一种控制细菌性果斑病发生的西甜瓜种子消毒技术及其应用

摘要

本发明公开了一种控制细菌性果斑病发生的西甜瓜种子消毒技术。该技术包括用CuSO

说明书

技术领域

本发明涉及种子处理技术领域，具体为一种控制细菌性果斑病发生的西甜瓜种子 消毒技术及其应用。

背景技术

细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，BFB)是西瓜和甜瓜生产上最重要的毁灭性 种传病害，病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)，是世界性检疫病害。上世 纪90年代首次报道该病在我国造成危害，近年来在新疆、海南、内蒙、山东等多地发 生大面积严重危害，造成严重经济损失，是西甜瓜安全生产中亟待解决的问题。目前 国际上定义细菌性果斑病是一种种传病害。虽然目前还没有完全确认细菌性果斑病菌 的侵染和致病途径，但是已经确认种子带菌是导致田间病害发生的主要途径之一，因 此，通过种子消毒处理是减少甚至完全控制西甜瓜细菌性果斑病发生的重要环节。

生产上目前多采用常规种子消毒方法来控制果斑病的发生，即在种子采收后马上 进行短时间的药剂浸泡。常用的消毒药剂有：索纳米、盐酸或次氯酸钠、甲醛等溶液。 还要求处理后的种子及时晾晒，并保证处理后未完全干燥前不再接触任何病原菌，避 免发生二次污染。对经过常规消毒处理的种子的实验室检测结果以及生产上的实际种 植结果表明，以上方法处理并不能完全杀灭种子携带的病原菌，对一些严重污染的种 子，还要进行二次消毒。分析原因可能由于表面消毒不彻底，或者药剂不能进入种子 内部。研究结果表明，西甜瓜种子携带的果斑病致病菌(Ac)不仅可存在于种子表面， 还可能存活于种子内部。目前采用的盐酸处理等方法处理时间较短(一般推荐15-30 分钟)，不能杀灭种子内部细菌。常规种子消毒处理在实际应用上还存在另一个缺陷， 那就是对种子生理质量的影响。对普通二倍体西瓜种子，用盐酸溶液处理后如果不能 完全洗净，则盐酸可能进入种子内部，烧伤种胚，使种子活力降低或完全失活。因此 在盐酸处理过程要求从种子处理到完全干燥的全过程都要严格遵循操作规程要求。

三倍体西瓜种子比起普通二倍体西瓜种子活力较低，成苗较困难。种子采收过程 不能采用发酵处理，使种子携带致病菌的可能性增加。另一方面，常规消毒处理方法 基本不能适用于三倍体西瓜种子，表现在处理后种子的发芽率有不同程度的降低。目 前还没有专门有效针对三倍体西瓜种子BFB的消毒技术的研究，生产上也亟需相关方 法提高三倍体西瓜种子健康，控制BFB的发生。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种西甜瓜种子的消毒方法。

上述所述的西瓜种子和/或甜瓜种子的消毒方法，包括如下步骤：用CuSO₄水溶液 对种子进行消毒。

上述方法中，所述的用CuSO₄水溶液对种子进行消毒的方法为：将所述CuSO₄水溶 液与固体基质混合，然后将种子拌入其中，进行引发处理。

上述方法中，所述CuSO₄水溶液的质量百分浓度为大于等于0.05％、大于等于1％、 0.05％-2％、0.1％-2％或1％-2％。

上述方法中，所述CuSO₄水溶液的质量百分浓度具体为：0.05％、0.1％、0.5％、1％ 或2％。

上述方法中，所述引发处理就是将种子拌入其中后，进行静置。

上述方法中，所述引发处理的温度为20℃。

上述方法中，所述引发处理的时间需要通过预备试验来确定，不同品种、不同批 次种子的最佳处理时间不同。

上述方法中，所述具体的引发处理时间为23小时、24小时或25小时。

上述方法中，所述固体基质与所述CuSO₄水溶液的重量比为3:2。

上述方法中，所述固体基质为蛭石。

上述方法中，所述在将种子拌入其中并放置之后，还需将种子表面的固体基质和 水分去除。

上述方法中，所述用CuSO₄水溶液对种子进行消毒的方法中，还包括向所述CuSO₄水溶液和所述固体基质的混合物中加入杀真菌剂的步骤。

上述方法中，所述杀真菌剂的加入量为每公斤CuSO₄溶液中加入2克。

上述方法中，所述杀真菌剂为福美双或白菌清等药剂。

上述方法中，所述种子为西瓜种子或甜瓜种子；所述西瓜种子具体为二倍体西瓜 种子或三倍体西瓜种子。

本发明的另一个目的是上述所述的种子消毒方法在控制或辅助控制西甜瓜细菌性 果斑病发生中的应用。

本发明的消毒处理技术效果明显，具体表现在两个方面：首先，对BFB致病菌携 带种子，种子处理后用实生苗方法检测未见苗期BFB发生，并且在整个生长期未产生 任何可见不良影响。其次，对普通二倍体西瓜种子，处理后种子的发芽速度和整齐度 得到明显提高，对三倍体西瓜种子，除上述效果，还能提高种子最终发芽率，生产上 应用时，可以不对种子进行嗑籽处理，而达到或接近相应的发芽率水平。

