口腔疾患的预防或治疗剂

摘要

本发明提供一种口腔疾患的预防及/或治疗剂，是把从卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下(1)～(6)所有性质的1种或2种以上的乳酸菌作为有效成分，(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力；(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力；(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性；(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用；(5)没有感染性心内膜炎的致病性；(6)没有龋齿性。采用本发明，可以抑制由口腔细菌引起的挥发性硫黄化合物的产生，且没有龋齿性及感染性心内膜炎的致病性，可有效安全地预防及/或治疗口腔疾患。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预防、改善及/或治疗龋齿症、牙周病、口臭等口腔疾患或不适症状的口 腔疾患的预防或治疗剂。

背景技术

从看不见的审美角度而言，口臭在影响舒适的个人生活及社会生活方面有着重要意义。 根据针对口臭对口腔QOL(quality of life：生活质量)的影响进行定 量测试的报告显示，这种影响甚至大于形态审美因素(非专利文献1)。并且，在快速进入老 龄化社会的日本，口臭还有可能让老年人的护理变得更加困难(非专利文献2)。

口臭的主要原因是硫化氢、甲硫醇、二甲基硫醚这3种挥发性硫黄化合物(VSC)(非 专利文献3、4)。VSC是由于口腔内剥离的上皮细胞及白血球残骸、食物等中包含的半胱 氨酸、蛋氨酸等被口腔细菌分解而产生的。据资料报道(非专利文献5)，在使用口腔细菌进 行的培养试验中，梭杆菌属、卟啉单胞菌属、小韦荣球菌属及螺旋菌等牙周病原菌会产生大 量的VSC。另外，从口腔内分离出的olis乳酸杆菌(Lactobacillus o lis)也具有很强的产生VSC的能力。另据资料报道(非专利文献6)，VSC除本身具 有强烈的难闻气味外，即使在低浓度状态下也对活体组织有毒性，所以它不仅仅是一种形成 口臭的诱因物质，还很可能是导致牙周病病情加剧的因素。因此，抑制由口腔细菌、尤其是 牙周病原菌产生的VSC，预防或改善口臭的产生，不仅能提高QOL，在保持口腔健康方 面也具有非常重要的意义。

近年来，益活菌技术也被尝试着利用到口腔内，例如，有报道称，唾液乳酸杆菌(La ctobacillus salivarius)TI2711株(专利文献1)在口臭、 龋齿症、牙周病、口腔内感染症等方面有效。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本发明专利特许第4203855号公报

非专利文献

非专利文献1：日公卫志49、2002、p298

非专利文献2：(财)医疗经济研究机构平成7年度调查研究报告

非专利文献3：Arch Oral Biol16、1971：587-597

非专利文献4：Int.Dent.J28、1978：309-319

非专利文献5：口腔卫生会志51、2001、p778-792

非专利文献6：新泻齿学会志32、2002、p309-310

非专利文献7：J Med Microbiol39、1991：179-182

非专利文献8：Eur J Clin Microbiol Infect Dis 24、2005：31-40

非专利文献9：Journal of Infection53、2006：e5- e10

发明内容

发明要解决的课题

但另一方面，口腔内的乳酸杆菌属及链球菌属细菌被认为有可能是导致龋齿及感染性心 内膜炎的原因之一。表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)是已 知的龋齿细菌，其有害性超过了变形链球菌(Streptococcus mutans )，是在临床领域作为导致龋齿的原因而受到关注的细菌。此外据资料报道，最经常被检测 出的感染性心内膜炎的成因微生物为血链球菌(Streptococcus sangu inis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)等口腔内的链球 菌属细菌(非专利文献7)，在乳酸杆菌属细菌中，也存在诱发心内膜炎的菌株(非专利文献 8、9)。

因此，为使口腔内菌群健全化而使用的细菌最好能够抑制VSC的产生，并且没有龋齿 性及感染性心内膜炎致病性，但至今为止还没有报道过发现具有这些性质的安全菌种。

因此，本发明的课题是，提供一种新型乳酸菌株以及利用该菌株预防、改善及/或治疗口 腔疾患或不适症状的口腔疾患的预防或治疗剂，其能够抑制由口腔细菌引起的挥发性硫黄化 合物的产生，并且没有龋齿性及感染性心内膜炎致病性，在口腔内是安全的。

解决课题的方法

本发明人通过专心对口腔内微生物的研究发现，属于卷曲乳杆菌(Lactobaci llus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus ferm entum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓症链球 菌(Streptococcus mitis)等的特定乳酸菌，与齿面及口腔内细胞的 粘合性非常高，具有阻碍口臭成因菌的牙周病原菌增殖的作用，能够抑制VSC的产生，并 且乳酸菌本身不会产生VSC及非水溶性葡聚糖。此外还进一步发现，该乳酸菌没有龋齿性 及感染性心内膜炎致病性，是可用于口腔内菌群健全化的有用细菌，由此完成了本发明。

也就是说，本发明提供一种口腔疾患的预防或治疗剂，是把从卷曲乳杆菌(Lacto  bacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus f ermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓 症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下(1)～(6 )所有性质的1种或2种以上的乳酸菌作为有效成分。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明还提供一种口臭预防及/或改善剂，是把从卷曲乳杆菌(Lactobac illus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fer mentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓症链 球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下(1)～(6)所 有性质的1种或2种以上的乳酸菌作为有效成分。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明提供的是，被命名为卷曲乳杆菌(Lactobacillus cri spatus)YIT12319、作为FERM BP-11500被提交保藏的乳酸菌，被命名为发 酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、作为FER M BP-11501被提交保藏的乳酸菌，被命名为加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321、作为FERM BP-11502被提交保藏的乳酸菌，或被命名 为缓症链球菌(Streptococcus mitis)YIT12322、作为FERM B P-11503被提交保藏的乳酸菌。

此外，本发明提供的是，含有上述乳酸菌的饮食品。

同时本发明还提供，含有上述乳酸菌的口腔用组成物。

此外，本发明提供的是，在口腔疾患的预防或治疗剂的制造中，使用从卷曲乳杆菌(L actobacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacil lus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasse ri)及缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下 (1)～(6)所有性质的1种或2种以上的乳酸菌。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明提供的是，在口臭预防及/或改善剂的制造中，使用从卷曲乳杆菌(Lac tobacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillu s fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri )及缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下(1 )～(6)所有性质的1种或2种以上的乳酸菌。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明还提供一种预防及/或治疗口腔疾患的方法，是把从卷曲乳杆菌(Lact obacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及 缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并以具有以下(1)～ (6)所有性质的1种或2种以上的乳酸菌的有效量配给患者。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明还提供一种口臭的预防及/或改善方法，是把从卷曲乳杆菌(Lactob acillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus f ermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓 症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并以具有以下(1)～( 6)所有性质的1种或2种以上的乳酸菌的有效量配给患者。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明还提供一种乳酸菌，用于预防及/或治疗口腔疾患，该乳酸菌是从卷曲乳杆 菌(Lactobacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactoba  cillus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus ga sseri)及缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具 有以下(1)～(6)所有性质的1种或2种以上。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

本发明还提供一种乳酸菌，用于预防及/或改善口臭，该乳酸菌是从卷曲乳杆菌(Lac tobacillus crispatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillu s fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri )及缓症链球菌(Streptococcus mitis)中选出的、并具有以下(1 )～(6)所有性质的1种或2种以上。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外，本发明还提供一种引物或探头，其是针对从序列编号4～8中选出的碱基序列或由 在该碱基序列上相辅相成地排列而形成的卷曲乳杆菌(Lactobacillus cr ispatus)YIT12319(FERM BP-11500)具有特异性。

