次级T细胞依赖抗体反应检测外源性化合物免疫抑制方法

摘要

本发明公开了一种次级T细胞依赖抗体反应检测外源性化合物免疫抑制的方法，包括以下步骤：(1)将动物注射T细胞依赖性抗原；(2)在步骤(1)所述的注射后第15～25天再次注射相同的T细胞依赖性抗原激发次级免疫应答，同时开始连续2～5天经口给予外源性化合物；(3)步骤(2)完成6～10天后，采集外周血，分离血清，检测步骤(1)所述的抗原的特异性抗体。该方法免疫应答时间更短，应答程度更强，所需的外源性化合物用量更少，并且可以应用于早期药物筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种次级T细胞依赖抗体反应检测 外源性化合物免疫抑制的方法。

背景技术

免疫毒性是外源物质使免疫系统结构或功能出现任何持久或可逆改变 的毒性反应。免疫毒性作用主要分为5种：免疫抑制、免疫增强、超敏反应、 自身免疫、免疫原性。其中免疫抑制最为常见，在免疫毒性中研究较多。

T细胞依赖性抗体反应(T cell-dependent antibody response,TDAR)是目 前用于检测外源性化合物免疫抑制的金标准。TDAR是动物在给予外源性化 合物时，同时采用T细胞依赖性抗原攻击，继续给予外源性化合物一定时间 后，采集血清检测针对该抗原的特异性抗体含量，从而判断动物的免疫系统 是否受到抑制。随着TDAR应用的推广，TDAR的缺陷也逐渐暴露出来，如 部分动物对特定T细胞依赖性抗原不敏感，个体差异较大，实验周期较长， 受试外源性化合物用量较大而难以用于早期药物筛选。

发明内容

本发明要解决的以技术问题是克服现有TDAR技术对特定T细胞依赖 性抗原不敏感，实验周期较长，受试外源性化合物用量较大而难以用于早期 药物筛选的缺陷，提供一种次级T细胞依赖抗体反应检测外源性化合物免疫 抑制的方法。本发明所述的方法，免疫应答时间更短、强度更大，所需外源 性化合物用量更少，更为迅速、灵敏，同时能够考察对免疫记忆系统的影响， 并且可以应用于早期药物筛选。

本发明采用以下技术方案来解决上述技术问题：

本发明的技术方案为：

一种次级T细胞依赖抗体反应检测外源性化合物免疫抑制的方法，包括 以下步骤：

(1)将动物注射T细胞依赖性抗原；

(2)在步骤(1)所述的注射后第15～25天再次注射相同的T细胞依赖 性抗原激发次级免疫应答，同时开始连续2～5天给外源性化合物；

(3)步骤(2)完成后第6～10天，采集外周血，分离血清，检测步骤 (1)所述的T细胞依赖性抗原的特异性抗体。

本发明所述的步骤(2)中，较佳的，所述的再次注射相同的T细胞依 赖性抗原的时间为在步骤(1)所述的注射后第20天。

本发明所述的步骤(2)中，较佳的，所述的连续经口给予外源性化合 物的时间是3天。

本发明所述的步骤(3)中，较佳的，所述的采集外周血的时间为步骤 (2)完成后第8天。

本发明所述的步骤(1)中，所述的T细胞依赖性抗原为本领域常规， 较佳的是钥孔戚血蓝素(KLH)；本发明所述的步骤(3)中，所述的特异性 抗体为本领域常规，较佳的是抗钥孔戚血蓝素IgG抗体(anti-KLH IgG抗体)。 较佳的，本发明步骤(1)所述的T细胞依赖性抗原的用量与步骤(2)所述 的T细胞依赖性抗原的用量相等。

本发明步骤(1)所述的T细胞依赖性抗原的用量为本领域常规，较佳 的是200～400μg/kg，更佳的是300μg/kg。

本发明所述的外源性化合物为本领域常规，较佳的是环孢素或环磷酰胺。 较佳的，本发明步骤(2)所述的外源性化合物为环孢素，所述的外源性化 合物的用量为7.5～30mg/Kg。

较佳的，本发明步骤(2)所述的外源性化合物为环磷酰胺，所述的外 源性化合物浓度为5～20mg/Kg。

本发明所述的动物为本领域常规，较佳的是大鼠。

本发明所述的注射为本领域常规，较佳的是静脉注射。

本发明步骤(3)所述的检测步骤(1)所述的抗原的特异性抗体的方法 为本领域常规，较佳的是采集外周血，分离血清，检测针对该抗原的特异性 抗体；更佳的是采集外周血，分离血清，检测针对该抗原的特异性抗体、计 数外周血白细胞和解剖取脏器做组织病理学检查。

