一种茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

摘要

本发明提供了一种茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法，以及由此得到的茜草配方颗粒标准指纹图谱。本发明的建立方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备（2）高效液相色谱分析。本发明方法所获得的茜草配方颗粒水溶液高效液相色谱标准指纹图谱共有色谱峰11个，其保留时间分别为6.072min、6.559min、8.087min、9.170min、12.118min、20.988min、29.251min、32.211min、33.189min、38.430min、45.431min。茜草配方颗粒脂溶性成分HPLC标准指纹图谱共有色谱峰共有9个，其保留时间分别为12.156min、12.832min、14.552min、22.615min、23.291min、25.412min、27.356min、34.383min、37.076min。本发明供试品制作简便，色谱条件容易实现，方法的稳定性和重现性好，能有效控制茜草配方颗粒质量，为茜草配方颗粒的质量控制提供参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药配方颗粒指纹图谱的建立方法，特别是茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的茜草配方颗粒标准指纹图谱，属于药物分析技术领域中。

背景技术

茜草配方颗粒是通过对中药茜草进行提取、浓缩、制粒所得。茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L. 的干燥根和根茎，主产于安徽、江苏、山东、河南、陕西。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。茜草性味苦寒，归肝经，用于凉血、祛瘀、止血、通经，主治吐血、衄血、崩漏、外伤出血、瘀阻经闭、关节痹痛、跌扑肿痛。临床包括茜草和茜草炭的使用。

《中国药典》2010年版对茜草的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献也对茜草中化学成分进行阐述，包括茜草素、羟基茜草素等蒽醌及其苷类，大叶茜草素，茜草内酯等萘醌及其苷类，环己肽类，三萜类，多糖等成分，但是对于茜草配方颗粒这样有效成分类型多、组分复杂的中药制剂，仅测定某类成分的含量，难以客观、有效地评价或控制药材的质量。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。色谱指纹图谱技术作为一种多组分复杂样品的有效质量控制方法，能够反映出待测样品的整体性、特征性，目前已被广泛用于中草药及其各种制剂的质量控制。目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，由于高效液相色谱（HPLC）具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，且中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。但目前还未见有利用高效液相色谱（HPLC）方法对茜草配方颗粒指纹图谱进行测试和分析的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的茜草配方颗粒标准指纹图谱，该方法及图谱可提供一种能有效控制茜草配方颗粒质量的方法，为茜草配方颗粒的质量控制提供参考。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取茜草配方颗粒置于具塞锥形瓶中，加入蒸馏水溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒水溶液；移取茜草配方颗粒水溶液至分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取后，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒脂溶性成分溶液；

（2）高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱分析仪进行高效液相色谱测定，得到指纹图谱，色谱分析条件为：色谱柱为绿百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus，4.6mm×250mm，5μm；检测波长250nm；流动相为甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脱，流速为0.9-1.1mL/min；其中，梯度洗脱具体程序如下：

a、茜草配方颗粒水溶液的梯度洗脱程序为：

0~20 min：甲醇浓度由5%匀速增加至30%，

20~25 min：甲醇浓度由30%匀速增加至50%，

25~40 min：甲醇浓度由50%匀速增加至70%，

40~60 min：甲醇浓度由70%匀速增加至100%，

60~70 min：甲醇浓度保持在100%；

b、茜草配方颗粒脂溶性成分溶液的梯度洗脱程序为：

0~10 min：甲醇浓度由5%匀速增加至50%，

10~60 min：甲醇浓度由50%匀速增加至100%，

60~70 min：甲醇浓度保持在100%。

本发明最优的技术方案为采用如下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取茜草配方颗粒0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒水溶液；精密移取茜草配方颗粒水溶液10ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒脂溶性成分溶液；

