以石仙桃根状茎为外植体快速繁殖石仙桃的方法

摘要

本发明涉及一种繁殖石仙桃的方法，特别涉及一种以石仙桃根状茎为外植体快速繁殖石仙桃的方法，属于植物组织培养技术领域。一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：(1)外植体的准备阶段：于每年11月至次年的4月采集石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有根状茎的顶芽或腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；(2)无菌处理阶段；(3)初代培养阶段；(4)继代壮苗培养阶段；(5)生根培养阶段；本发明所提供的方法能有效提高石仙桃的繁殖效率，获得足量石仙桃再生植株，为其规模化生产应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种繁殖石仙桃的方法，特别涉及一种以石仙桃根状茎为外植 体快速繁殖石仙桃的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

石仙桃(Pholidota chinensis Lindl.)系兰科(Orchidaceae)石仙桃属 (Pholidota)多年附生草本植物，俗称石橄榄。植株高15-25㎝，根状茎粗壮， 横走，具多，数须根；假鳞茎卵状长圆形或长圆形，长2-7㎝，粗0.5-2.5㎝， 顶端具2片叶。叶倒卵状披针形、倒卵形或倒卵状椭圆形，长8-18㎝，宽2-5 ㎝，顶端急尖或渐尖，基本下延成长柄，通常有较明显的弧形脉3-5条。花葶 长于假鳞茎顶端，直立或多少下垂，基部具多枚鳞片；总装花序顶生，具数朵 至20朵花；花苞片2列，淡褐色或淡紫红色，卵形或卵状披针形，长1-2㎝， 顶端钝或尖，边缘多少内卷；花白色或带黄绿色，唇瓣上有褐色条纹；萼片卵 形，分离，近等大，长约8㎜，宽4-5㎜，顶端钝；花瓣线状披针形，与萼片 近等长，宽约1.5㎜；唇瓣卵状圆形，长约8㎜，基部凹陷成杯状或囊状，顶 端3裂，中裂片扁圆形，长约3㎜，宽约4㎜，顶端钝，具小尖头，外弯，侧 裂片半圆形；蕊柱长4-5㎜，有狭翅；子房连花梗长6-9㎜。果倒卵形，长2-3 ㎝，具6条纵翅。花期4-6月。果期11月至翌年2月(林来官,张永田等.福 建植物志[M].福州:福建科学技术出版社,1994,第六卷:636-637)。在我国 分布于福建、广东、广西、云南等省，在福建省主要分布于福州、平和、长乐、 南靖等地区。生于林中或林缘树上、岩壁上或岩石上，海拔通常在1500m以下， 少数可达2500m(陈心启,吉占和,郎楷永等.中国植物志[M].北京:科学出 版社,1999,18:388-399)。

石仙桃作为中草药具有悠久的历史，始载于《生草药性备要》。以全草或假 鳞茎入药，其性甘味凉，具有养阴、清热、利湿消瘀的功效(南京中医药大学. 中药大辞典[M].上海:上海科学出版社,2006)，民间常用来治疗高血压、头 晕和各种原因引起的头疼等。用其制成的“头痛定糖浆”临床上用于治疗神经 功能性头痛、脑震荡后遗症，已应用多年，治疗效果良好(中华人民共和国药 典委员会.中药成方制剂(第九册).北京:北京化学工业出版社,1994:67)。

近几年对其药理进行了比较多的研究，报道其在镇静、催眠、抗癌、抗疲 劳等方面都有作用(刘建新,周青,连其深.石仙桃对中枢神经系统抑制作用. 赣南医学院学报,2004,24(2):119-121；王光辉,郭晓宇,王乃利等.云南石 仙桃氯仿萃取物活性部位对入肝癌细胞HepG2的周期抑制作用.沈阳药科大学 学报,2006,23(4):240-243；刘建新,周青,连其深.石仙桃的镇痛作用的研 究.赣南医学院学报,2002,22(2):105-107)。同时现在对其化学成分做了不 同方法的提取和分离，得到天麻苷元、原儿茶醛、胡萝卜苷等化学成分(舒文 海.石仙桃的局麻作用研究.中国药学杂志,1989,24(5):304；林丽聪,张怡 评,吴春敏等.石仙桃叶化学成分研究.时珍国医国药,2009,20(4):922-923； 李兵,郭环娟,容羡贤.石仙桃质量标准研究.中国药业, 2010,19(6):19-20；林丽聪,吴春敏,陈海滨等.RP—HPLC法测定石仙桃中天 麻素和天麻苷元.中草药.2008,39(2):283-285)。