与目前所用的其它西甜瓜种子消毒处理方法相比，该技术方法所用试剂用量少， 也不是强腐蚀性酸碱，不会造成烧伤种胚等现象，对种子、操作人员、环境安全，更 不会产生大量腐蚀性废液污染环境。目前生产上由于种子处理不充分，带菌种子田间 生长阶段，为了控制病害的发生和蔓延，需要多次、大量用药，而应用该技术处理种 子，生产健康合格种子，田间生长过程的用药量必然大大减少或完全不用，是保证绿 色西甜瓜产品生产的有效措施。

本发明提供了一种控制细菌性果斑病发生的西甜瓜种子消毒技术及其应用。研究 表明，通过该方法处理西甜瓜种子，能有效杀灭种子携带的细菌性果斑病致病菌。同 时，通过固体基质引发处理，能有效提高二倍体西瓜种子萌发速度和整齐度，还能减 轻三倍体西瓜种子的萌发障碍，提高种子最终发芽率。只要固体基质引发条件适宜， 试验的所有品种、批次的种子的最终发芽率均能达到或接近嗑籽处理的种子发芽率水 平。

附图说明

图1为不同品种、不同批次三倍体西瓜种子的引发效果。

图2为不同处理对不正常苗产生的影响。

图3为不同处理种子播种14天后幼苗发病情况比较。A为CuSO₄浓度为零的固体 基质处理带菌种子时的幼苗发病情况；B为CuSO₄溶液浓度为1％时的固体基质处理带 菌种子时的幼苗发病情况。

图4为消毒处理后西瓜种子携带Ac的分子检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料：国蜜1、国蜜2、京玲、京秀、京欣3和印度无籽1为三倍体西瓜品种； 京欣1、京欣2为二倍体西瓜品种。公众可从北京京研益农科技发展中心获得。

试验所用的所有带菌种子均为通过分子检测和幼苗生长方法确认的自然Ac带菌 种子。

种子Ac带菌的分子鉴定方法：采用文献“宋顺华，等.西瓜果腐病种子带菌的PCR 检测.种子，2007，26(12)：24-26”中的方法对种子Ac带菌进行分子鉴定。

种子BFB带菌的幼苗生长鉴定方法：采用高湿度、高密度幼苗生长方法。试验在 35cm(长)×22cm(宽)×22cm(高)的带盖半透明塑料筐中进行。筐中先放入2700g 混合好的湿蛭石(蛭石/水重量比为5/4)，压实后在表面均匀放入试验种子，种子上盖 900g与底层同样适度的湿蛭石，再覆盖1140g混好的湿沙(沙/水重量比为10/1.4)。 每筐中试验1000粒种子，每处理2个重复。每天观测幼苗生长情况，随时将发生可疑 症状的幼苗拔出后用分子方法进行检测。

实施例1、种子的消毒方法及其对种子萌发的影响

1、种子的消毒方法

(1)种子的消毒方法

蛭石与水按重量比为3∶2的比例混匀，再分别将国蜜1(三个批次)、国蜜2、京 玲、京秀、京欣3和印度无籽1均匀拌入基质中。置于20℃条件下，对国蜜1、国蜜 2和京玲种子进行23小时的引发处理，对印度无籽1种子进行25小时的引发处理， 对京秀、京欣3种子进行24小时的引发处理。引发处理结束后，筛去基质，快速洗去 种子表面的蛭石，用吸水纸快速擦去种子表面的水分后(如果是大量种子试验时处理 种子装在尼龙袋中用甩干机甩水2分钟)，将种子摊在滤纸上室温下晾干。

(2)种子的发芽试验

将蛭石与水按照5∶4的比例混匀后作为发芽基质，压紧后高度5cm，放入干种子， 上部再覆盖2cm湿蛭石。发芽盒前3天盖盖，置于25℃，8h光照/16h黑暗条件下发 芽。每处理试验100粒种子，4个重复。以子叶出土2/3以上计为发芽。置床后14天 调查最终发芽率。

2、种子的嗑籽处理

将国蜜1(三个批次)、国蜜2、京玲、京秀、京欣3和印度无籽1分别用室温自 来水浸泡1小时，捞出后擦去种子表面水分，再用镊子在种子胚根即将露出的一端轻 捏，使尖端上下种皮间出现裂缝。处理后的种子播种，开始发芽试验。

