一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法

摘要

本发明提供一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法，在预培养阶段、装载阶段、PVS2玻璃化保护阶段、洗涤卸载阶段所使用的试剂中，均用果糖代替蔗糖，进行超低温保存处理。本发明的方法可有效地防止超低温保存后菊芋茎尖再生后玻璃化现象的发生，植株不经愈伤直接再生率可达40％以上，易于操作，适用于菊芋茎尖的超低温保存。

说明书

技术领域

本发明涉及植物种质资源的小滴玻璃化法超低温保存技术，具体 地说，涉及一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberous L.)为菊科向日葵属多年生草本植物， 是一种生态经济型植物，具有很高的经济价值、药用价值、观赏价值 和生态价值。因其地上似菊，地下似芋而得名。原产北美洲，在美国、 加拿大、墨西哥等国广泛分布。17世纪经欧洲传入我国，在我国东北 三省、内蒙古、河北、河南等省均有分布。菊芋为无性繁殖作物，其 繁殖能力很强，地下块茎以每年20倍以上的速度繁殖，我国西北地区 菊芋已形成规模化生产。菊芋生态适应性很广，有很强的抗逆性。耐 寒、耐旱、耐盐碱、防风治沙。菊芋块根中含有丰富的菊粉，菊粉在 食品中广泛应用，可作为甜味增味剂，也是生产果糖的原料。菊芋被 联合国粮农组织称为“21世纪人畜共用作物”。利用菊芋块茎转化成乙 醇和生物燃料等生物能源可应用在化工、生物制药、航天等领域。

植物种质资源的非原生境保存分为田间保存、试管苗保存和超低 温保存。菊芋种质资源目前采用非原生境保存中的田间保存和试管苗 保存。由于菊芋地下块茎容易受到病毒的侵害，使病毒大量积累，导 致品种退化，产量降低，而城市土地开发、环境恶化也严重威胁菊芋 种质资源的安全保存。试管苗保存虽然具有占地面积小、不易受自然 灾害和病原菌影响以及人力、财力投入少，便于种质资源交换及运输 等优点，但需要经常继代更新，且经多次继代培养后面临发生退化现 象或产生变异等威胁。现已证明，植物组织材料经一系列的超低温保 存步骤后，投入液氮保存(气相液氮或液相液氮条件下)，经化冻后 仍能在一定培养条件下再生出新的植株，并保持其遗传稳定性。它避 免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭，以及试管苗 组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。

茎尖超低温保存方法成功标准在于，经一系列超低温保存处理 后，化冻后的茎尖在适宜条件下再生恢复培养后，需要直接成功再生 成正常苗。然而经超低温保存后再生恢复培养阶段，容易出现玻璃化 现象，出现玻璃化现象的茎尖即使膨大也不易形成再生苗，再生苗也 容易死亡。玻璃化现象是指再生的苗成半透明状，叶片呈浅绿色或黄 绿色、叶片肥厚，易发生畸形、卷曲或皱缩，叶片脆弱易碎。从解剖 学上看，叶片无功能性气孔，由于保卫细胞的功能性失调不能关闭气 孔，玻璃化的叶片不具有栅栏组织，只有海绵组织。由于玻璃化的植 株呼吸和光合作用功能不健全，玻璃化苗的分化能力低下，难以继代 培养繁殖，更难以移栽成活。

超低温保存后玻璃化苗的产生与很多因素有关，与组织培养中试 管苗的玻璃化现象相比，影响因素更为复杂，可能涉及超低温保存过 程中的各个关键步骤，也可能涉及再生恢复培养过程中的培养基和培 养环境条件，如水分、光照、营养条件、激素水平等。超低温保存过 程涉及多个关键步骤，如预培养、装载、PVS2玻璃化保护、化冻、 洗涤等，茎尖等材料在超低温保存过程中可能受到不同程度的渗透、 脱水、化学毒害等胁迫，造成部分细胞失去活力或者受到不同程度的 伤害。若经化冻、洗涤和再生培养后，一些关键细胞的伤害得到了修 复，则有利于茎尖再生成苗。反之，则有可能发生玻璃化或形成愈伤 等现象，不利于茎尖的成功再生。