（2）高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱分析仪进行高效液相色谱测定，得到指纹图谱，色谱分析条件为：色谱柱为绿百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus，4.6mm×250mm，5μm；检测波长250nm；流动相为甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脱，流速为1mL/min；其中，梯度洗脱具体程序如下：

a、茜草配方颗粒水溶液的梯度洗脱程序为：

0~20 min：甲醇浓度由5%匀速增加至30%，

20~25 min：甲醇浓度由30%匀速增加至50%，

25~40 min：甲醇浓度由50%匀速增加至70%，

40~60 min：甲醇浓度由70%匀速增加至100%，

60~70 min：甲醇浓度保持在100%；

b、茜草配方颗粒脂溶性成分溶液的梯度洗脱程序为：

0~10 min：甲醇浓度由5%匀速增加至50%，

10~60 min：甲醇浓度由50%匀速增加至100%，

60~70 min：甲醇浓度保持在100%。

采用上述最优的技术方案所得到的茜草配方颗粒水溶液HPLC标准指纹图谱共有色谱峰11个，其保留时间分别为1号峰6.072 min、2号峰6.559 min、3号峰8.087 min、4号峰9.170 min、5号峰12.118 min、6号峰20.988 min、7号峰29.251 min、8号峰32.211 min、9号峰33.189 min、10号峰38.430 min、11号峰45.431 min；所得到的茜草配方颗粒脂溶性成分HPLC标准指纹图谱共有色谱峰共有9个，其保留时间分别为1号峰12.156min、2号峰12.832min、3号峰14.552min、4号峰22.615min、5号峰23.291min、6号峰25.412min、7号峰27.356min、8号峰34.383min、9号峰37.076min。

本发明最优技术方案的获得是通过如下实验得到，说明如下。

本发明所用实验材料为由广东一方制药有限公司生产的茜草配方颗粒；所用仪器包括：高效液相色谱仪：Waters e2695系列（型号：Waters e2695，厂家：美国Waters公司），包括PDA二极管阵列检测器（型号：Waters 2998，厂家：美国Waters公司）和Empower工作站（美国Waters公司）；色谱柱：绿百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)，天平：千分之一天平（上海恒平JA2003），万分之一天平（Sartorius BS224S），十万分之一天平（Precisa XR205SM DR）；超纯水系统（美国Millipore(密理博)公司）；本发明所用试剂与试药包括：甲醇、乙酸乙酯、磷酸等均为国产分析纯；HPLC用甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck公司，Darmstadt，Gemany）；水为超纯水（电阻率18.2mΩ.cm）。

1、供试品溶液的制备

（1）提取溶剂的选择

经文献检索，茜草的提取溶剂常用甲醇、乙酸乙酯，配方颗粒指纹图谱的研究常用溶剂为乙醇、甲醇、水。因此分别采用甲醇、乙醇、水作为提取溶剂对茜草配方颗粒进行提取，由于茜草配方颗粒是由茜草水提液浓缩而成，故水溶性强，能完全溶于水，而在甲醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇中不能完全溶解，通过比较各种溶剂提取物色谱图，水提取物的主要色谱峰信息较多，因此选用蒸馏水作为溶剂对茜草配方颗粒进行溶解，再用乙酸乙酯进行萃取，对其中的脂溶性成分进行研究。

样品处理：精密称定茜草配方颗粒粉末各0.5g，分别精密加入20mL溶剂（即水、醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇）溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。主要成分色谱图比较结果见图1。精密移取溶液10ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒脂溶性成分溶液，色谱图见图2。

（2）最终提取方案

取茜草配方颗粒粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20mL，溶解，摇匀，过滤，取续滤液，即得茜草配方颗粒水溶液；精密移取溶液10ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒脂溶性成分溶液。

2、色谱分析条件的确定

（1）流动相的选择

茜草配方颗粒所含成分复杂，且极性范围跨度比较大，等度洗脱很难分离，故采用梯度洗脱方式。比较甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-0.05%磷酸水系统的洗脱效果。

从实验过程中所优化的洗脱程序中选择分离效果较好的洗脱程序，分别用甲醇-水，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸水作为流动相，对同一份样品进行测定，比较它们的图谱，结果采用甲醇-0.05%磷酸水系统所测定的图谱基线较平稳，主要色谱峰信息较多，因此最终选择甲醇-0.05%磷酸水作为流动相，表1为洗脱程序，图3为不同流动相洗脱比较图。

表1  洗脱程序

（2）流动相梯度

在实验过程中采用了多个不同的洗脱梯度对同一份茜草配方颗粒提取样品进行测定，通过比较不同洗脱程序所测定的样品色谱图，从中优选色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且分析时间较为合理的梯度4洗脱程序作为最终的色谱分析条件，表2为梯度1的洗脱程序，表3为梯度2的洗脱程序，表4为梯度3的洗脱程序，表5为梯度4的洗脱程序，图4为选用的梯度洗脱程序图谱。

