N6-(2-羟乙基)腺苷在抗肾衰竭中的用途

摘要

本发明提供N6-(2-羟乙基)腺苷在制备用于治疗抗肾衰竭作用制剂中的用途，通过施加N6-(2-羟乙基)腺苷，可以明显降低肾衰竭或肾缺血再灌注损伤中肌苷、尿素氮的水平，抑制肾小管上皮细胞凋亡以及肾脏炎症反应。可以应用于肾衰竭、肾移植、肾脏缺血再灌注损伤、肾结石碎石炎症及其他肾炎等多种治疗用途。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别的，属于一种从蝉花虫草等虫草类真菌中提出的活性物质(或人工合成该活性物质)对于肾衰竭或肾脏缺血再灌注损伤中的保护的运用。 

背景技术

蝉花虫草(Ophiocordyceps sobolifera)属于虫生真菌,寄生在蝉若虫上，是蝉(Platilomia pieli koto)羽化前在泥土中被蝉花虫草【无性型曾命名为蝉拟青霉(peacilomyces cicadae)】真菌寄生，最后于接近地面约3-4cm处，头部长出多跟子实体而形成的蝉与菌的复合体，其药用始载于南北朝的《雷公炮炙论》，同比冬虫夏草(O.sinensis)早800年。唐慎微所著《经史证类备急本草》言“蝉花味甘寒,无毒,主小儿天吊,惊痫,瘛,夜啼,心悸”^[1]。蝉花含肝糖、虫草酸、多种必需氨基酸、D一甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等有效成分^[2]。 

经研究表明蝉花虫草及其人工培养物具有抗肾衰竭作用。陈以平教授以蝉花代冬虫夏草进行临床研究，发现其具有降低血尿素氮、肌酐，提高内生肌酐清除率，改善血清蛋白含量，减少尿蛋白的排出等功能。蝉花能明显延缓慢性肾功能衰竭大鼠的病情进展，由本研究组培养提供的蝉花人工物亦有相同功效[5]。通过分离人胚胎肾小球系膜细胞,进行体外培养,观察人工培育蝉花对人肾小球系膜细胞(HMc)增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响。人工蝉花菌丝组能显著抑制HMC增殖，与正常对照组相比，人工蝉花菌丝组能显著抑制FN的合成，与正常对照组相比其作用与洛汀新组相近。说明人工蝉花菌丝可有效减缓肾小球硬化及肾纤维化[6]。朱戎等[7]通过探讨人工液体培养法培育的蝉花菌丝对5/6肾切除大鼠肾小球硬化的干预作用及其作用机制的实验，得出了液体培养蝉花菌丝能改善慢性肾衰竭大鼠的肾功能，减轻肾组织内炎性细胞浸润和细胞增生，延缓肾小球硬化的进程。蝉花菌丝总提物及其乙酸乙酯部，能有效减缓肾小球硬化及肾纤维化进程，而减少肾脏转化生长因子-β1以及结缔组织生长因子mRNA在转录水平上的过度表达，可能是蝉花菌丝有效组分发挥其抗肾纤维化作用的重要环节[8,9]。但蝉花中抗肾衰竭的活性成分一直没有被揭示，为了更好地开发利用蝉花虫草等虫草菌的抗肾衰竭和保肾作用，发现蝉花虫草等虫草菌中抗肾衰竭的活性成分具有重要意义。 

肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是肾衰竭的重要模型，在保肾作用的研究中被广泛地应用。肾缺血再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的主要发病机制，具有较高的发病率和死亡率,伴随着一系列连贯的细胞事件发生，包括活性氧(ROS)释放、凋亡、坏 死、炎症细胞的浸润和活性介质的释放，从而导致组织损伤。动物实验是开展肾IRI研究的常用方法。 

发明内容

本发明采用小鼠肾缺血再灌模型来发现蝉花虫草抗肾衰竭的活性成分，从生物化学层面揭示蝉花虫草抗肾衰竭的化学本质和化学机理，为蝉花虫草及其他含有该物质的虫草的抗肾衰竭作用的应用开发提供理论依据。 