本发明所述的采集外周血检测针对该抗原的特异性抗体，具体的操作步 骤是：尾静脉采血，离心分离血清，在96孔板上包被KLH，ELISA方法检 测血清中anti-KLH IgG抗体的滴度或浓度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明在给予T细胞依赖性抗原后，经过 一定时间，再给予外源性化合物以及T细胞依赖性抗原，造成次级免疫应答， 采集血清检测针对该抗原的特异性抗体含量，以评价动物免疫系统的抑制情 况。本发明所述的方法为次级TDAR，免疫应答时间更短，应答程度更强， 所需的外源性化合物用量更少，个体间差异较小，同时考察了对免疫记忆系 统的影响。并且可以应用于早期药物筛选。

附图说明

图1为次级TDAR检测不同浓度的环孢素对SD大鼠免疫抑制影响。

图2为次级TDAR检测不同浓度的环磷酰胺对SD大鼠免疫抑制影响。

图3为初级TDAR检测不同浓度的环孢素对SD大鼠免疫抑制影响。

图4为正常SD雌性大鼠胸腺的病理组织学检查图。

图5为初次免疫应答30mg/kg环孢素的SD雌性大鼠胸腺的病理组织学 检查图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

实验方法：选取生长情况良好，大小一致的SD雌性大鼠20只，尾静脉 注射300μg/kg的KLH；在第一次注射KLH第21天后，再次静脉注射 300μg/kg的KLH进行激发次级免疫应答，将被实验的大鼠平均分为4组：

在第二次注射KLH的同时，分别经口给予去离子水、7.5、15、30mg/kg 的环孢素1次；采集外周血，分离血清，采用ELISA方法检测anti-KLH IgG、 外周血白细胞计数，末次经口给予去离子水及不同浓度的环孢素后第10天 解剖取脏器做组织病理学检查。

实验结果：外周血白细胞计数显示次级免疫15、30mg/kg环孢素组出 现免疫功能抑制如表1所示；

不同用量的环孢素对anti-KLH的次级TDAR免疫抑制影响如图1所示， 其中：横坐标为采血时间，纵坐标为各时间点anti-KLH IgG滴度相对于D21 (第二次注射KLH和经口给予环孢素的前一天，作为基础水平)变化值的 对数。

实施例2

实验方法：选取生长情况良好，大小一致的SD雌性大鼠15只，尾静脉 注射300μg/kg的KLH；在第一次注射KLH第21天后，再次静脉注射 300μg/kg的KLH进行激发次级免疫应答，将被实验的大鼠平均分为3组：

在第二次注射KLH的同时，分别经口给予去离子水、5、20mg/kg的环 磷酰胺1次；采集外周血，分离血清，采用ELISA方法检测anti-KLH IgG、 外周血白细胞计数，末次经口给予去离子水及不同浓度的环磷酰胺后第10 天解剖取脏器做组织病理学检查。

实验结果：外周血白细胞计数显示次级免疫20mg/kg环磷酰胺疫功能 抑制如表1所示；可以看出，给药3天后仅20mg/kg环磷酰胺组白细胞明显 降低，其余各组均无白细胞计数变化和组织病理学改变。

不同用量的环磷酰胺对anti-KLH的次级TDAR免疫抑制影响如图2所 示，其中：横坐标为采血时间，纵坐标为各时间点anti-KLH IgG滴度相对于 D21(第二次注射KLH和经口给予环磷酰胺的前一天，作为基础水平)变化 值的对数。

表1 次级免疫应答白细胞计数

**P＜0.01

对比实施例1

实验方法：选取生长情况良好，大小一致的SD雌性大鼠20只(分为四 组，分别连续28天经口去离子水、7.5、15、30mg/kg的环孢素；第14天 尾静脉注射300μg/kg的KLH；第29天采血检测anti-KLH IgG、外周血白 细胞计数，解剖取脏器做组织病理学检查。

实验结果：不同用量的环孢素对anti-KLH的初级TDAR免疫抑制影响 如图3所示，其中：横坐标为采血时间，纵坐标为各时间点anti-KLH IgG滴 度相对于D21(第二次注射KLH和给环孢素的前一天，作为基础水平)变 化值的对数。

组织病理学检查显示，经口给予环孢素组28天后出现器质性病理学变 化。如图4、图5所示，在50倍镜下观察，与正常的雌性SD大鼠胸腺相比， 经口给予30mg/Kg环孢素后发生免疫应答的胸腺，髓质缩小，皮质增厚。

与对比实施例相比，实施例1-2，免疫应答时间更短，时间缩短了：在 给药后5天出现免疫应答，并在第8天达到峰值；应答程度更强：所测得的 次级免疫应答第8天特异性抗体量约为D21(第二次注射KLH和经口给予 环孢素或环磷酰胺的前一天，作为基础水平)的1×10^3.5倍；所需的外源性 化合物用量更少：环孢素常规方法给药28天，本发明给药3天、环磷酰胺 常规方法给药28天，本发明给药3天；并且考察了对免疫记忆系统的影响。