随着临床对石仙桃研究的深入和新功能的开发，人们的需求量与日俱增， 但由于其生长缓慢、生物量小、自然繁殖率低、对生长环境要求苛刻，自然资 源贮藏量及可开发利用量非常有限，长期掠夺式采挖野生资源，已导致野生资 源锐减并逐渐匮乏，不少原产地石仙桃资源呈现稀缺趋势，因此人工栽培迫在 眉睫。而充足的种苗供给是实现石仙桃人工栽培的第一个瓶颈，并且现有技术 中关于石仙桃繁殖的方法效率极低，为此本发明对石仙桃的繁殖方法进行了研 究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以石仙桃根状茎为外植体快速繁殖石仙桃的方 法，以解决现有技术中存在的上述问题，本发明所提供的方法能有效提高石仙 桃的繁殖效率，获得足量石仙桃再生植株，为其规模化生产应用奠定基础。

本发明的技术方案如下：

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下依序进行的步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有根状茎 的顶芽或腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗后，转入到无菌瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为70％-75％的酒精灭菌2-3分钟后，用无菌水冲 洗；

④之后倒入质量百分比浓度为0.05-0.15％的升汞灭菌10-16分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上的顶 芽或腋芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为10-14h/d，培 养周期为70-90天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L的NAA+3.0-4.0mg/L的 6-BA+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为5.8-6.0；其中，NAA是a-萘 乙酸；6-BA是6-苄氨基腺嘌呤；

MS培养基的基本组成如下表所述：

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为 10-14h/d，培养周期为70-100天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L的NAA+0.5-1.0mg/L 的6-BA+50-100g/L的香蕉+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为5.8-6.0；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后生长的小苗，接种到生根培养基中进行生根 培养；培养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为10-14 h/d，培养周期为70-100天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.3-0.5mg/L的NAA+30-100g/L的 香蕉+0.3-0.5g/L的活性炭+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为 5.8-6.0。其中，1/2MS(大量元素减半)培养基的基本组成如下表所述：

进一步的，

在步骤(1)外植体的准备阶段中，优先选用根茎上带有根状茎的顶芽作为 外植体；

在步骤(2)无菌处理阶段中，每一步骤用无菌水冲洗的次数均优选为3-5 次；所述酒精的体积百分比浓度为75％，灭菌时间为2分钟；所述升汞的质量百 分比浓度为0.1％，灭菌时间为13分钟。

进一步的，

在步骤(3)初代培养阶段中，培养环境温度优选为23±2℃，光照强度优 选为2800-3200Lux，光照周期优选为12h/d，培养周期优选为70天；所述初 代培养基优选为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+4.0mg/L的6-BA+2％的蔗 糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

在步骤(4)继代壮苗培养阶段中，培养环境温度优选为23±2℃，光照强 度优选为2800-3200Lux，光照周期优选为12h/d，培养周期优选为70天；所 述继代壮苗培养基优选为：MS培养基+1.0mg/L的NAA+1.0mg/L的6-BA+ 100g/L的香蕉+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

在步骤(5)生根培养阶段中，培养环境温度优选为23±2℃，光照强度优 选为2800-3200Lux，光照周期优选为12h/d，培养周期优选为70天；所述生 根培养基优选为：1/2MS培养基+0.5mg/L的NAA+50g/L的香蕉+0.5g/L 的活性炭+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9。

本发明所提供的一种以石仙桃根状茎为外植体快速繁殖石仙桃的方法对比 现有技术有如下优点：

1)本发明率先开展了石仙桃人工快速繁殖的研究，为其规模化生产应用奠 定基础。

2)通过继代壮苗培养，大大提高了石仙桃的繁殖系数，增强了小苗的生长 势，提高了栽培成活率。

3)与传统的分株繁殖相比，本发明能够在短期内生产出大量的小苗供生产 栽培需要。

4)在以石仙桃根茎为外植体的无菌处理阶段，采用酒精和升汞进行二次灭 菌，既能保证处理后的外植体具有较高成活率，又能有效降低外植体的污染率。

附图说明

图1是刚接种到培养基上的顶芽；

图2是刚接种到培养基上带潜伏芽的根；

图3是受到细菌性污染的外植体；

图4是受到真菌性污染的外植体；

图5是死亡的带潜伏芽的根；

图6是死亡的顶芽；

图7是成活的顶芽的一种状态；

图8是成活的顶芽的另一种状态；

图9是增殖的顶芽的一种状态；

图10是增殖的顶芽的另一种状态；

图11是壮苗后的芽；

图12是完整的植株示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和具体实施例来对本发明进行详细的说明。