本发明惊讶的发现，N6-(2-羟乙基)腺苷对肾脏功能损伤、肾功能衰退、肾衰竭方面有预防、治疗作用。肾衰竭分为急性和慢性肾衰竭，无论是何种分类上的肾衰竭，肾损伤，一旦肾脏功能出现疾病，表现出来肾脏细胞组织水平的病变，肾脏排泄的产物增加，例如血清肌酐(Scr)，和/或尿素氮(BUN)或其他标记物质。相反，如果该物质可以抑制这些排泄物的排出或控制在正常水平，或者从细胞组织水平上改善肾脏功能，就可以明确该物质对肾脏方面的疾病具有治疗作用。在下面的会详细介绍。 

本研究首先观察了N6-(2-羟乙基)腺苷对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，结果显示，腹腔注射应用N6-(2-羟乙基)腺苷能明显降低肾脏缺血再灌注损伤后血清肌酐(Scr)，和或尿素氮(BUN)水平(P<0.05，P<0.05)。 

这明显说明，N6-(2-羟乙基)可以明显降低血清肌酐(Scr)，和或尿素氮(BUN)水平，而血清肌酐(Scr)和/或尿素氮(BUN)为医学上作为肾功能指标的重要的标记物质。关于该标记物质与肾功能之间的关系可以在中国公开的发明专利里找到，例如中国专利申请201280049909.5中的具体描述，该专利申请作为全部为本发明的参考。 

另外，N6-(2-羟乙基)腺苷也改善了肾脏组织形态学病变，表明N6-(2-羟乙基)腺苷确实能够减轻肾脏缺血再灌注损伤,从而对治疗肾功能疾病就有作用，例如，肾功能衰退、肾急性/慢性衰竭，肾损伤。 

从蝉花虫草中提取分离的腺苷类衍生物，N6-(2-羟乙基)腺苷具有对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。在肾移植手术中,移植肾恢复肾血流后,必然会带来缺血一再灌注损伤。本实验通过建立小鼠肾脏缺血再灌注模型，研究N6-(2-羟乙基)腺苷对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制。 

在缺血再灌注损伤中，细胞凋亡是肾小管上皮细胞死亡重要形式之一。缺氧和氧自由基使凋亡相关基因和蛋白激活，启动细胞凋亡进程。其中，DNA片段化断裂是细胞凋亡的关键性的结局^[17]。对细胞凋亡的检测,本发明主要有以下几种方法:电镜观察、荧光及普通光学显微 镜观察、DNA电泳、流式细胞术、TUNEL原位DNA断片化分析以及凋亡过程蛋白因子、酶活性检测等^[18]。TUNEL染色^[19]通过标记断裂的DNA末端，能清晰地显示肾脏小管上皮细胞凋亡的情况。结果显示缺血再灌注组凋亡细胞明显多于假手术组(P<0.05)，而N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组可显著减少缺血再灌注损伤肾组织中凋亡细胞数量(P<0.05)。定性检测用电镜，可以进一步观察细胞凋亡状况，结果表明缺血再灌注组细胞核固缩，肿胀，有变性；没有一个结构完整的线粒体；细胞核部分溶解；染色质浓缩成块并边聚；线粒体空泡；细胞边缘不那么光滑；细胞膜模糊，褶皱；染色质稀疏呈细颗粒状，分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀，细胞器结构破坏，核塌陷并断裂。而N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组和低剂量组明显改善了上述症状，线粒体嵴明显，细胞膜双层明显。抑制凋亡可以减轻损伤和炎症^[20,21]。导致细胞凋亡的原因有：生长因子缺乏、细胞与细胞间、细胞与基质间相互作用的丧失、细胞毒性刺激及细胞死亡受体的激活等。 

