTCCACAGCTTACATG GAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCACCATCCACTACGAC GACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCAGC GCTTCCACAAAAGGACCCTCCGTCTTTCCCCTCGCCCCCTGCTCCCGGTCCACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCTGTCACAGTGTCC TGGAACTCCGGAGCTCTCACATCCGGAGTCCACACATTTCCTGCTGTGCTCCAATCCTCC GGACTGTATTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAATTTCGGGACACAGACC TATACATGCAACGTGGACCACAAACCCTCCAACACCAAAGTCGATAAGACAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCTTGTCCTGCTCCCCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTT CTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTCACATGC GTGGTCGTCGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAAGTCCAATTTAATTGGTATGTGGACGGG GTGGAGGTCCATAACGCTAAGACCAAACCTAGGGAAGAGCAGTTCAATTCCACTTTCCGG GTGGTGTCCGTGCTGACCGTCGTTCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAAGAATACAAATGC AAAGTCTCTAATAAGGGCCTCCCTGCTCCTATTGAAAAAACAATTTCCAAAACAAAAGGA CAACCTCGGGAGCCTCAAGTCTACACACTGCCACCTTCCCGGGAAAAAATGACAAAAAAT CAAGTCTCCCTCACATGTCTCGTCAAGGGATTCTACCCTTCCGACATTGCTGTGGAATGG GAATCCAATGGACAACCTGAAAACAACTACAAGACAACACCTCCTATGCTCAAAAGCGAT GGGTCCTTTTTCCTCTATTCCAAACTCACAGTCGATAAGTCTCGGTGGCAGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAATCACTATACCCAGAAAAGCCTG TCCCTCTCCCCTGGAAAATGA

轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:34)

ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCCTACGGC GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCATGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTC ATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGAACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCC GGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCC TCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGTTAG

21M18重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:35)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGCGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT

21R79重链可变区核苷酸序列(13B)(SEQ ID NO:36)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTGAAACAGGCA CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGGGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACAGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC

21R79重链可变区核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:37)

CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT

219R45重链可变区核苷酸序列(13A版本1)(SEQ ID NO:38)

CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCAAGCGTAAAAGTA TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGGTGCGGCAGGCT CCGGGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGCAGAACATCATAT AAGGAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCTCGACTGCGTAC ATGGAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGCACCATCCATTAT GATGACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCC AGC

219R45重链可变区核苷酸序列(13A版本2)(SEQ ID NO:39)

CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCTTCCGTCAAAGTC TCCTGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCT CCTGGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGCAGAACCTCCTAC AAGGAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCTCCACAGCTTAC ATGGAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCACCATCCACTAC GACGACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCC AGC

轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:40)

GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCATGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:41)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG2重链恒定区(SEQ ID NO:42)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG3重链恒定区(SEQ ID NO:43)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSC DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHE ALHNRFTQKSLSLSPGK

人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:44)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

FLAG肽(SEQ ID NO:45)

DYKDDDDK

具有信号序列(下划线为未经修饰的链)的亲本21R79重链(SEQ ID NO:46)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYIANYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有下划线信号序列的亲本219R45(SEQ ID NO:47)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAP GQGLEWMGDINPSNGRTSYKEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYD DKYYPLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

不具有预测信号序列的亲本21R79重链(SEQ ID NO:48)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

不具有信号序列的亲本219R45重链(SEQ ID NO:49)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

亲本21R79重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:50)

CAAGTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGCATCGGTCAAAATC TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGGTAAAGCAGGCG CCAGGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGCGCGACGAACTAT AACCAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACATCGACGGCCTAC ATGGAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGCGCAAGAGATTAC GACTATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAGTCTCCTCC

亲本219R45重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:51)

CAGGTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGCGTCGGTAAAGGTC AGCTGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGGTCAGACAGGCC CCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGACGGACTAGCTAT AAGGAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCCTCAACGGCCTAC ATGGAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTACTATCCACTAT GACGATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTGGTAACCGTGAGC AGC

具有信号序列的亲本21R79重链核苷酸序列(SEQ ID NO:52)

