菊芋品种茎尖超低温保存研究

摘要

菊芋（Helianthus tuberous L.）属菊科向日葵属多年生草本植物，具有很强的抗逆性，多用于东北地区高速路绿化，常作为改善沙漠、盐碱地的绿化植被，菊芋还具有很高的经济价值、观赏价值、生态价值和药用价值，是一种重要的观赏和作物种质资源。菊芋品种较多，常为无性繁殖，采用超低温保存可以长期保存菊芋种质资源。
　　本研究以菊芋品种‘2009331028’为试验材料，以单因素试验优化菊芋茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系，并将该体系应用到‘M6’、‘Stampede’和‘Relikt’这3个菊芋品种中，还比较了菊芋茎尖玻璃化法和小滴玻璃化法超低温保存效果;采用差示扫描量热法(DSC)检测不同处理阶段茎尖的热力学变化和透射电镜观察细胞超微结构的变化;最后利用SSR分子标记检测超低温保存后再生植株的遗传稳定性。主要研究结果如下:
　　1.菊芋茎尖超低温保存最优化体系为:取继代培养4-5周的菊芋试管苗‘2009331028’，剥取2-3mm大小的无菌茎尖分别在含0.4 mol/L蔗糖的MS液体培养基中预培养3d，25℃下装载30min，0℃下PVS2脱水处理15min，小滴玻璃化法进行超低温保存至少24h，在1.2M蔗糖的液体MS卸载液中解冻20min，每10min换液一次，将解冻后的茎尖转入恢复培养基中暗培3～5d后转入光照强度1500lux，16h/8h光周期下培养，存活率和再生率分别为93％和83％。
　　2.运用最优化方案对菊芋茎尖进行玻璃化法和小滴玻璃化法超低温保存后，其存活率分别为34％和93％，再生率分别为26％和83％。菊芋茎尖超低温保存的最佳方法为小滴玻璃化法。
　　3.运用最优化方案对‘M6’、‘Stampede’和‘Relikt’这3个菊芋品种进行小滴玻璃化法超低温保存，存活率分别为44％、72％、50％，再生率分别为37％、53％、37％，品种间存在差异。
　　4.根据DSC扫描图谱显示，新鲜茎尖，预培养的茎尖，预培养、装载后的茎尖在降温的过程中都形成冰晶，且结冰的温度和冰晶的体积随着处理的加剧而逐渐降低和减小，放出的热量也相应减小。当茎尖经过PVS2脱水处理，发生了相变潜热即玻璃化转变，4个菊芋品种的DSC结果一致，玻璃化转变温度相近。
　　5.透射电镜观察了菊芋品种‘2009331028’的8个不同处理的茎尖的超微结构，发现脱水主要发生在装载和PVS2处理阶段，菊芋茎尖经过预培养和装载后，细胞中出现质壁分离，胞内小泡增多，核质浓缩，核仁皱缩，线粒体、叶绿体等细胞器出现空洞或扭曲变形，而经过PVS2处理的茎尖最大的变化是细胞中线粒体数量增多。经过超低温保存后，新鲜茎尖、预培养后茎尖和经过装载的茎尖的细胞结构均被破坏，且不可修复，当茎尖经过PVS2脱水处理超低温保存后，大部分细胞结构完整，细胞器虽然较少，但未受到致命伤害，经过恢复培养可以恢复到正常状态。
　　6.采用最优方案超低温保存‘2009331028’茎尖，利用18对SSR引物扩增，对再生植株进行遗传稳定性检测，未发现差异条带。

目录

摘要

1 绪论

1．1 菊芋研究现状

1．1．1 菊芋栽培育种研究现状

1．1．2 菊芋开发利用研究现状

1．1．3 菊芋种质耐性胁迫研究现状

1．1．4 菊芋种质保存研究现状

1．2 植物种质超低温保存研究现状

1．2．1 超低温保存原理

1．2．2 超低温保存方法

1．2．3 影响超低温保存的因素

1．2．4 超低温保存机理研究

1．2．5 超低温保存后的遗传稳定性

1．3 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 组织培养

2．2．2 超低温保存体系的建立

2．2．3 小滴玻璃化法单因素试验设计

2．2．4 差示扫描量热法(DSC)试验

2．2．5 超微结构观察样品处理方法

2．2．6 分子水平(SSR)检测超低温保存后的遗传稳定性

2．2．7 数据统计分析

3 试验结果

3．1 菊芋茎尖超低温保存体系的建立

3．1．1 预培养液中蔗糖浓度对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．2 预培养时间对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．3 装载时间对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．4 PVS2处理时间对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．5 恢复培养基对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．6 不同保存方法对菊芋茎尖超低温保存后存活率和再生率的影响

3．1．7 菊芋不同品种茎尖超低温保存后存活率和再生率的差异

3．1．8 本章小结

3．2 超低温保存过程中茎尖的热力学分析

3．2．1 差示扫描量热法(DSC)测定菊芋茎尖超低温保存各个阶段的吸热焓

3．2．2 DSC检测玻璃化状态的改变

3．2．3 本章小结

3．3 菊芋茎尖在超低温保存各个处理阶段细胞超微结构的变化

3．3．1 未处理的新鲜茎尖细胞超微结构变化

3．3．2 未处理的新鲜茎尖直接投入液氮后细胞的超微结构

3．3．3 茎尖预培养后细胞超微结构

3．3．4 茎尖预培养后投入液氮细胞的超微结构

3．3．5 预培养、装载处理后细胞超微结构

3．3．6 茎尖经预培养、装载投入液氮后细胞的超微结构

3．3．7 茎尖经PVS2脱水后细胞的超微结构

3．3．8 茎尖经过PVS2脱水投入液氮后细胞超微结构

3．3．9 本章小结

3．4 超低温保存前后遗传稳定性

3．4．1 SSR遗传稳定性检测

3．4．2 本章小结

4 讨论

4．1 影响超低温保存的因素

4．1．1 预培养

4．1．2 装载

4．1．3 PVS2脱水

4．1．4 恢复培养基

4．1．5 不同品种超低温保存后生活力的差异

4．2 超低温保存过程中的热力学变化

4．3 超低温保存过程中细胞超微结构的变化

4．4 超低温保存后的遗传稳定性

5 结论与建议

5．1 结论

5．2 建议

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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