此外，本发明还提供一种引物对，其是针对从序列编号4和8、序列编号5和8、序列编号6 和8、序列编号7和8中选出的碱基序列或由在该碱基序列上相辅相成地排列而形成的卷曲乳杆 菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319(FERM BP -11500)具有特异性。

且本发明还提供一种以使用上述引物、引物对或探头为特征的卷曲乳杆菌(Lacto  bacillus crispatus)YIT12319(FERM BP-11500)的检测方 法。

发明的效果

本发明的乳酸菌可稳固停留在齿面及口腔内，具有阻碍龋齿病原菌及口臭成因菌的牙周 病原菌增殖的作用，另一方面又没有产生VSC的能力，没有产生非水溶性葡聚糖的能力， 没有龋齿性及感染性心内膜炎的致病性，所以能有效用于增进口腔内菌群健全化，对龋齿症 、牙周病、口臭等各种口腔疾患或不适症状起到预防、改善或治疗效果的药物、饮食品、宠 物食品、口腔内组成物。

附图说明

图1是表示与YIT12319～12321接触的牛牙釉质硬度变化的图。

图2是表示从与YIT12319～12321接触的牛牙釉质中回收的生物膜中非水溶性葡聚糖量 的图。

图3是表示与YIT12322接触的牛牙釉质硬度变化的图。

图4是表示从与YIT12322接触的牛牙釉质中回收的生物膜中非水溶性葡聚糖量的图。

图5是表示与YIT12321接触的牛牙釉质硬度变化的图。

图6是表示YIT12321蔗糖同化性的图。

图7是表示在YIT12319上被特异性的引物对放大了的DNA条带的图(箭头标识的是特 异DNA条带，其旁边是使用的引物对)。

具体实施方式

作为用于本发明的乳酸菌，有属于卷曲乳杆菌(Lactobacillus cri spatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、加 氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及缓症链球菌(Strept ococcus mitis)的乳酸菌株，也可以是上述菌株中的1种或2种以上。

具体包括，被命名为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus )YIT12319、于2011年4月28日(下同)作为FERM BP-11500被保藏在独立行政法人 产品评价技术基础机构专利生物保藏中心(地址：茨城县筑波市东1-1-1中央第6)的乳 酸菌，被命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT 12320、作为FERM BP-11501被保藏的乳酸菌，被命名为加氏乳杆菌(Lactoba cillus gasseri)YIT12321、作为FERM BP-11502被保藏的乳酸菌 ，被命名为缓症链球菌(Streptococcus mitis)YIT12322、作为F ERM BP-11503被保藏的乳酸菌等。该乳酸菌中还包括，将上述乳酸菌作为母株的子孙 株(自然变异株、经变异处理的变异株、基因操纵得到的变异株等)。

上述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319( FERM BP-11500)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentu m)YIT12320(FERM BP-11501)、加氏乳杆菌(Lactobacillus g asseri)YIT12321(FERM BP-11502)及缓症链球菌(Streptoco ccus mitis)YIT12322(FERM BP-11503)如下述实施例所示，是本发 明人首次从人口腔内分离出的，通过16S-rDNA基因序列进行相同性检索的结果，判定 它们属于卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌或缓症链球菌的菌株。由于这些乳酸菌株具 有以下(1)～(6)的特征性质，所以被判明为新型菌株。

(1)不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力

(2)不具有产生非水溶性葡聚糖的能力

(3)对齿面及/或口腔内细胞具有粘合性

(4)具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用

(5)没有感染性心内膜炎的致病性

(6)没有龋齿性

此外、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321(F ERM BP-11502)还被确认具有以下(7)的性质。

(7)不与蔗糖同化

在本说明书中，(1)“不具有产生挥发性硫黄化合物(VSC)的能力”是指，在下述实 施例所示的试验(试验例2)中，产生VSC的能力为+/-(H₂S＜0.70μg/10ml/O.D .，CH₃SH＜1.17μg/10ml/O.D.)，更好的情况为-值(在检测下限值以下)。具有该 性质(1)的乳酸菌，其不产生属于口臭诱因物质，且不产生作为可以使牙周病病情加剧因素 的VSC这一特点是令人满意的。

此外，在本说明书中，(2)“不具有产生非水溶性葡聚糖的能力”是指，在下述实施例 所示的试验(试验例3)中，产生非水溶性葡聚糖的能力为+/-(菌体产生附着)，更好的情 况是为-(不产生)。具有该性质(2)的乳酸菌，其不产生成为龋齿原因的非水溶性葡聚糖这 一特点是令人满意的。

此外，在本说明书中，(3)“对齿面具有粘合性”是指，在下述实施例所示的试验(试 验例5)中，对S-HA的粘合率在1.0％以上，更好的情况是达到10％以上。此外，在本说明 书中，(3)“对口腔内细胞具有粘合性”是指，在下述实施例所示的试验(试验例6)中，对 口腔内的细胞粘合性为Total30cells/0.16mm²以上。在该性质(3)中，对齿 面或口腔内细胞有粘合性的乳酸菌，其通过口服的形式摄入时即使停留时间较短也容易在口 腔中固定这一特点是令人满意的，从同样的角度出发，对齿面或口腔内细胞具有粘合性的乳 酸菌更加理想。

此外，在本说明书中，(4)“具有阻碍口臭成因菌及/或牙周病原菌增殖的作用”是指， 在下述实施例所示的试验(试验例7)中，抑菌环径(直径)的合计达到9mm以上。具有该性 质(4)的乳酸菌，其对口臭及/或牙周病等具有优异的预防·治疗效果这一特点是令人满意 的。

此外，在本说明书中，(5)“没有感染性心内膜炎致病性”是指，在下述实施例所示的 试验(试验例8)中，老鼠心内膜炎致病性为阴性。具有该性质(5)的乳酸菌，其安全性极 高，非常适合用于饮食品、口腔用组成物等。

此外，在本说明书中，(6)“没有龋齿性”是指，在下述实施例所示的试验(试验例9 )中，利用人工口腔装置进行的试验后，牛牙釉质的硬度下降比例不到5％。具有该性质(6 )的乳酸菌，其不会产生成为龋齿原因的非水溶性葡聚糖，不会让珐琅质脱落这一特点是令 人满意的。

此外，在本说明书中，(7)“不与蔗糖同化”是指，在下述实施例所示的试验(试验例9 )中，蔗糖不能作为菌的增殖基质被利用。具有该性质(7)的乳酸菌，其不易产生乳酸，且 能够降低龋齿风险这一特点是令人满意的。

在本发明中，上述乳酸菌的菌体不仅可以使用从按照常用乳酸菌培养方法培养而得到的 培养物中经离心分离等集菌方法分离出来的产品，还可以使用培养结束后的乳酸菌培养物本 身，或使用将培养基浓缩后的浓缩物。此外，除活菌体外，还可以使用菌体的处理物。该处 理物只要是通过常用方法处理得到的，就没有特殊限制，例如可以是：加热处理、利用抗生 物质等进行的药物处理、使用福尔马林等化学物质进行的处理、紫外线处理、γ线等放射线 处理的死菌体、其冷冻干燥物、含有以上这些的培养物等；利用超声波等产生的细菌裂解液 、酶处理细菌液、通过过滤或离心分离等固液分离法从这些液体中分离出来的固体残渣等； 利用酶或机械方法去除掉细胞壁的处理液、该处理液的浓缩物、它们的稀释物、它们的干燥 物等；利用表面活性剂等对细菌溶解后，利用乙醇等沉淀后得到的核酸含有成分；针对上述 利用超声波等产生的细菌裂解液或酶处理细胞液等，利用各种色谱法分离等方法进行分离· 精制处理得到的产物等。

