水黄皮素或水黄皮提取物在抗流感病毒药物中的应用

摘要

本发明公开了水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在制备用于治疗和/或抗流感病毒药物中的应用。所述水黄皮总黄酮提取物是从水黄皮茎枝和/或叶提取而得，总黄酮的含量为50％～70％重量；其中，含有水黄皮素；所述总黄酮的含量以水黄皮素为对照品，采用紫外分光光度法测定；水黄皮素的含量为5％～10％重量。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素的应 用。

背景技术

流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8个片段，共编码 11种蛋白质的单链负RNA病毒。流感病毒是引起流行性感冒的病原，分为甲、 乙、丙三型，其中以甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是H1、H2和 H3亚型，其中以H1N1亚型病死率最高，因此本发明主要以H1N1型流感病毒 为研究对象对水黄皮总黄酮提取物和水黄皮素的抗病毒活性进行研究。

目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病，具有传染性高、传 播迅速、已发生流行等特点。由于流感病毒的抗原变异能力强，而疫苗只对已 知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新 型流感病毒无效，因此，每隔几年流感病毒就有一次较大范围的流行。据统计， 全世界平均每年有50-100万人死于流感。由此可见，流感作为一种病毒性传染 病不仅严重威胁着公众健康，而且给国家和社会带来了沉重的经济负担。虽然 已知的流感病毒已经得到控制，但是，由于流感病毒的抗原变异能力极强且相 当频繁，疫苗的研制和生产相对滞后，对于易感人群的保护率不高，因此，新 的流感大流行随时都有可能爆发。在这种情形下，寻找具有预防和治疗作用的 抗流感病毒药物就显得尤为重要和紧迫。

水黄皮Pongamia pinnata(L.)Merr.为豆科(Leguminosae)水黄皮属的半红树植 物，别名水流豆。水黄皮属全世界仅有1种，广泛分布于印度、马来西亚及我 国南部沿海。在我国民间用其种子榨出的油治疗疥癞、脓疮及风湿。在印度， 其种子和种子油用来治疗白斑病、麻风病、风湿病，叶子用于治疗痔疮、肿瘤、 伤口消炎等。现代药理研究表明，水黄皮总黄酮提取物具有抑菌、抗炎、镇痛、 抗疱疹病毒、抗溃疡等活性，但尚未见有抗流感病毒的报道(黄欣碧,龙盛京.半 红树植物水黄皮的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2004,35(9): 1073-1076.)。本发明经试验证明，水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素对甲型流感 病毒感染的MDCK细胞具有很好的抗流感病毒作用；另外，在小鼠流感动物模 型中同样表现出了很好的抗流感病毒活性。这提示水黄皮总黄酮提取物及水黄 皮素在治疗甲型流感病毒感染性疾病领域具有很好的开发利用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在治疗和/或预防 流感病毒药物中的应用，为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效的 天然药物。

本发明的技术方案为：

水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在制备用于治疗和/或抗流感病毒药物中的 应用。

进一步地，所述水黄皮总黄酮提取物是从水黄皮茎枝和/或叶提取而得，总 黄酮的含量为50％～70％重量；

其中，含有水黄皮素；

所述总黄酮的含量以水黄皮素为对照品，采用紫外分光光度法测定；

水黄皮素的含量为5％～10％重量。

本发明所述的水黄皮总黄酮提取物通过下述方法制备：

(1)取水黄皮茎枝和/或叶，以50%～90%乙醇回流提取1～3次，每次提取 1～3小时，合并提取液；

(2)将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液；

(3)将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱2～5个柱体 积，再用20～70%乙醇洗脱2～10个柱体积，收集乙醇洗脱液；

(4)浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。

进一步地，所述水黄皮总黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取水黄皮茎枝和/或叶，以80%乙醇回流提取2次，每次提取2小时， 合并提取液；

(2)将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液；

(3)将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱3个柱体积， 再用50%乙醇洗脱5个柱体积，收集乙醇洗脱液；

(4)浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。

本发明所述水黄皮素具有如图4所示的HPLC色谱图，其中，色谱图的特 征峰为：水黄皮素保留时间：10.8min；

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.2%HAc (43:57)；流速：1ml/min；检测波长：260nm。

本发明所述水黄皮素是从水黄皮总黄酮提取物中提纯而得，包括以下步骤：

(1)通过反相硅胶层析柱分离，以30%～60%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗 品；

(2)用无水乙醇溶解步骤(1)所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为 5%～30%，放置重结晶，即得。

优选的水黄皮素的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过反相硅胶层析柱分离，以40%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗品；

(2)用无水乙醇溶解步骤(1)所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为 10%，放置重结晶，即得。