具体实施方式如下：

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的顶芽或腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗3-5次后，转入到无 菌瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为70％-75％的酒精灭菌2-3分钟后，用无菌水冲 洗3-5次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.05-0.15％的升汞灭菌10-16分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗3-5次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体 上的顶芽或腋芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为10-14h/d，培 养周期为70-90天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L的NAA+3.0-4.0mg/L的 6-BA+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为5.8-6.0；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为 10-14h/d，培养周期为70-100天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L的NAA+0.5-1.0mg/L的 6-BA+50-100g/L的香蕉+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为5.8-6.0；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为23±5℃，光照强度为2500-3500Lux，光照周期为10-14 h/d，培养周期为70-100天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.3-0.5mg/L的NAA+30-100g/L 香蕉+0.3-0.5g/L的活性炭+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂，pH值为 5.8-6.0。

上述培养基中，各物质的浓度均指其在最终配制获得的营养液中所占浓度， 蔗糖和琼脂的浓度均指质量百分比浓度。

具体实施例如下：

实施例1(最佳实施例)

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的顶芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗3次后，转入到无菌 瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为75％的酒精灭菌3分钟后，用无菌水冲洗3次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.1％的升汞灭菌13分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗5次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上 的顶芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为23±2℃，光照强度为2800-3200Lux，光照周期为12h/d，培养 周期为70天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+4.0mg/L的6-BA+2％ 的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2800-3200Lux，光照周期为 12h/d，培养周期为70天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+1.0mg/L的NAA+1.0mg/L的6-BA +100g/L的香蕉+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2800-3200Lux，光照周期为12 h/d，培养周期为70天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L的NAA+50g/L的香蕉+0.5g/L 的活性炭+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9。

实施例2

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的顶芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗5次后，转入到无菌 瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为70％的酒精灭菌3分钟后，用无菌水冲洗5次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.15％的升汞灭菌10分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗3次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上 的顶芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为25±2℃，光照强度为2500-2800Lux，光照周期为14h/d，培养 周期为90天；

所述初代培养基为：MS培养基+1.0mg/L的NAA+3.0mg/L的6-BA+3％ 的蔗糖+1.0％的琼脂，pH值为6.0；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为25±2℃，光照强度为2500-2800Lux，光照周期为 14h/d，培养周期为100天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+0.5mg/L的6-BA +50g/L的香蕉+3％的蔗糖+1.0％的琼脂，pH值为6.0；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为26±2℃，光照强度为2500-2800Lux，光照周期为14 h/d，培养周期为100天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.3mg/L的NAA+30g/L的香蕉+ 0.3g/L的活性炭+3％的蔗糖+1.0％的琼脂，pH值为6.0。

实施例3

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的顶芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗4次后，转入到无菌 瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为70％的酒精灭菌3分钟后，用无菌水冲洗4次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.05％的升汞灭菌13分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗4次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上 的顶芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为20±2℃，光照强度为3200-3500Lux，光照周期为10h/d，培养 周期为80天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.3mg/L的NAA+3.0mg/L的6-BA+1％ 的蔗糖+0.6％的琼脂，pH值为5.8；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为20±2℃，光照强度为3200-3500Lux，光照周期为 10h/d，培养周期为85天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+0.5mg/L的6-BA+ 75g/L的香蕉+1％的蔗糖+0.6％的琼脂，pH值为5.8；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为20±2℃，光照强度为3200-3500Lux，光照周期为10 h/d，培养周期为85天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L的NAA+100g/L香蕉+0.4g/L 活性炭+1％蔗糖+0.6％琼脂，pH值为5.8。