对于培养乳酸菌的培养基没有特别限制，可以使用各种培养基。

比如，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖等碳素源，磷酸单钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、亚硫 酸钠、硫代硫酸钠、磷酸氨等无机盐类，多价蛋白胨、酵母提取物、玉米浆等有机营养源， 以及除了通常根据需要添加有各种氨基酸、维生素之类的乳酸菌增殖用营养培养基之外，还 可以使用含乳的乳培养基。

至于培养，只要满足菌体生长良好的条件即可。对培养方法没有特殊限制，比如通气培 养、厌氧培养、搅拌培养、振荡培养、静置培养等均可，但考虑到生产率，在好氧条件下静 置培养最为理想。

此外，培养温度通常在10～50℃，最好为25～37℃；培养时间通常在6小时～3天，最好 为8小时～3天。

此外，培养基的pH(25℃)为3～10，最好为5～8。调整培养基pH的缓冲剂可以使用 比如，碳酸、醋酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、乳酸、葡糖酸、酒石酸等有机酸盐，磷酸、 盐酸、硫酸等无机盐，氢氧化钠等氢氧化物，氨或氨水等，可以单独使用也可以2种以上组合 使用。

本发明的口腔疾患预防及/或治疗剂所针对的“口腔疾患”是指，由龋齿病原菌、牙周病 原菌、念珠菌等口腔内病原细菌引起的口腔疾患，比如，龋齿症、牙龈炎、牙周炎等牙周病 、鹅口疮等。其中效果最好的口腔疾患是牙龈炎、牙周炎等牙周病。

龋齿病原菌有，变形链球菌(Streptococcus mutans)、表兄链 球菌(Streptococcus sobrinus)，牙周病原菌有，牙龈卟啉单胞 菌(Porphyromonas gingivalis)、中间普雷沃菌(Prevo tella intermedia)、齿垢密螺旋体(Treponema denti cola)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、伴放线聚生 杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans )、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)等。鹅口疮成因菌 有，白色念珠菌(Candida albicans)等。

本发明的口臭预防及/或改善剂所针对的“口臭成因菌”有，牙龈卟啉单胞菌(Porp  hyromonas gingivalis)、具核梭杆菌(Fusobacteriu m nucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedi a)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、殊异韦荣菌(Vei llonella dispar)等。

如下述实施例所示，本发明的乳酸菌对齿面及口腔内面具有粘合性，相对于口臭成因菌 ·牙周病原菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis) 、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)及伴放线聚生杆菌(A ggregatibacter actinomycetemcomitans)等具有 阻碍增殖的作用。此外，本发明的乳酸菌不产生成为口臭原因的VSC及成为龋齿原因的非 水溶性葡聚糖，而且不会导致珐琅质脱落，也不会诱发感染性心内膜炎。

因此，本发明的乳酸菌能够增进口腔内菌群健全化，可作为对口腔内的病原细菌引起的 龋齿症、牙龈炎、牙周炎等牙周病，鹅口疮，口臭等各种口腔疾患或不适症状起到预防、改 善或治疗作用的药物、饮食品、宠物食品、口腔用组成物等来使用。

作为药物使用时的口服制剂的剂型有锭剂、胶囊剂、颗粒剂、糖锭剂、丸剂、颗粒剂、 散剂、粉剂、缓释制剂、悬浮液、乳剂、糖浆、冻干剂、液剂、酏剂等。

上述制剂可以利用常用方法制造，而且本发明的乳酸菌既可以单独使用，又可以与得到 允许的药物载体一起组合使用。该类载体有乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳 酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂；淀粉、麦芽糊精、阿拉伯树胶粉、食用明胶、 甲基纤维素、羟丙基纤维素、结晶纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等结合 剂；羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素 等崩解剂；月桂基硫酸钠、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、聚山梨醇酯80等表面活性剂；滑石 粉、蜡类、氢化植物油、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝、聚乙二醇等润滑剂；轻质无水硅 酸、氢氧化铝干凝胶、合成硅酸铝、硅酸镁等流动性促进剂；注射用蒸馏水、生理盐水、葡 萄糖水溶液、橄榄油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀释剂等等。 此外，如果有必要还可以适当添加矫味剂、着色剂、香料、杀菌剂、浸透压调节剂、pH调 节剂、乳化剂、助吸收剂、抗氧化剂、增粘剂、张度剂等常用的添加剂。

此外，作为饮食品、宠物食品等使用时，本发明的乳酸菌还可以根据需要添加各种营养 成分，使其含在上述饮食品等中。这类饮食品等可以被用来作为对龋齿症、牙周病、口臭有 预防或改善效果的保健食品或食品材料，并可以在这些饮食品或其容器上标明其具有上述效 果。

至于饮食品的形态等方面，可适当使用可作为饮食品等使用的添加剂，利用常用方法制 成适合食用的形态，比如颗粒状、粒状、锭剂、胶囊、糊状等，也可添加到各种食品，包括 火腿、腊肠等食肉加工品；鱼糕、圆筒状鱼糕等水产加工品；面包、糕点、黄油、奶粉、发 酵饮食品中使用，还可添加到水、果汁、牛奶、软饮料，茶饮料等饮料中使用。在这些产品 中，最为理想的是制成含有乳酸菌有效成分的发酵乳、发酵饮料(乳酸菌饮料)、发酵豆乳 、发酵果汁、发酵植物液等发酵产品，以及锭剂、胶囊等营养补充食品。

发酵产品可以使用常用方法制造。比如发酵乳，在杀菌后的乳培养基中接种和培养乳酸 菌，再对其进行均质化处理就可以得到发酵乳基材。接下来再添加另行调制的糖浆溶液后混 合，利用均质器等进行均质化后，再添加进香味就可以成为最终产品。利用这种方法得到的 发酵乳可以是纯净型、柔软型、水果香味型、固体状、液体状等任何一种形态的产品。

作为口腔用组成物使用时的具体形态包括漱口剂、漱口水、牙膏、牙粉、液态牙膏、口 腔用软膏剂、凝胶剂、锭剂、颗粒剂、微小颗粒剂、果冻、含片、片剂、胶囊、糖果、口香 糖等，其中最好的形态为牙膏、漱口剂、果冻、含片、锭剂、片剂等。

对于上述药物、饮食品、宠物食品、口腔用组成物等中的本发明乳酸菌含量没有特别限 制，可以结合一天的投药量或摄取量进行适当调节，比如剂型为液体时，乳酸菌体浓度达到 1×10⁶CFU/mL～1×10⁸CFU/mL比较好，固体时则达到1×10⁷CFU/g～1×10¹⁰C F U/g比较理想。

使用本发明的乳酸菌时，对投药量或摄取量没有严格限制。若使用对象或适用疾患等各 种使用状态不同，得到的效果也不同，应适当设定，但乳酸菌的菌数希望是1日量中含有1×10³CFU以上，1日量中含有1×10³～1×10¹³CFU的量则更佳，1日量中含有1×10⁶～1×10¹⁰CFU的量最佳。

通过对卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319 及其它卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)基因组DNA的 分析发现，从序列编号4～8中选出的碱基序列相对于卷曲乳杆菌(Lactobacill us crispatus)YIT12319具有特异性，且如果使用具有这些碱基序列的探头 或引物，便发现卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT 12319的基因能特异性地检测出或进行放大。

本发明的探头或引物由从序列编号4～8中选出的碱基序列或在该碱基序列上相辅相成地 排列形成，是针对卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT 12319(FERM BP-11500)菌株有特异性的探头或引物。

