一组人肺腺癌和人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组人肺腺癌和人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物、相关试剂盒以及他们的用途。本发明提供一组人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物，所述LncRNA生物标志物包括：uc001gzl.3、ENST00000434223、uc004bbl.1、ENST00000540136和NR_034174。本发明所提供的人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物，可用来区分人早期肺腺癌和人结直肠癌，其区分早期肺腺癌和配对正常肺组织的AUC可达0.978，灵敏度和特异性分别为92%和98%。而对于结直肠癌样本的诊断其AUC亦可达到0.963，灵敏度和特异性分别为94.4%和88.9%。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组人肺腺癌和人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物、相关试剂盒以及他们的用途。

背景技术

非小细胞肺癌是造成全世界癌症相关死亡的首要原因。它主要包括四种组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和其他(神经内分泌癌，良性肿瘤等)。非小细胞肺癌的五年生存率低于15％，早期诊断能有效的降低其死亡率。早期检测肺腺癌尤其重要，因为它是最常见的非小细胞肺癌类型。了解肺腺癌的遗传和分子失调机理是用于肺腺癌早期诊断的关键。

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，为西方经济发达国家第2位高发性恶性肿瘤，在中国，结直肠癌占消化道癌的第2位。大部分结直肠癌患者早期没有症状，超过75％的患者确诊时已属于晚期。发掘结直肠癌相关的新型生物标志物有助于进一步阐明其发病机制，同时也能为结直肠的诊治提供新靶点。

最近的研究表明90％的基因组转录成非编码RNA。非编码RNA最初被认为是“转录噪声”。然而，越来越多的证据表明这些非编码RNA在许多生理学过程中都有重要的生物学作用。非编码RNA可以分为短链非编码RNA(小于200bp)和长链非编码RNA(长于200bp)。长链非编码RNA(LncRNA)可以分为反义长非编码RNA，内含子非编码RNA(LincRNA)，启动子相关LncRNA和非翻译区LncRNA。先前的研究结果表明，LncRNA在多种细胞和生物学过程中都有重要作用，例如增殖、细胞周期、染色体重塑和组蛋白修饰。另外，它们的异常表达与多种肿瘤相关，包括乳腺癌，胃癌，肝细胞性肝癌和前列腺癌。然而，LncRNA在肺腺癌和结直肠癌中的生物学功能以及LncRNA的表达与肺腺癌及结直肠癌之间的关系还处于未知阶段。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一组人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的LncRNA生物标志物对于人肺腺癌和人结直肠癌具有很高的灵敏度和特异性，尤其对人早期肺腺癌和/或人结直肠癌具有很好的检测效果，可以作为新型的生物标志物用于肺腺癌和/或结直肠癌的检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一组人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物，所述LncRNA生物标志物包括：uc001gzl.3、ENST00000434223、uc004bbl.1、ENST00000540136和NR_034174。

优选的，所述人肺腺癌为人早期肺腺癌，所述人结直肠癌为人早期结直肠癌。

所述uc001gzl.3的序列如Seq ID No：1所示；

所述ENST00000434223的序列如Seq ID No：2所示；

所述uc004bbl.1的序列如Seq ID No：3所示；

所述ENST00000540136的序列如Seq ID No：4所示；

所述NR_034174的序列如Seq ID No：5所示。

优选的，所述LncRNA生物标志物还包括：ENST00000568243、uc001gch.1、NR_047562、ENST00000442037和NR_038125。

所述ENST00000568243的序列如Seq ID No：6所示；

所述uc001gch.1的序列如Seq ID No：7所示；

所述NR_047562的序列如Seq ID No：8所示；

所述ENST00000442037的序列如Seq ID No：9所示；

所述NR_038125的序列如Seq ID No：10所示。

本发明第二方面提供所述LncRNA生物标志物在制备或筛选人肺腺癌和/或人结直肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。

本发明第三方面提供一组人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA引物、标记物的组合，所述LncRNA引物包括：LncRNA的反转录引物、uc001gzl.3引物、ENST00000434223引物、uc004bbl.1引物、ENST00000540136引物、NR_034174引物。

优选的，所述LncRNA的反转录引物为随机引物。

优选的，uc001gzl.3引物包括序列如SEQ ID No：11所示的定量PCR前引物，序列如SEQID No：12所示的定量PCR后引物；ENST00000434223引物包括序列如SEQ ID No：13所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：14所示的定量PCR后引物；uc004bbl.1引物包括序列如SEQ ID No：15所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：16所示的定量PCR后引物；ENST00000540136引物包括序列如SEQ ID No：17所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：18所示的定量PCR后引物；NR_034174引物包括序列如SEQ ID No：19所示的定量PCR前引物、序列如SEQ ID No：20所示的定量PCR后引物。