3、种子消毒方法对西瓜种子萌发特性的影响

图1为8个不同品种、批次的西瓜种子固体基质引发效果及嗑籽处理效果比较， 以未作任何处理的国蜜1(三个批次)、国蜜2、京玲、京秀、京欣3和印度无籽1为 对照。图中同一品种不同处理不同字母表示差异极显著。

结果表明：所有试验材料均存在一定程度的萌发障碍，表现为嗑籽处理与对照处 理的种子的发芽率存在一定差异；通过适宜条件的固体基质引发处理，种子发芽率能 达到或接近嗑籽种子的发芽率水平。

实施例2、不同浓度硫酸铜溶液引发处理对种子萌发的影响

蛭石与不同浓度的CuSO₄溶液按重量比为3∶2的比例混匀，再将京欣1种子均匀 拌入基质中。置于20℃条件下，引发处理24小时。引发处理结束后，筛去基质，快 速洗去种子表面的蛭石，用吸水纸快速擦去种子表面的水分后(如果是大量种子试验 时处理种子装在尼龙袋中用甩干机甩水2分钟)，将种子摊在滤纸上室温下晾干，结果 如表1所示。

从表1可以看出，所有处理与对照种子(未经任何处理的带菌种子)不同时间测 定的发芽率均存在明显的差异，在种子萌发早期，对照与处理间为极显著差异，最终 发芽率(14d)为显著差异。而不同处理间没有明显差异。用试验所设定的几个浓度的 溶液进行引发处理，均可以对种子萌发特性产生显著影响，提高了种子萌发速度和14 天时的成苗率，而且在此浓度范围内药剂的使用没有对种子萌发产生不利影响。

表1.不同浓度硫酸铜溶液引发处理对西瓜种子发芽的影响

注：数字后不同大写字母为差异极显著(P＜0.01)；不同小写字母为差异显著(P＜0.05)

实施例3、药剂引发对种子健康的影响及种子BFB带菌情况的PCR检测

1、药剂引发对种子健康的影响

蛭石与不同浓度的CuSO₄溶液按重量比为3∶2的比例混匀，再将一份确认自然携 带BFB病菌的京欣2种子均匀拌入基质中。置于20℃条件下，引发处理24小时。引 发处理结束后，筛去基质，快速洗去种子表面的蛭石，用吸水纸快速擦去种子表面的 水分后(如果是大量种子试验时处理种子装在尼龙袋中用甩干机甩水2分钟)，将种子 摊在滤纸上室温下晾干，用幼苗生长方法鉴定处理种子的健康情况，结果如表2所示。

结果表明：种子播种9天后，不同处理之间BFB发病幼苗数有明显差异。其中， 用水处理(CuSO4浓度为零)的种子发病最严重，达到4.8％；当CuSO₄浓度为0.05-0.5％ (质量百分含量)时，幼苗发病明显减少；当CuSO₄浓度≥1％(质量百分浓度)时， 处理种子播种后没有BFB发生，效果非常显著。

表2不同浓度药剂处理种子苗期BFB发病情况

在播种后22天，对所有幼苗进行逐一检测，将不正常苗进行计数(图2)。结果 表明：除健康对照种子不正常苗比例较低外，其余处理的不正常苗比例较高。当处理 浓度为0.1-2％时，不正常苗比例比阳性对照降低。图3A为CuSO₄浓度为零的固体基质 处理带菌种子时的幼苗发病情况；图3B为CuSO₄溶液质量百分浓度为1％时的固体基 质处理带菌种子时的幼苗发病情况。

2、药剂处理种子BFB带菌情况的PCR检测

根据表2的统计结果，初步认为在CuSO₄质量百分浓度≥1％时，可有效抑制种子 BFB发生。用此条件再次对带菌京欣2种子进行了引发，处理后的种子用PCR方法进 行了Ac检测，结果如图4所示。结果表明：经过处理的种子仍可检测到Ac特殊条带的 存在，但是条带颜色明显变浅，即扩增量减少，呈弱阳性。

实施例4、西甜瓜种子消毒方法的形成及初步田间种植试验效果

在上述试验结果的基础上，将处理方法进行改进，初步形成了一种新的种子消毒 方法。其方法的核心是：用质量百分浓度为1％的CuSO₄溶液对种子进行引发处理，处 理前在固体基质中加入福美双(每公斤CuSO₄溶液加入2克)或其它杀真菌剂；处理 后的种子快速洗去种子表面的固体基质，甩干水分，平摊或用吹风方法干燥，不能加 热干燥或太阳下暴晒。

对多品种、多批次的带菌三倍体西瓜种子用质量百分浓度为1％的CuSO₄溶液进行 引发处理，并对处理后的种子进行了连续四年的田间种植试验。结果表明：处理后种 子活力有明显提高，种子萌发特性也得到明显改善，同时未发现BFB的发生，在后期 生长过程也未见细菌性果斑病的发生。初步证明这一方法可以在生产上应用。