作为上述引物，从序列编号4和序列编号5、序列编号4和6、序列编号4和7、序列编号4 和8中选出的碱基序列或在该碱基序列上相辅相成地排列而形成的引物，其针对卷曲乳杆菌( Lactobacillus crispatus)YIT12319(FERM BP-11500 )的特异性越高越好。

使用上述探头或引物，不需要进行生理·生化学性状确认等繁复的操作，只要使用来自 从标本中提取的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT 12319(FERM BP-11500)的DNA，通过PCR反应，就可以迅速简便地对该菌株进 行生物类别确定、分析、检测等操作。

实施例

以下通过实施例对本发明作更加具体的说明，但本发明不仅限于这些实施例。

试验例1口腔细菌的分离

1)被试验者及样品的采集

从56名被试验者(男性34名，女性22名，25～66岁，平均年龄40.6岁)口中分别采集齿 垢(包括唾液)和舌苔。采集这些口腔样品后，在使用前静置于冰上。进行菌分离时，将这 些样品按照等量混合后，将其中300μL添加到2.7mL的灭菌厌氧输送培养基中，制作出10^-1稀释液(好氧·厌氧培养用3.0mL×各1枝)。

2)口腔细菌的培养与分离

在厌氧手套箱中，将口腔样品涂抹到布鲁氏兔溶血平板培养基(BRU平板培养基，色 氨酸10.0g，派普塔明10.0g，酵母提取物2.0g，葡萄糖1.0g，氯化钠5.0g， 酸性亜硫酸钠0.1g，血色素5.0mg，维生素K11.0mg，发育辅助液10.0mL， 兎溶血液60.0mL，琼脂15.0g，pH7.0)上。向一次性试管(FALCON2058)中 分注1.8mL灭菌厌氧稀释液，然后添加200μL的10^-1稀释液制作出10^-2稀释液。以下按照同 样方法直到制作成10^-10稀释液，再将100μL各种稀释液涂抹到平板培养基上后，按照表1所 示的条件进行培养。

另一方面，使用螺旋系统(自动平板涂抹装置)针对加5.0％羊血液的TSA平板培养基 (TSA平板培养基，酪蛋白胨15.0g，豆蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，脱纤维羊血 50.0mL，琼脂15.0g，DW1000mL，pH7.3)、M R S平板培养基(Proteo se Peptone No.3 10.0g，Beef Extract10.0g，Yeas t Extract5.0g，Dextrose20.0g，Polysorbate80 1.0g，Ammonium Citrate2.0g，Sodium Acetate5.0 g，Magnesium Sulfate0.1g，ManganeseSulfate  0.05g，Dipotassium Phosphate2.0g，Agar15g，DW 1000mL)、LBS平板培养基(Pancreatic Digest of Case in10.0g，Yeast Extract5.0g，Monopotassium Ph osphate6.0g，Ammonium Citrate2.0g，Dextrose 20.0g，Polysorbate801.0g，Sodium Acetate Hydr ate25.0g，Magnesium Sulfate0.575g，Manganese  Sulfate0.12g，Ferrous Sulfate0.034g，Agar15.0 g，Lab-lemco powder(Oxoid)8g，Sodium aceta te，trihydorate15g，DW1000mL Acetate3.7mL)、及 Mitis-Salivarius平板培养基(MS平板培养基，Bacto Tryp tose10g，Bacto Proteose Peptone No.35g，Bac to Proteose Peptone5g，Bacto Dextrose1g， Bacto Saccharose50g，Dipotassium Phosphat e4g，Trypan Blue0.075g，Bacto Crystal Viole t0.0008g，Bacto Agar15g DW1000mL，pH7.0±0.2)等涂抹样 品后，按照表1所示的条件进行培养。

【表1】

平板培养基及培养方法

^aGB：在厌氧手套箱进行培养

^bGP：使用AnaeroPack厌氧系统(三菱瓦斯化学)进行培养

在各种平板培养基中繁殖的口腔内细菌数如表2所示。

在MRS、MS及LBS平板培养基方面，按照涂有高稀释率稀释液的平板培养基的顺 序，从形态不同的菌落中进行钓菌，用MRS或BHI液体培养基(小牛脑浸取物12.5g ，牛心肌浸取物5.0g，示蛋白胨10.0g，葡萄糖2.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠 2.5g，DW1000mL，pH7.4±0.2)进行增殖后，在2×BHI∶丙三醇甘油＝1∶1的 溶液中悬浮，在-80℃环境下保存，供以下的试验使用。

【表2】

在各种平板培养基中繁殖的口腔内细菌数

*BRU：总厌氧菌、TSA：总通性厌氧菌、MRS：乳酸菌、Bifidobacterium、MS：Streptococcus 属、LBS：Lactobacillus属

试验例2对产生VSC能力的评价

使用的是通过试验例1分离出来的冷冻保存菌株。此外，作为阳性对照株使用的是具核梭 杆菌(Fusobacterium nucleatum)YIT6069。

将上述的分离菌株接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下进行24小时厌氧培养。取 0.04mL该菌体的培养液在4mL包括1％D-(+)-葡萄糖，66mM DL-蛋氨酸( 终浓度500-1,500μM)的变法GAM液体培养基(蛋白胨5.0g，豆蛋白胨3.0g，示 蛋白胨5.0g，消化血清粉10.0g，酵母提取物粉2.5g，肉提取物粉2.2g，肝脏提 取物粉1.2g，葡萄糖0.5g，溶性淀粉5.0g，L-色氨酸0.2g，L-半胱氨酸盐 酸盐0.3g，巯基乙酸钠0.3g，L-精氨酸1.0g，维生素K15mg，血色素10 mg，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3.0g，DW1000mL，pH7.3)中作再次培养，在 37℃条件下进行厌氧培养。培养开始24小时后，在培养液里添加0.16mL的6.0N盐酸溶液将 pH降到1以下，使菌体的物质代谢停止。

其后，使用气相色谱分析仪或0ralChroma^TM便携式气相色谱仪对在顶空气相中挥发的挥发 性硫黄化合物(VSC)进行分析。然后与在37℃条件下24小时厌氧孵化的培养基进行阴性 对照。

试验例3对产生非水溶性葡聚糖能力的评价

在BHI或MRS液体培养基中对通过试验例1分离出来的冷冻保存菌株进行2白金耳接 种后，在37℃条件下进行24小时厌氧培养。取0.04mL该菌体的培养液在含1％蔗糖的HI( 牛心肌浸取物5.0g，示蛋白胨10.0g，葡萄糖2.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠2.5 g，DW1000mL，pH7.4±0.2)，或4mL的MRS+HI混合(7∶3)液体培养基中 作再次培养，将试管倾斜45度在37℃条件下进行厌氧培养。

产生非水溶性葡聚糖的能力，是通过附着到试管壁上的葡聚糖量及其附着强度来进行评 价的。培养24小时后，从试管中去除掉培养液，加进PBS4mL后平缓地转3圈将管壁洗 干净。去掉PBS后，按照表3的基准，目测判断附着在试管壁上的非水溶性葡聚糖量。

试验例2及3的结果如表3所示。从通过试验例1分离出来的冷冻保存菌株中，选出表3中虚 线所围的共计241株菌株。这其中，有从MRS及MS培养基中单独分离出来的链球菌様细菌 176株，从LBS培养基中单独分离出来的似乳酸杆菌细菌65株。

此外，作为阳性对照株的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleat um)YIT6069，根据蛋氨酸添加量产生出VSC。

【表3】

分离菌株的产生VSC的能力和产生非水溶性葡聚糖的能力(表中的数字表示菌株数)