本发明的又一个目的是提供一种抗流感病毒的药物组合物，所述药物组合物 含有本发明所述的水黄皮素和/或水黄皮总黄酮提取物。

进一步地，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

附图说明

图1是水黄皮表的结构式。

图2是利巴韦林的细胞毒性和对流感病毒的抑制作用图。

图3是水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素的MDCK细胞毒性及对流感病毒 H1N1的抑制作用；

其中，左图NEP009表示水黄皮总黄酮提取物，右图NEP014表示水黄皮素。

图4是水黄皮素的HPLC色谱图。

具体实施方式

通过以下实施例可以进一步理解本发明的优点和特点，不应该理解为是对 本发明范围的限制。

以下实施例中所用仪器和试剂，除特殊说明以外均为普通市售。

【实施例1】水黄皮总黄酮提取物的制备及分析

取水黄皮枝叶1Kg，粉碎，加80%乙醇10L加热回流提取两次，每次提取 2h，合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味(浓缩至v/w≈3～4)，离心， 取上清液，加载到先用乙醇洗去残留溶剂后以纯化水为初始溶剂的聚酰胺层析 柱上(柱体积1L)，上样流速为每小时1个柱体积；然后，先用纯化水洗脱3 个柱体积，再用50%乙醇洗脱5个柱体积，洗脱流速为每小时2个柱体积，收 集50%乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得到水黄皮总黄酮提取物13.6g，以水黄 皮素为对照品(制备方法如下文实施例2所述，纯度为99.5%)，在260nm波 长下，经紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量以水黄皮素计为53.2%；以高 效液相色谱法(色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇 -0.2%HAc(43:57)；流速：1ml/min；检测波长：260nm)测定总黄酮提取物 中水黄皮素含量为13.1%。

【实施例2】水黄皮素的制备及含量分析

取实施例1获得的水黄皮总黄酮提取物10g，加50mL乙醇加热溶解后，缓 缓加入水100mL，离心，取上清液加载到已用40%平衡好的反相硅胶层析柱上； 以40%乙醇洗脱，薄层色谱检视洗脱液，收集含水黄皮素的流份，减压干燥得 到水黄皮素粗品2.7g，将水黄皮素粗品以无水乙醇溶解后，加水至乙醇浓度约 为10%，放置，重结晶，得到水黄皮素2.3g，以高效液相色谱法(色谱柱：以 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.2%HAc(43:57)；流速： 1ml/min；检测波长：260nm)测定提取物中水黄皮素含量为98.2%。

【实施例3】水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素的体外抗流感病毒作用

毒株：甲型流感病毒(A/PR/8/34H1N1)，购自中国典型微生物保藏中 心。

细胞模型：狗肾细胞系MDCK,购自上海博研生物科技有限公司；培养条 件:DMEM+10%胎牛血清，37℃，5%CO₂。

药物的细胞毒性检测：采用了(Invitrogen)试剂盒检测药物对 细胞的毒性作用。实验原理：是一种氧化还原指示剂，能根据代谢 活性产生吸光度变化和荧光信号。易溶于水,其氧化形式进入细胞后 经线粒体酶还原产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定 量分析以及体外细胞毒性研究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转 换成荧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性， 对应的信号较低。因此荧光信号强弱，可以反映细胞活性的高低。

方法步骤：MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细 胞维持液(DMEM+5%血清)将药物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯 度，每浓度梯度单孔检测。加药培养72h后，光镜下观察药物引起的细胞病变 效应(CPE)，加入37℃孵育2h，荧光检测的还原 情况，激发光570nm，发射光595nm。

细胞活性(%)=(样品孔-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100%

药物对流感病毒的抑制试验：鉴于基于病毒引起的细胞病变效应检测不够 灵敏和不便于定量分析。本发明采用检测流感病毒神经氨酸酶活性来代表病毒 的复制水平。实验原理：流感病毒神经氨酸酶(NA)，又称唾液酸酶，是一种 表面糖蛋白，具有酶活性，对A、B型流感病毒的复制有重要作用。它可以裂解 细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，帮助子代病毒粒子的释放，并防止 病毒粒子聚集，促进病毒的扩散。神经氨酸酶是抗流感病毒药物研发的重要靶 点。本发明采用MUNANA作为底物检测流感病毒NA活性。MUNANA (4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate)是流感病毒NA的特异性底物， 在NA作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光， 荧光强度的变化，可以灵敏反映神经氨酸酶活性。病毒感染细胞并加药培养一 定时间后，取培养液上清进行神经氨酸酶活性检测，在反应底物过量时，酶促 反应的速度与酶浓度是呈正比的，所以根据此原理可以检测NA酶活来反映上 清中病毒粒子的滴度。