菊芋茎尖按常规方法超低温保存后，出现了严重的玻璃化现象。 过去文献报道的克服玻璃化现象的研究，多集中于克服或消除组织培 养过程中的试管苗的玻璃化现象，对克服超低温保存后的玻璃化现象 研究较少。克服超低温保存后的玻璃化现象是解决超低温保存成功的 关键环节之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻 璃化的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种克服菊芋茎尖超低温保存后 再生苗玻璃化的方法，所述方法包括以下步骤：

1)预培养：切取菊芋组培苗茎尖，在含有0.3-0.4mol/L果糖的 MS液体培养基中，25℃暗培养2-3天；

2)装载：预培养后的茎尖在含有2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖 的MS液体培养基中25℃装载30-40min；

3)PVS2玻璃化保护剂处理：装载后的茎尖转入改良的PVS2玻璃 化保护剂中0℃脱水处理15-40min；

4)小滴玻璃化法超低温保存：步骤3)处理后的茎尖置于铝箔条 上，向茎尖上滴加改良的PVS2玻璃化保护剂，使茎尖完全包裹于由 保护剂形成的液滴中，将铝箔条置于冻存管中，然后投入液氮中保存；

5)解冻和洗涤：从液氮中取出冻存管，将铝箔条上的茎尖浸入 含有1.2mol/L果糖的MS培养液中室温解冻和洗涤；

6)步骤5)处理后茎尖转入恢复培养基中恢复培养。

其中，步骤3)和4)中所述改良的PVS2玻璃化保护剂为含有30％ 甘油、15％二甲基亚砜、15％乙二醇和0.4mol/L果糖的MS液体培养基。

前述的方法，步骤1)具体为：取4-5周苗龄的菊芋组培苗，逐层 剥去外层叶片，至剩余1-2片叶原基包围茎尖分生组织，切取1.5-2mm 的茎尖，在含有0.4mol/L果糖的MS液体培养基中，60rpm，25℃暗培 养2-3天。

前述的方法，步骤5)中共洗涤2次，每次10min，用含有1.2mol/L 果糖的MS培养液进行洗涤。

前述的方法，步骤6)中所述恢复培养基为MS+0.1mg/L GA₃+15g/L蔗糖，培养条件为：于25℃培养箱中暗培养3-5天后，转入 正常光照条件下进行培养。

采用本发明提供的方法进行菊芋茎尖保存和再培养，有效避免了 玻璃化现象的发生，植株不经愈伤直接再生率可达40％以上。本发明 提供的方法成本低廉、操作简便，是克服菊芋茎尖超低温保存后再生 苗玻璃化的一条有效途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中菊芋试管苗照片。

图2为本发明实施例1中菊芋茎尖照片。

图3为本发明实施例1中超低温保存后发生玻璃化现象的照片。

图4为本发明实施例2中超低温保存后不经愈伤直接再生成苗的 照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

MS液体培养基：蔗糖30克，MS培养基粉4.43克(购于北京西美 杰科技有限公司，型号M519)，pH5.8，定容至1L。

含0.4mol/L果糖的MS液体培养基：果糖13.25克，MS培养基粉 4.43克(购于北京西美杰科技有限公司，型号M519)，pH5.8，定容至 1L。

MS固体培养基：MS培养基粉4.43克(购于北京西美杰科技有限 公司，型号M519)，添加蔗糖30克，添加琼脂8.00g(购于黑龙江省哈 尔滨市南岗区雨林科技用品商行)，pH5.8，定容至1L。

菊芋组培苗：经中国农业科学院作物科学研究所沿海地区考察收 集，在浙江省杭州市萧山区围垦20工段采集的菊芋块茎，经种植后、 消毒灭菌，利用其茎尖培养发育成的试管苗，入国家种质库试管苗库 保存，种质编号为2009331028。