表2 

表3 

表4 

表5

（3）检测波长的选择

通过对样品全波长检测发现，茜草配方颗粒水溶液主要的成分最大吸收波长为250 nm，脂溶性成分的最大吸收波长为250nm，所以确定波长250nm为茜草配方颗粒图谱的检测波长。

（4）不同流速考察

采用上述色谱条件，考察不同流速条件下（0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min）同一份样品的色谱图，结果各主要成分的色谱峰分离度和峰面积差异不大，其中流速1.1ml/min时压力较大，且三个不同流速以流速1.0 mL/min的图谱峰形较好，因此选用流速1.0mL/min。图7、图8为不同流速色谱图比较图。

（5）柱温的选择

考察不同柱温（15℃、25℃、35℃）对色谱峰的影响，结果显示柱温对各主要成分的色谱峰分离度、峰面积影响不大，因此柱温无需控制。图9、图10为不同柱温比较图。

（6）不同色谱柱

考察以下不同色谱柱对色谱峰的影响：①LUBEX 120-5-C18 AQ Plus（4.6 mm×250mm，5μm)；②Phenomenex Kinetex 2.6u XB-C18 100A（4.6 mm×100mm，2.6μm)；③LUBEX C18（4.6 mm×250mm，5μm)，结果显示柱②（长度较短）分离度较其他色谱柱差，柱③部分色谱峰有拖尾现象，故选择柱①，结果见图11、图12。

（7）最优色谱条件

色谱柱：绿百草Ecosil 120-5-C₁₈ AQ Plus色谱柱（4.6 mm×250mm，5μm)；

检测波长：250nm；

流动相：甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脱；

流速：1mL/min；

梯度洗脱程序如表6、表7所示：

表6水溶液梯度洗脱程序

时间（min）0~2020~2525~4040~6060~70甲醇（%）5→3030→5050→7070→100100

表7 脂溶性成分梯度洗脱程序

与现有技术相比，本发明提供的茜草配方颗粒高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱可作为一种能有效控制茜草配方颗粒质量的方法，并为茜草配方颗粒的质量控制提供参考。本发明方法供试品制作简便，色谱条件容易实现，方法的稳定性和重现性好。

附图说明

图1为不同溶剂提取茜草配方颗粒主要成分色谱图比较。

图2为乙酸乙酯萃取茜草配方颗粒水溶液主要成分色谱图。

图3为不同流动相洗脱比较图。

图4为选用的梯度洗脱程序图谱。

图5为茜草配方颗粒水溶液全波长扫描图。

图6为茜草配方颗粒脂溶性成分全波长扫描图。

图7为茜草配方颗粒水溶液不同流速色谱图比较。

图8为茜草配方颗粒脂溶性成分不同流速色谱图比较。

图9为茜草配方颗粒水溶液不同柱温色谱图比较。

图10为茜草配方颗粒脂溶性成分不同柱温色谱图比较。

图11为茜草配方颗粒水溶液不同色谱柱色谱图比较。

图12为茜草配方颗粒脂溶性成分不同色谱柱色谱图比较。

图13为空白溶剂图谱。

图14为茜草配方颗粒水溶液精密度色谱图。

图15为茜草配方颗粒脂溶性成分精密度色谱图。

图16为茜草配方颗粒水溶液重复性色谱图。

图17为茜草配方颗粒脂溶性成分重复性色谱图。

图18为茜草配方颗粒水溶液稳定性色谱图。

图19为茜草配方颗粒脂溶性成分稳定性色谱图。

图20为11批茜草配方颗粒水溶液指纹图谱比较。

图21为11批茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱比较。

图22为茜草配方颗粒水溶液指纹图谱共有模式。

图23为茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱共有模式。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例 采用本发明方法，以广东一方制药有限公司生产的茜草配方颗粒饮片为样品，建立茜草配方颗粒饮片的指纹图谱，并参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南（试行）》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比较（以中位数建立参照指纹图谱），并进行方法学考察。

指纹图谱建立步骤如下：

（1）供试品溶液的制备：取茜草配方颗粒0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒水溶液；精密移取茜草配方颗粒水溶液10ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得茜草配方颗粒脂溶性成分溶液；