方法步骤：

(1)细胞铺板：将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中备用。

(2)病毒感染细胞：药物从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯 度；将孔板中培养基弃去，同时加入药物和病毒液于细胞孔中，37℃细胞培养 箱中孵育1h后，弃上清培养基，PBS洗涤后，再次加入梯度稀释药物。置于37℃ 细胞培养箱培养48h，辅以观察细胞病变(CPE)。取培养液上清进行神经氨酸 酶活力检测。

实验设空白对照孔(正常细胞)，酶活对照孔(病毒感染后未加药物孔)，阳 性药物对照孔（感染后加利巴韦林）。

（3）神经氨酸酶活性检测：

实验操作：96孔黑色微量板中加入20μL底物（MUNANA），吸取病毒培 养液40μL上清加入孔板中，避光置于37℃孵育60min，加入100μL终止液/孔 终止反应，多功能检测仪上测定荧光值。激发波长为：355nm，发射波长485nm。 计算各检测孔中NA被抑制率。

抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照）/（酶活对照-空白对照）×100%

结果:

药物样品贮存浓度，最高毒性测试浓度，最高活性测试浓度，CC₅₀，EC₅₀以及SI(选择指数)如表1所示。

表1.各药物样品实验结果

不同孔板中阳性药物利巴韦林的细胞毒性和对流感病毒的抑制作用如图2 所示。水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素的MDCK细胞毒性及对流感病毒H1N1 的抑制作用如图3所示。

结论：水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素对甲型流感病毒感染的MDCK细胞 具有很好的抗流感病毒作用。

【实施例4】水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素小鼠体内抗H1N1病毒作用

小鼠H1N1病毒感染：昆明小鼠80只，共分为8组，每组10只，雌雄各 半。各组小鼠（除第一组正常对照组外）分多次经鼻腔滴注H1N1病毒液0.05mL （10⁵XTCID₅₀），滴注2h后进行第一次灌胃给药。

药物治疗试验：经鼻腔滴注H1N1病毒液0.05mL（105EID50），滴注2h 后进行第一次灌胃给药。第一组为正常对照组，注射同等剂量的细胞维持液 0.1mL，灌胃生理盐水；第二组为病毒感染对照组，灌服生理盐水；第三组为水 黄皮总黄酮提取物低剂量组（1mg/mL）治疗组；第四组为水黄皮总黄酮提取物 中剂量组(10mg/mL)治疗组；第五组为水黄皮总黄酮提取物高剂量组 (100mg/mL)治疗组；第六组为水黄皮素低剂量组(1mg/mL)治疗组；第七组 为水黄皮素中剂量组(10mg/mL)治疗组；第八组为水黄皮素高剂量组 (100mg/mL)治疗组。每天一次，每次0.2mL。观察动物感染后的发病症状。 各组小鼠分别于给药后第五天和第十天各处死一半，并无菌操作取肺。每个小 鼠肺样品的1/2用于感染性病毒分离，剩余1/2肺样品用于H1N1病毒核酸的检 测。

检测方法：肺中感染性H1N1病毒的分离、鉴定。取上述H1N1病毒感染 后的1/2小鼠肺匀浆，用含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的MDCK细 胞培养液制成混悬液，取0.1mL感染MDCK细胞，37℃、5%CO₂吸附2h(每 隔30min振荡一次)，弃去上清液，加细胞维持液，37℃、5%CO₂培养箱培养。 与倒置显微镜下连续观察6天，出现CPE者为阳性，冻融3次后进行病毒滴定， 并采用RT-PCR进行鉴定。未出现CPE(细胞病变)者经盲传3代仍无CPE者 视为分离阴性，弃去。肺组织中H1N1病毒核酸检测。取上述H1N1感染后的剩 余1/2小鼠肺，抽提组织中RNA，同法抽提H1N1病毒RNA，分别进行RT-PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色，紫外灯下观察，与分子量标准品对照， 在110bp处出现条带者为阳性。

实验结果：MDCK细胞分离病毒结果显示，接种于培养板的各组小鼠组织 病毒提取液均不能使细胞发生病变，将细胞盲传3代，细胞生长状态良好，无 病变发生。H1N1核酸检测结果显示，病毒对照组、低剂量组结果呈阳性，空白 对照组、中剂量组和高剂量组结果呈阴性，在中剂量浓度(10mg/mL)下，水黄皮 总黄酮提取物及水黄皮素能够抑制H1N1在小鼠肺细胞中的感染和繁殖。