实施例4

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗3次后，转入到无菌 瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为75％的酒精灭菌2分钟后，用无菌水冲洗3次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.1％的升汞灭菌16分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗5次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上 的腋芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，光照周期为12h/d，培养 周期为70天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+4.0mg/L的6-BA+2％ 的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，光照周期为 12h/d，培养周期为70天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+1.0mg/L的NAA+1.0mg/L的6-BA +100g/L的香蕉+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，光照周期为12 h/d，培养周期为70天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L的NAA+50g/L的香蕉+ 0.5g/L的活性炭+2％的蔗糖+0.8％的琼脂，pH值为5.9。

实施例5

一种以石仙桃根茎芽为外植体快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以 下步骤：

(1)外植体的准备阶段

于每年11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上带有 根状茎的腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根，备用；

(2)无菌处理阶段，包括以下依序进行的步骤：

①将步骤(1)中所准备的外植体先用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎， 使每个芽上仅保留2毫米以下的根茎；

②接着转移到灭菌后的超净工作台上，用无菌水冲洗3次后，转入到无菌 瓶内；

③接着再用体积百分比浓度为75％的酒精灭菌2分钟后，用无菌水冲洗5次；

④之后倒入质量百分比浓度为0.15％的升汞灭菌7分钟；

⑤最后再用无菌水冲洗5次后，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将外植体上 的顶芽或腋芽表面的水吸干，备用；

(3)初代培养阶段

将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培 养环境温度为26±2℃，光照强度为2900-3100Lux，光照周期为14h/d，培养 周期为70天；

所述初代培养基为：MS培养基+0.5mg/L的NAA+4.0mg/L的6-BA+3％ 的蔗糖+0.6％的琼脂，pH值为5.8；

(4)继代壮苗培养阶段

将步骤(3)中初代培养后萌发的小芽，接种到继代壮苗培养基中进行继代 壮苗培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2900-3100Lux，光照周期为 10h/d，培养周期为100天；

所述继代壮苗培养基为：MS培养基+1.0mg/L的NAA+0.5mg/L的6-BA+ 50g/L的香蕉+3％的蔗糖+0.6％的琼脂，pH值为6.0；

(5)生根培养阶段

将步骤(4)中继代壮苗培养后的生长的小苗，接种到生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为26±2℃，光照强度为2900-3100Lux，光照周期为14 h/d，培养周期为70天；

所述生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L的NAA+30g/L香蕉+0.3g/L 活性炭+1％蔗糖+1.0％琼脂，pH值为5.8。

在以上各实施例中：

经过对各实施例的各步骤的测试，该方法中步骤(1)外植体的准备阶段的 理想外植体选择、步骤(2)无菌处理阶段的灭菌时间的选择、步骤(3)初代 培养阶段的初代适宜培养基的筛选、步骤(4)继代壮苗培养阶段的继代壮苗培 养基筛选及步骤(5)生根培养阶段的高效生根培养基的筛选的实验数据分别如 以下内容所示：

一、理想外植体选择

在每年的11月至次年的4月采集野生的石仙桃，除去假鳞茎，将根茎上顶 芽以及腋芽作为外植体切下，去除根状茎上覆盖的老鳞片和根。将石仙桃不同 芽，经过相同灭菌时间后，接种到相同的初代培养基上，比较不同种类芽对污 染率和再生力的影响，筛选出适合作为外植体的芽，为下一步无菌体系的建立 奠定基础。每个处理20个芽，三次重复，结果见表1。

表1不同种类芽对污染率和成活率的影响

从表1可知，顶芽作为外植体污染率比腋芽低，并且成活率较腋芽高，可 达61.67％，因此在所选择的两种外植体当中，顶芽是更加理想的外植体。

二、灭菌时间的选择

将准备好的顶芽用清水冲洗干净后，去掉多余的根茎，使每个芽上仅保留2 毫米以下的根茎；再移入准备好的超净工作台上，用无菌水冲洗3遍，转入无 菌瓶内，然后用75％的酒精分别灭菌0、0.5、1、2、3分钟，时间到后，用无 菌水冲洗3遍，再先后倒入0.1％、0.15％、0.05％的升汞分别灭菌0、7、10、13、 16分钟，时间到后，用无菌水冲洗5遍，放入盛有无菌滤纸的盘子里，将芽表 明的水吸干，然后用无菌手术刀和镊子，接种到初代培养基里，两周后统计污 染数和成活数。每个无菌瓶处理20个芽，三次重复。试验结果见表2-1、表2-2、 表2-3和表3-1、表3-2、表3-3(此外，将75％的酒精换成70％的酒精，试验结 果与上表差异不大)。