ATGAAACACTTGTGGTTTTTCCTCTTGCTCGTGGCAGCTCCTCGGTGGGTACTTTCACAA GTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGCATCGGTCAAAATCTCG TGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGGTAAAGCAGGCGCCA GGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGCGCGACGAACTATAAC CAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACATCGACGGCCTACATG GAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGCGCAAGAGATTACGAC TATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAGTCTCCTCCGCCAGC ACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACA GCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGT TGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAA

具有信号序列的亲本219R45重链核苷酸序列(SEQ ID NO:53)

ATGAAACACCTCTGGTTCTTTTTGCTCCTGGTGGCAGCTCCCCGATGGGTGCTTAGCCAG GTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGCGTCGGTAAAGGTCAGC TGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGACGGACTAGCTATAAG GAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCCTCAACGGCCTACATG GAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTACTATCCACTATGAC GATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTGGTAACCGTGAGCAGC GCGTCCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAG AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAA

亲本21R79和219R45轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:54)

GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCAACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

亲本21R79和219R45轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:55)

ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCTCTGGATCAGCGGAGCCTACGGG GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCAACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCCCCCTCCGTCTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAAAGCGGCACTGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAAGC GGCAACTCCCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA

不具有预测信号序列的21R75重链(SEQ ID NO:56)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIAGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有预测信号序列(下划线)的21R75重链(SEQ ID NO:57)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYIAGYKDATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

21R75重链可变区(SEQ ID NO:58)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIAGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS

21R75重链CDR2(SEQ ID NO:59)

YIAGYKDATNYNQKFKG

具有信号序列的21R75重链核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:60)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG

具有信号序列的21R75重链核苷酸序列(13B版本1T)(SEQ ID NO:77)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG

具有信号序列的21R75重链核苷酸序列(13B版本S1-2)(SEQ ID NO:61)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG

不具有预测信号序列的21R83重链(SEQ ID NO:62)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISNYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有预测信号序列(下划线)的21R83重链(SEQ ID NO:63)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYISNYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

21R83重链可变区(SEQ ID NO:64)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISNYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS

21R83重链CDR2(SEQ ID NO:65)

YISNYNRATNYNQKFKG

具有下划线信号序列的21R83重链核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:66)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG

具有下划线信号序列的21R83重链核苷酸序列(13B版本1T)(SEQ ID NO:78)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG

具有下划线信号序列的21R75重链核苷酸序列(13B版本S1-2)(SEQ ID NO:67)

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG

21R75重链可变区核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:68)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT

21R75重链可变区核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:69)

CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT

21R83重链可变区核苷酸序列(13B版本1)(SEQ ID NO:70)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGC

21R75重链可变区核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:71)

CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT

具有下划线信号序列的21R83重链核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:72)

ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG

GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG

21R83重链可变区核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:73)

CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT

具有下划线信号序列的21R75重链核苷酸序列(13B版本2)(SEQ ID NO:74)

ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG

21M18重链核苷酸序列(版本2)(SEQ ID NO:75)

ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG

21M18重链可变区(版本2)(SEQ ID NO:76)

CAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGTTGC AAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCAGGA CAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTACAAACTATAACCAA AAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATGGAA TTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGATTAT GATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT

抗DLL4重链CDR2共有序列(SEQ ID NO:80):

YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG，其中X₁是丝氨酸或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是 天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、精氨酸或天冬氨酸。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

(a)特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第一抗原结合位点，和

(b)特异性结合人δ样配体4(DLL4)的第二抗原结合位点，

其中，所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1； 包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2；和包含 HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；

其中，所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH (SEQ ID NO:79)的重链CDR1；包含YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80) 的重链CDR2，其中，X₁是丝氨酸或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨酸、精氨酸或天冬氨酸；和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3，并且

所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含 QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合位点包含：包 含TAYYIH(SEQ ID NO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ  ID NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:65)的重链CDR2和包含 RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。

3.如权利要求1或2所述的双特异性抗体，所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的第一重链可变区；

(b)与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64具有至少 90％序列同一性的第二重链可变区；和