【实施例5】水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在鸡体内抗H1N1亚型禽流感病 毒的作用

SPF鸡购自广东新兴大华农SPF鸡实验动物中心；H1N1病毒购自中国典型 微生物保藏中心。

1、实验方法

水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素防治10周龄SPF(Specific Pathogen Free， 无特定病原)鸡感染H1N1亚型禽流感病毒的实验共分9组：

第1组为正常对照组，不感染病毒，不给药，共计20只SPF鸡。

第2组是感染对照组，H1N1亚型禽流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌 肉注射0.2mL；感染后，不给任何药物，共计20只10周龄SPF鸡。

第3组是双黄连口服液对照组，共计30只10周龄SPF鸡，H1N1亚型禽流 感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予15mL/Kg体重剂量 的双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司生产，批号：11041003)， 每天集中饮水一次，连用7天。

第4组是水黄皮总黄酮提取物低剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡， H1N1亚型禽流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予 0.5mg/Kg体重剂量的水黄皮总黄酮提取物，每天集中饮水一次，连用7天。

第5组是水黄皮总黄酮提取物中剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡， H1N1亚型禽流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予 10mg/Kg体重剂量的水黄皮总黄酮提取物，每天集中饮水一次，连用7天。

第6组是水黄皮总黄酮提取物高剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡， H1N1亚型禽流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予 20mg/Kg体重剂量的水黄皮总黄酮提取物，每天集中饮水一次，连用7天。

第7组是水黄皮素低剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡，H1N1亚型禽 流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予0.5mg/Kg体重剂 量的水黄皮素，每天集中饮水一次，连用7天。

第8组是水黄皮素中剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡，H1N1亚型禽 流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予10mg/Kg体重剂 量的水黄皮素，每天集中饮水一次，连用7天。

第9组是水黄皮素高剂量治疗组，共计30只10周龄SPF鸡，H1N1亚型禽 流感病毒剂量为105EID50/0.1mL，肌肉注射0.2mL；同时给予20mg/Kg体重剂 量的水黄皮素，每天集中饮水一次，连用7天。

2、评价方法

连续观察14d，记录鸡的死亡数，并计算死亡率，平均存活时间。在感染后 1、3、5、7、10和14d采集鸡泄殖腔、喉头棉拭子，采集的棉拭子用灭菌生理 盐水配成10-1～10-8悬液，尿囊腔接种在9～10日龄SPF鸡胚内，37℃孵育48h， 按照微量红细胞凝集法，检查鸡胚尿囊液中血凝活性。如有血凝活性，通过血 凝抑制试验在排除新城疫病毒感染的前提下，说明有禽流感病毒存在。

3、实验结果

感染后，各组鸡的病毒感染情况检测结果如表2所示，在整个实验过程中， 水黄皮总黄酮提取物和水黄皮素不同剂量的治疗组均无死亡，捕杀后解剖检验， 未见任何异常；试验结束后各治疗组存活鸡的病毒感染情况检测结果均为阴性。 说明不同浓度的水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素在体内对H1N1亚型禽流感病 毒均有很好的抑制作用。

表2感染后不同时间采集各实验组鸡咽喉及泄殖腔拭子的病毒感染情况

【实施例6】水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素的制剂制备方法

(1)水黄皮总黄酮提取物片剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮总黄酮提取物与聚维酮分散均匀，加入微晶纤维素、交联 羧甲基纤维素钠，混匀，压片，以16%(w/w)欧巴代全水包衣液包衣，即得水 黄皮总黄酮提取物的片剂。

（2）水黄皮总黄酮提取物颗粒剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮总黄酮提取物、糖粉、糊精分别过100目筛，混匀，加入 50%乙醇，制成软材，过筛制粒，60℃干燥，整粒后用复合膜袋分装。即得水黄 皮总黄酮提取物的颗粒剂。

（3）水黄皮总黄酮提取物胶囊剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮总黄酮提取物与淀粉均匀，加入碳酸钙，混匀，过100目 筛，装胶囊，即得水黄皮总黄酮提取物胶囊剂。

（4）水黄皮素片剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮素与聚维酮分散均匀，加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维 素钠，混匀，压片，以16%（w/w）欧巴代全水包衣液包衣，即得水黄皮素的片 剂。

（5）水黄皮素颗粒剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮素、糖粉、糊精分别过100目筛，混匀，加入50%乙醇， 制成软材，过筛制粒，60℃干燥，整粒后用复合膜袋分装。即得水黄皮素的颗 粒剂。

（6）水黄皮素胶囊剂的制备方法

处方：

制法：将水黄皮素与淀粉均匀，加入碳酸钙，混匀，过100目筛，装胶囊， 即得水黄皮素胶囊剂。