优选的，所述标记物为SYBR Green。

优选的，所述LncRNA引物还包括：ENST00000568243引物、uc001gch.1引物、NR_047562引物、ENST00000442037引物和NR_038125引物。

更优选的，ENST00000568243引物包括序列如SEQ ID No：21所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：22所示的定量PCR后引物；uc001gch.1引物包括序列如SEQ ID No：23所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：24所示的定量PCR后引物；NR_047562引物包括序列如SEQ ID No：25所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：26所示的定量PCR后引物；ENST00000442037引物包括序列如SEQ ID No：27所示的定量PCR前引物，序列如SEQ ID No：28所示的定量PCR后引物；NR_038125引物包括序列如SEQ ID No：29所示的定量PCR前引物、序列如SEQ ID No：30所示的定量PCR后引物。

本发明第四方面提供所述的LncRNA引物、标记物的组合在制备或筛选人肺腺癌和/或人结直肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。

本发明第五方面提供一种人肺腺癌和/或人结直肠癌的肿瘤诊断试剂盒，包括所述的LncRNA引物、标记物的组合。

优选的，所述试剂盒还可包括dNTP、随机引物、还原剂、RNase抑制剂、反转录酶、MgCl₂和PCR缓冲液等中的一种或多种的组合。

本发明第六方面提供一种检测人肺腺癌和/或人结直肠癌的LncRNA芯片，其特征在于，所述LncRNA芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的如权利要求1所述的LncRNA生物标志物的探针。

本领域技术人员可根据经验，设计能够检测相关LncRNA生物标志物的探针，如本领域已经被广泛使用的荧光探针等。具体来说，所述荧光探针可以为寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针对应于LncRNA部分或全部序列。

本发明所提供的人肺腺癌和/或人结直肠癌诊断用LncRNA生物标志物，可用来区分人早期肺腺癌和人结直肠癌。其区分早期肺腺癌和配对正常肺组织的AUC可达0.978，显著性高于这5个LncRNAs单独诊断早期肺腺癌的AUC(p<0.05)，其ROC曲线表明这5个LncRNAs诊断早期肺腺癌的灵敏度和特异性分别为92％和98％，显著性高于单个LncRNA用于肺腺癌诊断的灵敏度和特异性(p<0.05)。而对于结直肠癌样本的诊断其AUC亦可达到0.963，灵敏度和特异性分别为94.4％和88.9％，说明本发明所提供的LncRNAs的组合亦可以作为结直肠癌检测的生物标志物。

附图说明

图1显示为本发明10个LncRNAs联合起来区分训练集(n＝50)肺腺癌及其配对正常肺组织的ROC曲线图；

图2-A显示为本发明5个LncRNAs联合起来区分训练集(n＝50)肺腺癌及其配对正常肺组织的ROC曲线图；图2-B显示为本发明5个LncRNAs联合起来区分验证集(n＝63)肺腺癌及其配对正常肺组织的ROC曲线图。

图3显示为本发明10个LncRNAs联合起来区分结直肠癌及其配对正常结直肠组织的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

1 临床样本收集：

收集复旦大学附属中山医院2011-2014年期间存档的早期肺腺癌冰冻新鲜组织标本及其配对正常肺组织113对。所有病人对参与科学研究均有知情同意。

2 LncRNA定量PCR实验：

2.1 RNA抽提及定量PCR

利用Trizol从冰冻组织中抽提总RNA，用微体积分光光度计对RNA进行定量。

2.2 内参基因及引物

内参基因选用GAPDH，GAPDH和本发明所提供的一组LncRNA生物标志物的引物序列如表1所示：

表1 定量PCR使用的引物序列

2.3 逆转录反应

使用SuperScriptⅢFirst Strand Synthesis System试剂盒进行逆转录，RNA起始量为1μg，逆转录反应组分的用量如表2所示，反应条件：65℃下孵育5min，完成后至少在冰上放置1min；再在所得产物中加入逆转录反应混合液体，混匀后分别在25℃下孵育10min、50℃下孵育50min、85℃下孵育5min，逆转录反应混合液体的用量如表3所示；完成后在每个反应所得产物中加入1μl RNaseH，37℃下孵育20min后低温保存备用。

表2 逆转录反应组分

表3 逆转录反应混合液体(mix)

2.4 实时定量PCR反应

定量PCR使用LightCycler480SYBR Green Ⅰ master，定量仪器为LightCycler480。反应体系如表4所示，反应条件如表5所示步骤、每个实时定量PCR反应和对照做三个重复：

表4 实时定量PCR预混液

表5 实时定量PCR热循环参考值

使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据以平均值±标准差的形式表示，除非有特殊的说明。肺腺癌与其配对正常肺组织中lncRNA的表达差异统计使用配对样本t检验的方法，所有p值均为双侧，p<0.05被认为有统计学意义。