表2-1采用75％酒精，0.05％的升汞，灭菌不同时间对污染率的影响

表2-2采用75％酒精、01％升汞，不同时间灭菌对污染率的影响

表2-3采用75％酒精，0.15％的升汞，灭菌不同时间对污染率的影响

从表2-1至表2-3可知，只用酒精而不用升汞灭菌时，污染率较高，随着灭 菌时间的延长，污染率有所降低，但不同处理间差异不显著。而只用升汞不用 酒精灭菌时，灭菌效果有所提高，并且随着处理时间的延长和升汞浓度的增加， 污染率逐渐降低，以0.15％的升汞处理16分钟时，污染率有66.5％。但同时用 酒精和升汞灭菌时，最佳仅有49.5％的污染率。当以0.5％升汞浓度处理时，其 污染率的处理时间需要13-16分钟才能与0.1％升汞处理10-13分钟效果相当。

因此，从外植体的污染率考虑，选用70％-75％的酒精和0.05-0.15％的升汞 进行二次灭菌，且控制酒精的灭菌时间为2-3分钟，升汞的灭菌时间为10-16 分钟，污染率几乎控制在50-70％之间。

表3-1采用75％酒精、0.05％升汞灭菌不同时间对成活率的影响

表3-2采用75％酒精、0.1％升汞，灭菌不同时间对成活率的影响

表3-3采用75％酒精、0.15％升汞灭菌不同时间对成活率的影响

从表3-1至表3-3可知，只用酒精而不用升汞灭菌时，成活率较高，随着灭 菌时间的延长和酒精浓度的提高，成活率略有降低，但不同处理间差异不明显。 而只用升汞不用酒精灭菌时，灭菌效果有所提高，并且随着处理时间的延长和 浓度的提高，成活率下降明显，用0.15％升汞处理16分钟时，成活率仅有27％。 所有浓度(0.5％、0.1％、0.15％)升汞处理16分钟后，成活率都降低到40％以下。 当同时用75％酒精和0.15％升汞灭菌时，仅有13％的成活率。

因此，就外植体的成活率考虑，选用70％-75％的酒精和0.05-0.15％的升汞 进行二次灭菌，且控制酒精的灭菌时间为2-3分钟，升汞的灭菌时间为10-13 分钟，成活率保持在40-70％。

综上，从外植体的污染率和成活率综合考虑，选择先用70％-75％酒精灭菌2 或3分钟，再用0.05-0.15％升汞灭菌10-13分钟为最佳的外植体灭菌时间，这 时污染率相对较低，而成活率较高。

三、初代适宜培养基的筛选

经过灭菌后的芽，接种MS培养基中，附加0-4.0mg/L 6-BA、0-1.0mg/L NAA、 2％蔗糖以及0.8％琼脂，接种好后，置于环境(pH为5.8-6.0，温度23±2℃， 光照强度2800-3200Lux，光照周期为12h/d，培养周期90天)中进行初代培 养。每个处理接种50瓶，90天后继代时，从无污染的瓶中随机挑选20瓶，统 计成活率和新芽数，三次重复。

表4不同培养基对成活率影响(％)

从表4可知，不同NAA和6-BA组合，对外植体成活率有不同的影响，整体 而言，随着NAA浓度的加大，外植体成活率逐渐提高。同样随着6-BA浓度的加 大，外植体的成活率也在提高，其中以1.0mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA组合的 成活率最高，可达84.6％。

表5不同培养基对新生小芽影响(平均单株芽数)

从表5可以看出，不同浓度NAA和6-BA组合，对外植体新芽有不同的影响， 当NAA浓度较低时，随着6-BA浓度的增加，新芽的数量也增加，并以0.5mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA的组合时，单株新芽数量最多，可达6.2。

经过上述比较与分析，外植体成活率的最高的组合为1.0mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，而新芽生长最多的组合为0.5mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA，从成活 率和新生芽数量综合考虑，NAA的浓度在0.5-1.0mg/L、6-BA的浓度在3.0-4.0 mg/L之间就能取得较佳的成活率和新芽分化率，其中培养基MS+0.5mg/L NAA +4.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂+2.0％蔗糖最适宜外植体的初代培养和新芽分化。