1.产生VSC能力；-，低于检测下限值+/-，(H₂S＜0.70μg/10ml/O.D.、CH₃SH＜1.17μg/10 ml/O.D.)、+，产生

2.产生非水溶性葡聚糖的能力；-，不产生，+/-，附着在齿体上，+，产生

试验例4菌种的生物类别确定

通过氯化苄法提取出DNA。对培养后的菌体进行830×g、10分钟离心分离得到菌体。 在该菌体中加入200μL DNA Extraction缓冲液、400uL氯化苄、300 mg玻璃珠(直径0.1mm)。使用Fast Prep样品处理系统进行振荡后(速度6.5， 30秒钟)，在通过离心分离(20,000×g，5分钟，4℃)得到的上清液中添加当量的异丙醇 后进行充分搅拌。通过离心分离(20,000×g，10分钟，4℃)去除掉上清液后，添加进150μ L的70％乙醇，将再次离心分离后得到的沉淀风干，溶解到适量的TE(Tris-EDT A)中。至于PCR反应液，在全量25μL中，DNA作到3.2μL的10×PCR buff er(1×PCR buffer＝10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KC l，1.5mM Mg Cl₂)，2.5uL的2.5mM dNTP(deoxynucleoti de triphosphate)，0.5μL的25pmol/μL primers(Fo rward primer63F；序列编号1、Reverse primer15R；序 列编号2)，0.5units的DNA Taq polymerase(Takara E x Taq hotstart)，1uL的10ng/mL template。PCR反应 是按照94℃，20秒，(94℃，20秒，55℃，20秒，72℃，90秒)×30cycles，72℃3 分钟。通过染料终止法决定分离株的16S-rDNA碱基序列。排列反应用的引物使用的是 520R(序列编号3)，与在日本基因数据库(DNA Data Bank of Jap an)中登记的菌种序列进行同源比较，将具有98％以上类似性的作为同一种。使用的引物 如表4所示。在真细菌及古细菌的16S-rDNA中，其两端或内部里有10处左右是高度保存 的领域，使用按照63F、15R及520R等序列设计的引物，可以不论细菌的种类，对基因进行 放大或对序列进行分析。

【表4】

引物的特性

针对通过试验例2及3选出的241株，使用16S-rDNA碱基序列对菌种进行生物类别确 定的结果显示，链球菌様细菌的生物类别主要确定为口腔链球菌(Streptococc us oralis)、唾液链球菌(Streptococcus salivariu s)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、血链球菌(Strep  tococcus sanguinis)等。此外，在类乳酸杆菌细菌中分离数最多的是 加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。

试验例5对齿面粘合性的评价

在通过试验例2及3结果选出的241株中，根据生物类别确定试验的结果，除被判断为存在 安全性问题的菌株外，都使用到以下的试验中。

样品的调制方法及对羟基磷灰石(H A)的粘合性评价依照Gibbons等方法(G ibbons，R.J.，E.C.Moreno，and D.M.Spinell“Mode l delineating the effect of a salivary p ellicle on the adsorption of Streptococc us mitior onto hydroxyapatit e.”Infect.Im  mun.1976：14：1109-1112)。

将各分离菌株接种到4mL的MRS液体培养基中，进行24小时培养。培养后，进行离心 分离(1,912×g，10分钟，4.0℃)，利用PBS清洗2次。最后将利用PBS稀释到550 nm时的吸光度为1.0的菌液用于HA的粘合性试验。

本试验中使用的唾液是按照以下的方式采集的。用蒸馏水漱口后，咀嚼石蜡口香糖，将 通过上述刺激分泌出的唾液收集在离心管中。为了使其蛋白分解酶失活，在60℃加热30分钟 后，进行离心分离(10,000×g，10分钟，4.0℃)，得到上清液。将5个人的唾液等量混合 后，进行过滤灭菌(0.22μm)，使用前保存在4℃环境中。

利用PBS将5mg羟基磷灰石珠(Bio-Rad40μm)洗净后，添加4mL加热 调制的唾液，在37℃条件下振荡30分钟。振荡后，将利用PBS清洗过2次的小珠子作为唾液 处理的HA(S-HA)。此外，将作为唾液的替代添加进PBS后按照相同条件调制的小 珠子作为PBS处理的HA(P-HA)使用。

将2mL菌液添加进S-HA及P-HA里，在37℃条件下振荡1小时。此外作为对照， 按相同条件仅对菌液进行振荡。反应后在室温中静置10分钟，在新试管里采集1mL上清液。 为了使微小的HA溶解，在上清液里添加100μL的0.1M EDTA，搅拌后在室温中静置1 小时。其后，测试550nm时的吸光度，再根据下式(1)计算出粘合率(％)，即HA小珠 子上粘合的菌比例。

【数1】

结果如表5及6所示。在通过试验例2及3选出的241株中，分类为链球菌属的菌株的76％粘 合到S-HA上。此外，一般来说乳酸杆菌对齿面的粘合性比较低(参见H.J.Bussc  her.“In vitro Adhesion to Enamel and in  ViVo Colonization of Tooth Surfaces by L actobacilli from a Bio-Yoghurt”Caries Re s1999：33：403-404.)，表中是按照发酵乳杆菌(Lactobacillus fe rmentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)等对S -HA粘合性高的顺序排列的。

【表5】

分离菌株(Streptococcus属)不同菌种对S-HA的粘合率比较

a：平均值±标准偏差

【表6】

分离菌株(Lactobocillus属)不同菌种对S-HA的粘合率比较

a：平均值±标准偏差未实施N.D

试验例6对口腔内细胞粘合性的评价

在通过试验例2及3结果选出的241株中，根据生物类别确定试验的结果，排除认为在安全 性上存在问题的菌株，其余都使用到以下的试验中。

1)细胞株的培养

将H O-1-N-1细胞(JCRB0831：来源于人脸颊粘膜扁平上皮癌的细胞，以下略称 为“HO”)及HSC-3细胞(JCRB0623：来源于人舌扁平上皮癌的细胞，以下略称为 “HSC”)在5.0％CO2₂、37℃条件下进行培养。HO细胞使用含有10％牛胎儿血清的D MEM培养基(GIBCO公司11885)，HSC培养基使用含有10％牛胎儿血清的DME M/F12培养基(GIBCO公司11320)。

2)对细胞粘合性的评价

使用含有10％牛胎儿血清的培养基进行悬浮，使细胞达到1.0×10⁵个/mL。将该悬浮液 按照每1舱加200μL的量加到Lab-Tek II腔室载玻片(Nalge Nunc )上，进行48～96小时培养。其后，使用RPMI1640将没有附着到载玻片表面的细胞清洗 、去除掉。利用MRS液体培养基培养一晚后，把活菌数被调整到OD₆₆₀＝0.25后的分离株 ，按照每1舱加200μL的量加入，在37℃条件下孵化10分钟。然后，使用RPMI1640对细 胞清洗3次，去除掉没有粘合到细胞上的菌。对载玻片上的附着物进行革兰氏染色后，使用光 学显微镜对每0.16mm²中含有的细胞上粘合的菌数进行了测量。测量从任意选择的6个视角 进行。

结果如表7和8所示。相对于0.16m m²中含有的细胞，在7株乳酸杆菌属、17株链球菌属 的HO细胞和HSC细胞上合计粘合了10个以上的菌。

卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319、发酵 乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、加氏乳杆菌( Lactobacillus gasseri)YIT12321及缓症链球菌(Strept ococcus mitis)YIT12322的任何一种，每单位面积都有粘合30个以上，具 有极强的粘合性。