2.5 10个LncRNAs区分肺腺癌及其配对正常肺组织的能力评估

我们利用ROC曲线来评估这10个LncRNAs(基因ENST00000568243、uc001gch.1、ENST00000434223、uc004bbl.1、NR_047562、ENST00000540136、ENST00000442037、NR_038125、NR_034174和uc001gzl.3)区分肺腺癌及其配对正常肺组织的能力。单个LncRNA用于肺腺癌诊断的AUC为0.721-0.853，灵敏度为66-87％，特异性为62-86％(如表6所示)。我们将这10个LncRNAs联合起来用于50对肺腺癌样本的诊断，其AUC可达到0.994(如图1)，灵敏度和特异性均为96％。

表6 10个LncRNAs在训练集(50对样本)中的诊断结果

¹p值和AUC都是用内参基因GAPDH归一化后得到的。

2.6.1 5个LncRNAs区分肺腺癌及其配对正常肺组织的能力评估

我们利用ROC曲线来评估5个LncRNAs(ENST00000540136,NR_034174,uc001gzl.3,uc004bbl.1和ENST00000434223)区分肺腺癌及其配对正常肺组织的能力。这5个LncRNAs结合起来区分早期肺腺癌和配对正常肺组织的AUC可达0.978(如图2-A所示)，显著性高于这5个LncRNAs单独诊断早期肺腺癌的AUC(p<0.05)。ROC曲线下面积表明这5个LncRNAs诊断早期肺腺癌的灵敏度和特异性分别为92％和98％，显著性高于单个LncRNA用于肺腺癌诊断的灵敏度和特异性(p<0.05)。

2.6.2 5个LncRNAs区分另一组肺腺癌及其配对正常肺组织的能力评估

我们在另外一组63例肺腺癌样本及其配对正常肺组织(验证集)中验证从训练集筛选出的这5个LncRNAs的检测特性。这5个LncRNAs在肺腺癌及其配对正常肺组织均中有显著性表达差异(p<0.001)。单个LncRNA用于检测肺腺癌的AUC为0.719-0.882，灵敏度为77.8-85.2％，特异性为60.3-84.1％(表7)。这5个LncRNAs联合检测63对肺腺癌样本的AUC可达0.987(图2-B)，灵敏度为96.8％，特异性为92.1％，这均显著性高于任何单个LncRNA的检测能力(p<0.05)。并且，这组LncRNAs在两组独立样本(训练集和验证集)中具有类似的检测能力，说明这组LncRNAs可以作为肺腺癌早期检测的生物标志物。

表7 5个LncRNA在验证集(63对样本)中的诊断结果

¹p值和AUC都是用内参基因GAPDH归一化后得到的。

实施例2

1 临床样本收集：

收集上海交通大学附属瑞金医院2013年的结直肠癌冰冻新鲜组织标本及其配对正常结直肠组织18对。所有病人对参与科学研究均有知情同意。

2 LncRNA定量PCR实验：

2.1 RNA抽提及定量PCR

利用Trizol从冰冻组织中抽提总RNA，用微体积分光光度计对RNA进行定量。

2.2 内参基因及引物

内参基因选用GAPDH，内参基因及各LncRNA生物标志物的引物序列如实施例1中的表1所示。

2.3 逆转录反应、实时定量PCR反应

逆转录反应、实时定量PCR反应的具体方法、步骤和反应体系与实施例1相同。使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据以平均值±标准差的形式表示，除非有特殊的说明。结直肠癌与其配对正常结直肠组织中lncRNA的表达差异统计使用配对样本t检验的方法，所有p值均为双侧，p<0.05被认为有统计学意义。

2.4 10个LncRNAs区分结直肠癌及其配对正常结直肠组织的能力评估

我们利用ROC曲线来评估这10个LncRNAs(基因ENST00000568243、uc001gch.1、ENST00000434223、uc004bbl.1、NR_047562、ENST00000540136、ENST00000442037、NR_038125、NR_034174和uc001gzl.3)区分结直肠癌及其配对正常结直肠组织的能力。单个LncRNA用于结直肠癌诊断的AUC为0.750-0.889，灵敏度为66.7％-88.9％，特异性为55.6％-83.3％(如表8所示)。我们将这10个LncRNAs联合起来用于18对结直肠癌样本的诊断，其AUC可达到0.963(如图3)，灵敏度和特异性分别为94.4％和88.9％，说明这些LncRNAs完全可以作为结直肠癌检测的生物标志物。

表8 10个LncRNAs结直肠癌(18对样本)中的诊断结果

¹p值和AUC都是用内参基因GAPDH归一化后得到的。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。