（2）高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱分析仪进行高效液相色谱测定，得到指纹图谱，色谱分析条件为：色谱柱为绿百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus，4.6mm×250mm，5μm；检测波长250nm；流动相为甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脱，流速为1mL/min；其中，

茜草配方颗粒水溶液梯度洗脱程序如下：

茜草配方颗粒脂溶性成分溶液梯度洗脱程序如下：

时间（min）0~1010~6060~70甲醇（%）5→5050→100100

按上述方法进行茜草配方颗粒指纹图谱的专属性考察、仪器精密度考察、重复性试验和稳定性试验。

（1）专属性考察

考察此方法建立的茜草配方颗粒指纹图谱是否能够表达该品种的特征，即唯一性。考察茜草配方颗粒水溶液空白溶剂（水）、脂溶性成分空白溶剂（甲醇）图谱，图13为空白溶剂（水、甲醇）图谱，阴性样品在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合要求。

（2）仪器精密度试验

取同一批次供试品溶液（样品号：1205168），连续进样6次，记录指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，水溶液指纹图谱各图谱的相似系数为0.980，0.997，0.999，0.999，0.999，0.999，脂溶性成分各图谱相似系数为0.999，1.000，1.000，1.000，1.000，0.999。图14、图15为供试品仪器精密度色谱图。

（3）重复性实验

取同一批次样品(样品号：1205168)，按供试品溶液的制备方法分别制备6份供试品，

记录指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算相似度，水溶液图谱相似度为1.000，0.999，1.000，0.997，0.998，0.996，脂溶性成分图谱相似度为0.999，0.999，0.999，0.999，1.000，0.999。图16、图17为供试品重复性色谱图。

（4）稳定性试验

取同一批次供试品溶液（样品号：1205168），在室温下放置，分别于0、4、8、12、16、24h检测指纹图谱，考察样品溶液的稳定性。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件（中国药典会推荐）计算相似度，水溶液图谱相似度分别为0.980，0.999，1.000，1.000，0.999，0.999，脂溶性成分图谱相似度为0.986，0.988，0.992，0.998，0.997，0.997。图18、图19为供试品稳定性色谱图，其中S1表示0h、S2表示4h 、S3表示8h 、S4表示12h、S5表示16h、S6表示24h。

（5）茜草配方颗粒主要成分指纹图谱的共有模式建立

取11个批次的茜草配方颗粒样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到茜草配方颗粒水溶液指纹图谱及茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱，图20为茜草配方颗粒水溶液指纹图谱，图21为茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱(S1-S11分别为茜草配方颗粒1205168、1104101、1102250、1201746、1210124、1102401、1011017、1107458、1104370、1205783、1102205)。

利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，对所得指纹图谱的进行相似度比较（以中位数建立参照指纹图谱，时间窗为0.50），得到11批茜草配方颗粒的相似度，并建立茜草配方颗粒水溶液指纹图谱的共有模式（相似度均大于0.886）和脂溶性成分指纹图谱的共有模式（相似度均大于0.938），图22为茜草配方颗粒水溶液指纹图谱的共有模式（，该标准图谱共有色谱峰11个，其保留时间分别为6.072 min、6.559 min、8.087 min、9.170 min、12.118 min、20.988 min、29.251 min、32.211 min、33.189 min、38.430 min、45.431 min，表7为11批茜草配方颗粒水溶液相似度计算结果。图23为茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱共有模式图谱，该标准图谱共有色谱峰9个，其保留时间分别为12.156min、12.832min、14.552min、22.615min、23.291min、25.412min、27.356min、34.383min、37.076min，表8为11批茜草配方颗粒脂溶性成分相似度计算结果。

表7 

注：S1-S11分别为茜草配方颗粒1205168、1104101、1102250、1201746、1210124、1102401、1011017、1107458、1104370、1205783、1102205，R为茜草配方颗粒水溶液指纹图谱共有模式。

表8

注：S1-S11分别为茜草配方颗粒1205168、1104101、1102250、1201746、1210124、1102401、1011017、1107458、1104370、1205783、1102205，R为茜草配方颗粒脂溶性成分指纹图谱共有模式。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。