【表7】

分离菌株(Lactobacillus属)对口腔内细胞的粘合性

【表8】

分离菌株(Streptococcus属)对口腔内细胞的粘合性

试验例7对阻碍口臭成因菌(牙周病原菌)增殖的评价

根据上述试验例的结果，选出表10及11所示的菌株。作为对象菌株，使用了属于口臭成

因菌及牙周病原菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivali s)ATCC33277、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia) ATCC25611、伴放线聚生杆菌(Aggregatibacter actinomy  cetemcomitans)Y4、属于龋齿病原菌的变形链球菌(Streptoco ccus mutans)ATCC25175、表兄链球菌(Streptococcus s obrinus)ATCC33478。

将分离菌株在4.0mL的MRS液体培养基里进行一白金耳植菌。24小时培养后，进行离 心分离(1,912×g，10分钟，4℃)得到上清液。再使用0.22μm的过滤器对该上清液进行 过滤，将过滤液作为试验样品。用琼脂糖弥散抗菌实验(Radial diffusio n assay)对各样品的抗菌活性进行了测量。在10mL的TS培养基(Trypti c soy broth(Difco)6.0mg，Tween202.0μL，agaros e100mg，H₂O10m L)中添加进100μL各对象菌株的BHI培养液充分搅拌后，在 皿中凝固。培养基凝固后，开一个直径2.5mm的孔，向其中加入5.0μL试验样品。在37℃ 条件下培养1小时后让TS培养基(Tryptic soy broth(Difco) 0.6mg，agarose100mg，H₂O10mL)重叠，在37℃条件下进行培养。培养条 件记载在表9中。培养后，对孔外侧形成的没有发生菌增殖的净区领域(抑菌环径)的直径按 照下式(2)进行了测量。

抑菌环径(mm)＝试验样品的净区直径(mm)-孔直径(mm)  (2)

【表9】

测量阻碍增殖效果时的培养条件及阳性对照

结果如表10及11所示。试验证明，在分离菌株中的乳酸杆菌属培养上清液里，对牙龈卟 啉单胞菌有强烈的阻碍增殖的效果。而且对中间普雷沃菌及伴放线聚生杆菌也有阻碍增殖的 效果。由于在本次的试验中即使培养上清液的pH被调到7.0却仍然存在对牙龈卟啉单胞菌有 阻碍效果的株，因此被认为，这些菌株除了有机酸外，很可能还产生了过氧化氢或细菌素等 抗菌物质。此外还发现、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus )YIT12319，对属于龋齿病原菌的变形链球菌(变形链球菌(Streptococcu s mutans)及表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)) 有阻碍增殖的效果。将培养上清液的pH调整到7.0后进行试验的结果，没有发现阻碍增殖的 效果，因此我们认为，由于变形链球菌(Streptococcus mutans)及 表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)会产生酸，而菌本身具有 耐酸性，所以通过降低pH值来抑制增殖的可能性比较小。故而我们认为，卷曲乳杆菌(L actobacillus crispatus)YIT12319存在着产生过氧化氢或细菌 素等抗菌物质的可能性。

至于链球菌属，我们发现15株培养上清液对口臭成因菌(牙周病原菌)也有阻碍增殖的 效果，但效果强度与乳酸杆菌属分离株相比较弱。由于即使将它们的pH值调整到7.0后仍然 可能会阻碍牙龈卟啉单胞菌的增殖，所以我们认为，与乳酸杆菌属分离菌株一样，它们存在 着产生过氧化氢或细菌素等抗菌物质的可能性。

在卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319、发 酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、加氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)YIT12321及缓症链球菌(Strep tococcus mitis)YIT12322中，抑菌环径(直径)的合计值都达到9mm以 上，显示出强烈的阻碍增殖效果。

【表10】

分离菌株(Lactobacillus属)对口臭成因菌(牙周病原菌)及龋齿细菌的阻碍增殖作用

*Ss；S.sobrinus ATCC33478、Sm；S.mutans ATCC25175、Pg；Pgingivalis ATCC33277、Pi；Pintermedia  ATCC25611、Aa；AggregatibacteractinomycetemcomitansY4、(-)；培养上清液的pH值未调整、(+)；培养上 清液的pH值调整到7.0

【表11】

分离菌株(Streptococcus属)对口臭成因菌(牙周病原菌)及龋齿细菌的阻碍增殖作用

*Ss；S.sobrinus ATCC33478、Sm；S.mutans ATCC25175、Pg；Pgingivalis ATCC33277、Pi；Pintermedia  ATCC25611、Aa；Aggregatibacter actinomycetemcomitans Y4、(-)；培养上清液的pH值未调整、(+)；培养上 清液的pH值调整到7.0

试验例8对使用老鼠实验的心内膜炎样本进行的感染性心内膜炎致病性的评价

根据上述试验例的结果，选出了表12及13所示的菌株。作为阳性对照使用的是心内膜炎 致病菌的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YIT0227 。

试验动物使用的是生后8周龄的Crl：CD(SD)系雄性老鼠102只(日本Charles  River株式会社)。

实验的心内膜炎(非细菌性心内膜炎)动物样本的制作按照以下方式进行。作为麻醉剂 ，是将氯胺酮针剂(含有盐酸氯胺酮50mg/mL)与赛拉嗪(含有盐酸赛拉嗪20mg/mL )按照18∶5的比例混合后，按照2mL/kg的投入量投入到腹腔内。然后在麻醉下切开颈部 皮肤露出右颈动脉，使用外径0.61mm的聚乙烯管(夏目制作所，SP10)经右颈动脉将约 20cm的置管插入并留置在左心室。在制作非细菌性血栓性心内膜炎动物的次日，使用1mL 一次性注射器和注射针27G，按照0.5mL/一只老鼠的当量将菌液投入到尾静脉内。

投入的菌液按照以下方式调制。首先，在4mL的MRS培养基中植菌10μL分离株，在 37℃条件下培养20个小时。再将100μL该培养液植菌到10mL新鲜的MRS培养基里，继续 在37℃条件下培养20个小时。培养结束后，对培养液进行离心分离(1,670×g，10分钟， 4.0℃)去除掉上清液。加入与培养基等量的生理盐水，通过涡旋方式充分搅拌、洗净后，再 次进行离心分离(1,670×g，10分钟，4.0℃)去除掉上清液。上述清洗操作重复三次后， 加入生理盐水稀释到标准菌数(4.0～9.0×10⁶CFU/mL)，作为投入用的菌液使用。

利用生理盐水将在试验菌株投入日的4天后采集的末梢静脉血进行分段稀释，利用混释法 将0.5mL原液及10^-2稀释液1.0mL敷到MRS平板培养基上。在37℃条件下培养3天后，对 平板上繁殖的菌落进行计数，计算出1mL血液中的活菌数。同样利用生理盐水对含有肉赘的 心脏匀浆液进行分段稀释，利用混释法将原液、10^-2、10^-4、10^-6稀释液1.0mL敷到MRS平 板培养基上。在37℃条件下培养3天后，对平板上繁殖的菌落进行计数，计算出活菌数。如果 2块试验皿都没有检测出菌落，则假设认为从其中任何1块试验皿中得到1个菌落，将肉赘重量 除以1得到的数值作为检测的极限值。

结果如表12及13所示。在投入了阳性对照的YIT0227的老鼠中，从血液中为6例中的5 例(1～28CFU/mL)，从肉赘中为所有标本(1.4×10³～1.7×10⁶CFU/heart) 中都检测到投入菌。另一方面，在投入了卷曲乳杆菌(Lactobacillus cr ispatus)YIT12319、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispa tus)LBS17-11、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum )YIT12320及加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321 的老鼠中，从血液和肉赘中都没有检测到投入菌。因此判定，这些菌株对于老鼠的心内膜炎 致病性为阴性。