四、继代壮苗培养基筛选

将初代培养后新萌发的小芽，接种到MS培养基中，附加0-1.0mg/L 6-BA、 0-1.0mg/L NAA、50-100g/L香蕉、2.0％蔗糖以及0.8％琼脂，接种好后，置于 环境(pH为5.8-6.0，温度23±2℃，光照强度2800-3200Lux，光照周期为12h/d， 培养周期70天。)中进行壮苗培养。试验考虑6-BA、NAA和香蕉三个为主要因 素，各设置3个梯度，采用正交设计(各因素组合见表6)。生长期间观察小芽 的成活率和生长势，70天时统计小芽死亡率、新芽数。每个处理20瓶，每瓶两 个芽，三次重复。用SPSS软件统计分析。

表6各因素组合正交表及直观分析

表7正交表方差分析

表86-BA各浓度方差分析

注：多重比较的概率为P＝0.05

表9NAA各浓度方差分析

注：多重比较的概率为P＝0.05

表10香蕉各浓度方差分析

注：多重比较的概率为P＝0.05

从表6可知，在所试验的6-BA、NAA、香蕉三个因素中，以6-BA对继代小 苗成活率影响最大，其次是NAA，最小的是香蕉，大小顺序为6-BA＞NAA＞香蕉。 从表7可知，经方差分析后，6-BA和NAA对成活率的影响达到了显著差异。经 表8和表9的进一步分析可知，就小苗成活率而言，6-BA的最佳浓度为1.0mg/L， 但与0.5mg/L的处理没有显著差别，与不加6-BA的处理得到了显著差别。而 NAA的最佳浓度为1.0mg/L，同样与0.5mg/L的处理没有显著差别，与不加NAA 的处理得到了显著差别。从表10可知，香蕉的最佳添加量为100g/L，但香蕉添 加与否以及添加的多少，对小苗成活率有一定的影响，可均未达到显著差别。

从上述分析可知，继代壮苗培养基优选为：MS培养基+0.5-1.0mg/L的NAA +0.5-1.0mg/L的6-BA+50-100g/L的香蕉+1-3％的蔗糖+0.6-1.0％的琼脂； 继代壮苗培养基最佳为：MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+100g/L香蕉+ 2.0％蔗糖+0.8％琼脂。6-BA、NAA、香蕉不同浓度对小芽成活率均有影响，只 是影响大与小之别，并且在生产过程中，应根据小苗生长情况，改变所用浓度， 使其能健康茁壮生长。

五、高效生根培养基的筛选

将壮苗后的小苗，接种到如下培养基中生根：

1、MS；

2、1/2MS；

3、MS+50g/L香蕉；

4、1/2MS+50g/L香蕉；

5、MS+0.5mg/L NAA；

6、1/2MS+0.5mg/L NAA；

7、MS+50g/L香蕉+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭；

8、1/2MS+50g/L香蕉+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭；

9、1/2MS+100g/L香蕉+0.3mg/L NAA+0.3g/L活性炭；

10、1/2MS+30g/L香蕉+0.4mg/L NAA+0.4g/L活性炭。

上述10种培养基均加2％蔗糖+0.8％琼脂。每个处理接种20个芽，三次重 复，接种好后，置于环境(pH为5.8-6.0，温度23±2℃，光照强度2800-3200Lux， 光照周期为12h/d，培养周期90天)中进行生根培养，3个月后统计根系生长 情况，生根期间观察不同处理开始生根时间、小苗生长势等。

表11不同培养基对生根的影响

注：多重比较的概率为P＝0.01

从表11可知，生根最好的培养基为第8种培养基：1/2MS+50g/L香蕉+ 0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.8％琼脂，平均每株生根2.72条， 成苗率可达91.65，第9种和第10种培养基的成苗率与第8种差异不大。其它 几种培养基与第8、9、10种培养基不同处理间差别较大，处理1、处理2、处 理3均不含有NAA与含有NAA的处理5、处理6、处理8、处理9、处理10就成 苗率而言达到显著差别。其他各处理间有差别，但差别未达显著程度。在培养 过程中发现有香蕉的培养基，小苗生长势较强，根系生长旺盛。由于石仙桃生 长缓慢，如果生长时间更长，根系的生长率会有所增加。在培养的过程中，小 苗的基部逐渐膨大，形成假鳞茎，这为下一步的栽培奠定了基础。

上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只 仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发 明的保护范围之内。