实施例1菊芋茎尖超低温保存玻璃化现象发生

一、相关试剂的配方

预培养液：含0.4mol/L蔗糖的MS液体培养基。

装载液：含2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的MS液体培养基。

PVS2玻璃化保护剂的制备方法：将3.26mol甘油、2.42mol乙二醇、 1.9mol二甲基亚砜和0.4mol蔗糖与MS液体培养基充分混匀至1L。

卸载液：含1.20mol/L蔗糖的MS液体培养基。

二、菊芋茎尖的超低温保存

取4-5周苗龄的菊芋组培苗(图1)，逐层剥去外层叶片，至剩余 1-2片叶原基包围茎尖分生组织，切取1.5-2mm的茎尖(图2)，先浸泡 在预培养液中25℃暗培养3天(转速为60rpm)，然后在装载液中25℃ 浸泡30min(正常光照)，最后在PVS2玻璃化保护剂0℃脱水处理15min (正常光照)。将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条(5mm×20mm) 上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中(每 条铝箔条上滴加4滴PVS2玻璃化保护剂，每滴16微升，容纳5个茎尖)， 最后将铝箔条转移至充满液氮的冻存管中，投入液氮保存。从液氮中 取出冻存管，将铝箔条放入1.20mol/L蔗糖的MS卸载液中室温化冻 20min，每10min换一次新的洗涤液，然后将茎尖转移到装有恢复培养 基(MS+0.1mg/L GA₃+15g/L蔗糖)的培养皿中，置于25℃培养箱中 暗培养3-5天后再转入正常光照条件下进行培养。

三、存活率、再生率统计

恢复培养一周后统计存活率(存活植株数量÷茎尖数量×100％)， 两周后统计再生率(再生植株数量÷茎尖数量×100％)。

三次重复实验存活率分别为92.31％、92.86％、92.86％，平均存 活率为92.67％；三次重复实验再生率分别为69.23％、92.86％、85.71％， 平均再生率为82.60％。虽然存活率和再生率较高，但超低温保存后再 生苗发生严重的玻璃化现象(图3)。

实施例2菊芋茎尖超低温保存玻璃化现象的克服

一、相关试剂的配方

含果糖的预培养液：含0.4mol/L果糖的MS液体培养基(用果糖替 代蔗糖)。

含甘露醇的预培养液：含0.4mol/L甘露醇的MS液体培养基(用甘 露醇替代蔗糖)。

含果糖的装载液：含2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖的MS液体培养 基(用果糖替代蔗糖)。

含甘露醇的装载液：含2.0mol/L甘油和0.4mol/L甘露醇的MS液体 培养基(用甘露醇替代蔗糖)。

含果糖的玻璃化保护剂的制备方法：将3.26mol甘油、2.42mol乙 二醇、1.9mol二甲基亚砜和0.4mol果糖与MS液体培养基充分混匀至1L (用果糖替代蔗糖)。

含甘露醇的玻璃化保护剂的制备方法：将3.26mol甘油、2.42mol 乙二醇、1.9mol二甲基亚砜和0.4mol甘露醇与MS液体培养基充分混匀 至1L(用甘露醇替代蔗糖)。

含果糖的卸载液：含1.2mol/L果糖的MS液体培养基(用果糖替代 蔗糖)。

含甘露醇的卸载液：含1.2mol/L甘露醇的MS液体培养基(用甘露 醇替代蔗糖)。

二、菊芋茎尖的超低温保存

方案1：超低温保存流程与实施例1相同，所有技术步骤用含果糖 的试剂替代蔗糖的试剂。

方案2：超低温保存流程与实施例1相同，预培养液用含果糖的试 剂替代，其他技术步骤所用试剂仍为含有蔗糖的试剂。

方案3：超低温保存流程与实施例1相同，所有技术步骤用含甘露 醇的试剂替代蔗糖的试剂。

方案4：超低温保存流程与实施例1相同，预培养液用含甘露醇的 试剂替代，其他技术步骤所用试剂仍为含有蔗糖的试剂。

三、存活率、再生率统计

存活率、再生率的统计方法与实施例1相同，结果见表1。

表1 存活率、再生率统计结果

从以上统计结果可以看出，方案3的菊芋茎尖超低温保存技术流 程中的所有步骤用含甘露醇的试剂替代含蔗糖的试剂后，虽然再生率 可保持45％，但再生苗中仍有2/3出现玻璃化现象。方案1所有步骤用 含果糖的试剂替代含蔗糖的试剂后，尽管再生率有所降低(40％)， 但再生苗全部为健康再生苗，并无玻璃化现象产生，再生苗玻璃化现 象被克服(图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。