此外，在投入了缓症链球菌(Streptococcus mitis)YIT12322 的老鼠中，由于没有从血液中检测出投入菌，从肉赘中也只检测出1个标本菌，所以判定为阴 性。在投入了那以外菌株的老鼠中，从所有个体的肉赘中检测出投入菌，检测出的菌数也比 较多(6.2×10⁴～9.4×10⁶CFU/heart)，因此所有株都被判定为阳性。

【表12】

分离菌株(Lactobacillus属)使用老鼠样本进行的感染性心内膜炎致病性试验

A：被检测个体中的平均菌数、b：低于检测极限值

【表13】

分离菌株(Streptococcus属)使用老鼠样本进行的感染性心内膜炎致病性试验

a；被检测个体中的平均菌数

试验例9对使用人工口腔装置的龋齿性的评价

使用的是卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319 、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、加氏乳 杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321，缓症链球菌(Str eptococcus mitis)YIT12322、卷曲乳杆菌(Lactobacill us crispatus)LBS17-11及加氏乳杆菌(Lactobacillus  gasseri)LBS46-52。此外，作为阳性对照使用的是表兄链球菌(Strep  tococcus sobrinus)6715、表兄链球菌(Streptococcus  sobrinus)ATCC33478。

在贮存有分离菌株的试管里或加有4mL MRS培养基的试管里对新鲜的TS培养基进 行3白金耳植菌后，在37℃条件下进行16小时厌氧培养。将4m L该培养液植菌到1L新鲜的T S或MRS培养基里，在37℃条件下进行16小时厌氧培养。对该培养液进行离心分离(4,830× g，20分钟，4℃)后集菌。利用PBS对其清洗后，将再次离心分离出来的菌体在200mL 的PBS中进行悬浮。对其一部分进行取样并利用PBS稀释到1/10后，按照540nm测试其 浑浊度，用PBS将整体调整到OD540＝0.5或1.0。

利用人工口腔装置对该菌液导致的牛牙釉质硬度变化进行了测试。具体而言，是通过设 置在人工生物膜下的pH值表测试了pH值的随时间变化的情况。而牛牙釉质硬度变化是通 过实验前与实验后齿片的维氏(Vickers)硬度变化来求得的。然后将各牛牙釉质切 片在0.5N NaOH(2mL)中在0℃条件下沁浸10分钟，使人工生物膜脱离后进行离心分 离(4,830×g，20分钟)，划分出菌体和上清液(非水溶性葡聚糖划分)。通过菌体在P BS中悬浮后测量的OD540nm浑浊度得到的值，求得每一mm²齿片的菌体量。此外， 通过苯酚(Phenol)硫酸法对上清液中非水溶性葡聚糖量进行了测量。

对于加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321，对利 用人工口腔装置在将菌体浓度和反应时间分别加到2倍的条件下进行的龋齿性进行了评价。

结果如图1～4所示。属于龋齿病原菌的表兄链球菌(Streptococcus s obrinus)6715，在存在蔗糖的条件下与该菌接触20小时的牛牙釉质的硬度与开始 试验前相比较约下降了60～80％(图1、3)。此外，由于从珐琅质中回收到非水溶性葡聚糖 和菌体(图2)，因此认为是该菌在珐琅质表面形成以非水溶性葡聚糖为主体的生物膜，在这 其中产生的酸促进了珐琅质脱落，从而使得硬度下降。

另一方面，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT 12319、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、加 氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321及缓症链球菌(S treptococcus mitis)YIT12322的硬度下降比例，任何一种株都不到5 ％(图1、3)。且从任何一种菌株产生作用的珐琅质中都没有回收到非水溶性葡聚糖(图2 、4)。

对于加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321，在利 用人工口腔装置在将菌体浓度和反应时间分别加到2倍的条件下进行的龋齿性试验的调查结 果如图5所示。由于珐琅质硬度的下降比例与原条件相比程度基本相同(下降4.4％)，因此 可以认为即使过量摄取该菌，诱发龋齿的可能性也比较低。

为了调查牛牙釉质硬度不下降的原因，对加氏乳杆菌(Lactobacillus g asseri)YIT12321的蔗糖同化性进行了调查。蔗糖同化性使用是将ILS液体培养 基(BBL Trypticase Peptone(BD)10g，Yeast Ex tract(BD)5g，Bacto Tryptose(BD)3g，KH₂PO₄3 g，K₂HPO₄3g，(NH₄)₃C₆H₅O₇2g，Lactose20g，L-cyste ine·HCl0.2g，CH₃COONa1g，Tweeen801g，Salt so lution(MgSO₄·7H₂O11.5g/100mL，FeSO₄·7H₂O0.68g/100mL ，MnSO₄·5H₂O2.4g/100mL)5mL，DW1000mL)的乳糖置换成为蔗糖后 的培养基，在37℃条件下进行24小时培养。菌的增殖用按照OD660nm测量的培养液的吸光 度进行表示。

其结果表明，加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YIT12321 不具备使蔗糖产生增殖的基质(图6)。由于加氏乳杆菌(Lactobacillus g asseri)的标准菌株(YIT0192T)可以与蔗糖产生同化，所以可以认为这种性质属 于株的特异性。

通过以上结果可以判断认为，此次试验的分离菌株的卷曲乳杆菌(Lactobaci llus crispatus)YIT12319、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320、加氏乳杆菌(Lactobacillus gass eri)YIT12321及缓症链球菌(Streptococcus mitis)YIT12322 ，不会导致龋齿产生。特别是YIT12321，由于不会与蔗糖同化，所以可以认为它是最为有 用的菌种。

YIT12319，YIT12320，YIT12321及YIT12322属于新型菌株，它们分别以卷曲乳 杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319(FERM BP -11500)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)YIT12320 (FERM BP-11501)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri )YIT12321(FERM BP-11502)及缓症链球菌(Streptococcus m itis)YIT12322(FERM BP-11503)的名称被保藏在独立行政法人产品评价技 术基础机构专利生物保藏中心(地址：茨城县筑波市东1-1-1中央第6)里。

有关在上述试验例2、3及5中获得良好结果的菌株(没有产生VSC和产生非水溶性葡聚 糖的能力，对齿面有粘合性的菌株)，其试验例6及9的结果(一览)如表14所示。本发明人 通过对约1600株从口腔内分离出来的微生物进行潜心研究，发现只有4个菌株具有本发明的( 1)～(6)所有性质的乳酸菌，确认到具有这种特异性质的乳酸菌在用于预防或改善各种口 腔疾患或不适症状的饮食品、口腔用组成物等方面是极为有用的。

【表14】

①粘合性：试验例6的结果(Total cells/0.16mm²)为30以上…○，不到30…×

②阻碍增殖：试验例7的结果(抑菌环径合计)为9mm及以上…○，9mm以下…×

③致病性：试验例8的结果(感染性心内膜炎致病性)为阴性…○，阳性…×

④硬度变化：试验例9的结果(牛牙釉质的硬度变化)5％以下…○，5％以上…×

试验例10对人口腔内环境改善效果的验证

为了调查摄取本发明的乳酸菌卷曲乳杆菌(Lactobacillus crisp atus)YIT12319对口腔内环境的效果，以17名有口臭的被试验者为对象，让其连续4 周按照1日1次3粒的量，摄取每粒含有3.3×10⁸cfu以上活菌的试验食品。