(c)与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的第一轻链可变区和第二轻链可 变区。

4.如权利要求1～3中任一项所述的双特异性抗体，所述抗体包含第一CH3结 构域和第二CH3结构域，所述第一CH3结构域和第二CH3结构域各自经修饰以促 进异源多聚体的形成。

5.如权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一CH3结构 域和所述第二CH3结构域基于静电效应进行修饰。

6.如权利要求1～5中任一项所述的双特异性抗体，所述抗体是单克隆抗体、重 组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、IgG1抗体或IgG2抗体。

7.如权利要求1～5中任一项所述的双特异性抗体，所述抗体包含第一人IgG2 恒定区和第二人IgG2恒定区，所述第一人IgG2恒定区在SEQ ID NO:42的249位和 288位对应的位置具有氨基酸取代，其中所述氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换；所述 第二人IgG2恒定区在SEQ ID NO:42的236位和278位对应的位置具有氨基酸取代， 其中所述氨基酸被赖氨酸替换。

8.如权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗体，所述抗体：

(i)抑制VEGF与至少一种VEGF受体的结合；

(ii)抑制DLL4与至少一种Notch受体的结合；

(iii)抑制Notch信号传导；和/或

(iv)调节血管发生。

9.一种特异性结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体，所述抗体包含:

(a)SEQ ID NO:7的重链；

(b)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:62的重链；和

(c)两条SEQ ID NO:8的轻链。

10.一种双特异性抗体，所述抗体选自由219R45-MB-21M18、 219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75和219R45-MB-21R83组成的组。

11.一种特异性结合人血管内皮生长因子的分离抗体，所述抗体包含：

(a)包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链 CDR3；和

(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。

12.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的重链可变区；和

(b)与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。

13.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:7的重链；和

(b)包含SEQ ID NO:8的轻链。

14.如权利要求11至13中任一项所述的抗体，所述抗体抑制VEGF与至少一种 VEGF受体的结合。

15.一种特异性结合人DLL4的分离抗体，所述抗体包含：

(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO:13)或AYYIH(SEQ ID NO:79)的重链CDR1；包 含YIX₁X₂YX₃X₄ATNYNQKFKG(SEQ ID NO:80)的重链CDR2，其中，X₁是丝氨酸 或丙氨酸，X₂是丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，X₃是天冬酰胺或赖氨酸，且X₄是甘氨 酸、精氨酸或天冬氨酸；和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3； 和

(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1；包含AASNQGS (SEQ ID NO:21)的轻链CDR2；和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链 CDR3。

16.如权利要求15所述的抗体，所述抗体包含：包含TAYYIH(SEQ ID NO:13) 的重链CDR1；包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO:14)、 YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID  NO:65)的重链CDR2；和包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO:16)的重链CDR3。

17.如权利要求15或16所述的抗体，所述抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。

18.如权利要求11-17中任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体、重组抗体、 嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包含抗原 结合位点的抗体片段。

19.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1至18中任一项所述的抗体和 药物可接受载剂。

20.一种细胞，所述细胞包含或产生权利要求1至18中任一项所述的抗体。

21.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码权利要求1至18中 任一项所述的抗体的多核苷酸。

22.一种载体，所述载体包含权利要求21所述的多核苷酸。

23.一种细胞，所述细胞包含权利要求22所述的多核苷酸。

24.一种多肽，该多肽包含选自由以下序列组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ  ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID  NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID  NO:12、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID  NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID  NO:64。

25.权利要求1至18中任一项所述的抗体在制备用于治疗癌的药物中的应用。

26.如权利要求25所述的应用，其中，所述癌选自由结直肠癌、结肠癌、卵巢 癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑色素瘤、宫颈癌、 膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈部癌、淋巴瘤和白血病组成的组。

27.权利要求1至18中任一项所述的抗体在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的 应用。

28.如权利要求27所述的应用，其中，所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、结肠肿瘤、 卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿 瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶质细胞瘤和头颈部肿瘤组成的组。

29.如权利要求25至28中任一项所述的应用，其中，所述应用包括抗体和至少 一种另外的治疗剂。

30.一种制备抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达至少一种权利要求21所 述的多核苷酸。