在试验食品摄取期的开始日(0周)及摄取第4周，从被试验者口中采集刺激唾液(咀嚼 石蜡口香糖5分钟后分泌出的唾液)，测得了以下的口腔内细菌数。

牙周病原菌量(PCR侵入法)、龋齿病原菌量(培养法)、乳酸菌量(培养法)

此外，在临床参数方面，在摄取开始日、摄取第4周时，对以下各项目进行了测量。牙龈 炎指数及检测时的出血由牙科医生进行测量。

评价项目

1)牙龈炎指数(GI：Lee&Sillness，1963变法)

评价基准

0：临床上为正常的牙龈

1：虽然有轻度炎症、牙龈有稍许颜色变化，但没有发现使用探头擦过牙龈边缘内缘部导 致的出血。

2：有中度炎症，牙龈发红伴有浮肿和光泽，发现存在擦过牙龈边缘内缘部导致的出血。

3：重度炎症，有明显发红、浮肿，自然出血，形成溃疡。

诊断部位

以下6颗牙齿的舌头侧、嘴唇侧·脸颊侧、近心侧、远心侧的合计24个齿面。

【表15】

评价方法

利用下式，通过诊断部位的总分数计算出每位被试验者的平均牙龈炎得分。

【数2】

2)检测时的出血(BOP)

评价基准

0：未发现出血

1：发现出血

诊断部位

以下6颗牙齿的舌头侧、嘴唇侧·脸颊侧、近心侧、远心侧，合计24个齿面。

【表16】

评价方法

利用下式，通过诊断部位的总分数计算出每位被试验者的平均检测时出血得分。

【数3】

有关人试验的所有统计分析，使用的是统计分析软件(SAS前临床应用程序包Ve r.5.0，SAS Institute Inc.)。各统计处理的显着性水平都为5％。 相对于第0周的值，对摄取第4周或第8周的值实施了统计显著性检验，对试验期间的变动进行 了分析。

17名被试验者的唾液中的菌数测试结果如表17所示。属于产生口臭诱因物质的牙周病原 菌之牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆 菌(Fusobacterium nucleatum)及福赛斯坦纳菌(Tanner ella forsythia)的菌数在摄取该乳酸菌的第4周出现减少(P＝0.019，0.006 ，0.005)，乳酸杆菌数在摄取该乳酸菌的第4周有所增加(P＝0.001)。变形链球菌在试验 期间没有发生变化。

【表17】

*：P＜0.05，**：P＜0.01

也就是说，通过摄取本发明的乳酸菌，产生口臭诱因物质的牙周病原菌(牙龈卟啉单胞 菌(Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆菌(Fusoba cterium nucleatum)及福赛斯坦纳菌(Tannerella for sythia)等)的菌数减少了，该乳酸菌作为口腔疾患、口臭的预防及/或治疗剂极为有 用这点得到了确认。此外，在试验期间龋齿成因菌的变形链球菌菌数没有发生变化。因此可 以认为，摄取本发明的乳酸菌导致龋齿风险提高的可能性很低。

并且，检测时的出血及牙龈炎指数在摄取该乳酸菌的第4周与开始摄取时相比显示出有意 义的低值。评价项目的分析结果如表18所示。

【表18】

*：P＜0.05.**P＜0.01

也就是说，通过摄取本发明的乳酸菌，改善牙龈炎等牙周病临床参数的效果得到确认， 该乳酸菌作为口腔疾患、口臭的预防及/或治疗剂极为有用这点得到了确认。

试验例11牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)对阳 性被试验者的口臭抑制效果的验证

为了对摄取本发明的乳酸菌卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispa tus)YIT12319对口臭的效果进行调查，以7名产生口臭诱因物质(牙周病原菌之一)的 牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)阳性被试验者为 对象，让其连续8周按照1日1次3粒的量，摄取每1粒含有3.3×10⁸cfu以上活菌的试验食品 ，然后利用气相色谱法对挥发性硫黄化合物(VSC)浓度进行了测量。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)阳性被试验 者群的VSC浓度分析结果如表19所示。VSC浓度的测试结果显示，在H₂S方面，摄取该 乳酸菌的第4周、第8周与开始摄取时相比显示出有意义的低值。此外，在Total VS C方面，摄取该乳酸菌的第8周与开始摄取时相比显示出有意义的低值。

【表19】

*：P＜0.05，**：P＜0.01

也就是说，通过摄取本发明的乳酸菌，实际上降低口臭诱因物质的效果得到确认，该乳 酸菌作为口腔疾患、口臭的预防及/或治疗剂极为有用这点得到了确认。

试验例12引物的设计与合成

利用RAPD法对17株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatu s)YIT12319及其它卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus) 的基因组DNA进行比较，在三个部位发现了目的菌株(卷曲乳杆菌(Lactobaci llus crispatus)YIT12319)的特异性DNA序列。然后对这些碱基序列 进行解读，选出表20所示的引物候补群，通过对它们进行适当组合，设计出35种对卷曲乳杆 菌(Lactobacillus crispatus)YIT12319有特异性的引物对。

【表20】

引物名称 序列   Lc(X)2a gcacatcgttatagtgaacggcgc (序列编号4) Lc(X)2b cacatcgttatagtgaacggcgct (序列编号5) Lc(X)2c acggttcaatacttctaacacatccgc (序列编号6) Lc(X)2d acacatccgcttgatct tgt tgttc (序列编号7) Lc(X)3a ttggttgggttaccgtcaac (序列编号9) Lc(X)5a ctttcactagtggagtgtatttac 序列编号10) Lc(X)5b gtctttcactagtggagtgtatttac (序列编号11) Lc(X)5c ctttcactagtggagtgtatttactc (序列编号12) Lc(X)3b gttgacggtaacccaaccaa (序列编号13) Lc(X)5d gtaaatacactccactagtgaaag (序列编号14) Lc(X)5e gtaaatacactccactagtgaaagac (序列编号15) Lc(X)5f gagtaaatacactccactagtgaaag (序列编号16) Lc(X)6a ttaaggtctatggaaacaactccaa (序列编号17) Lc(X)7a gtagaaaccaagttttaaggtctatg (序列编号8)

试验例13相对于同种(卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus )选出特异性引物对

针对于20株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YIT 12319及其它卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)的基因组D NA，使用设计的35种引物对进行了PCR反应试验。其结果，在表21所示的4种引物对中， 因PCR导致的DNA放大产物仅在卷曲乳杆菌(Lactobacillus cris  patus)YIT12319中得到确认(表21、图7)。

在这里，Lc(X)2a以序列编号4表示，Lc(X)2b以序列编号5表示，Lc(X )2c以序列编号6表示，Lc(X)2d以序列编号7，Lc(X)7a以序列编号8表示。

【表21】

试验例14选出针对卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)以 外的27属143菌株有特异性的引物对

使用表21所示的4种引物对，对表22所示的卷曲乳杆菌(Lactobacillus  crispatus)YIT12319及卷曲乳杆菌(Lactobacillus cris  patus)以外的Lactobacillus属65菌株、与Lactobacillu s属近缘的7菌株、口腔的优先菌22属71菌株(合计27属143菌株)的基因组DNA进行了PC R反应试验。其结果，在所有引物对中，DNA放大产物仅在卷曲乳杆菌(Lactoba  cillus crispatus)YIT12319中得到了确认。

结合试验例13的结果，得到了对27属163菌株不产生反应，仅对卷曲乳杆菌(Lacto bacillus crispatus)YIT12319产生反应的4种引物对。

【表22】

进行特异性调查的菌种

试验例15片剂的制造

按照表23所示的成分(每1粒)进行混和，将其混合物制成片剂。

【表23】

这样得到的片剂具有稳定性，易于服用。

【表24】

这样得到的片剂具有稳定性，易于服用。