另一方面，本发明提供N6-(2-羟乙基)腺苷在制备用于治疗肾移植中缺血再灌注损伤制剂中的用途。 

N6-(2-羟乙基)腺苷在制备用于治疗抗肾衰竭的作用的炎症制剂中的用途。 

在一些优选的方式中，N6-(2-羟乙基)腺苷在制备用于抑制肾脏缺血再灌注损伤后炎症TNF-a、IL-Iβ、ICAM-1因子制剂中的用途。 

进一步研究N6-(2-羟乙基)腺苷对肾脏缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。多种炎症介质，如TNF-a、IL-Iβ、ICAM-1在组织再灌注炎症反应中发挥着重要作用。TNF-a被认为是缺血再灌注后炎症反应的核心因子之一，通过TNF-a受体信号转导途径诱导多种炎症介质的基因表达，进而加重炎症反应^[22]。IL-Iβ是急性炎症反应最重要的介质，参与了炎症时多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡等，对肾脏IR损伤有明显的加重作用^[23]。ICAM-1主要表达于内皮细胞表面，参与调节多种效应细胞向炎症区域迁移和活化，肾脏IR损伤时上调ICAM-1可明显加重肾功能的损害^[24]。本研究中，实验组腹腔注射N6-(2-羟乙基)腺苷处理后，上述炎症介质的表达均低于缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)组。 

因此，本发明的另一方面，提供N6-(2-羟乙基)腺苷在制备治疗肾脏缺血再灌注损伤后炎症制剂中的用途。优选的，这些炎症是由炎症介质，如TNF-a、IL-Iβ、ICAM-1引起的。 

一方面，本发明提供一种N6-(2-羟乙基)腺苷的用途，即N6-(2-羟乙基)腺苷在制备用于治疗肾衰竭或肾脏缺血再灌注损伤制剂中的用途。优选的，该N6-(2-羟乙基)腺苷作在制备用于治疗肾脏缺血再灌注损伤中的用途。优选的，N6-(2-羟乙基)腺苷的剂量为7.5mg/kg 优选的，这种剂量可以使0-任何水平的剂量，例如2.5mg/kg，3mg/kg，3.5mg/kg，4mg/kg，4.5mg/kg，5mg/kg，5.5mg/kg，7mg/kg，7.5mg/kg，8mg/kg，9mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，15mg/kg，20mg/kg等。 

通过蝉花虫草具有抗肾衰竭作用，到从蝉花中草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷，再将其作用在动物模型上确定其在抗肾衰竭的作用，是蝉花虫草抗肾衰竭研究历程中的一大进步。 

本发明所述的N6-(2-羟乙基)腺苷可以来源于从蝉花虫草(O.sinensis)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、粉被虫草(Cordyceps pruinosa)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)等产生N6-(2-羟乙基)腺苷的虫草类真菌中中提取分离。N6-(2-羟乙基)腺苷可以是通过培养蝉拟青霉菌等上述虫草类真菌而获得的分析产物，这种产物可以从子实体、菌丝、孢子、菌丝培养基中分离获得。N6-(2-羟乙基)腺苷也可以来源于人工化学合成，也可以直接通过商业化产品购买到。 

在小鼠上可以证明该物质具有这样的功能，那么，N6-(2-羟乙基)腺苷的这种新的用途也可以用在人或哺乳动物体内进行治疗肾脏缺血再灌注引起的损伤以及抑制由此引起的炎症反应。因此，本发明提供一种治疗肾衰竭或肾缺血再灌注损伤的制剂，其中，该制剂包括N6-(2-羟乙基)腺苷。 

另一方面，本发明提供一种治疗肾衰竭或肾脏缺血再灌注损伤(降低肌苷、尿素氮的水平、抑制肾小管上皮细胞凋亡以及肾脏炎症反应)的制剂，该制剂包括N6-(2-羟乙基)腺苷。 

有益效果 

本发明发现一种物质的新的用途，可以对治疗肾脏缺血再灌注损伤起到很好的保护作用，同时对于治疗肾脏缺血再灌注损伤中的炎症反应具有良好的治疗作用。 

附图说明

图1为各组小鼠血清BUN水平比较图，注：1：假手术组；2：IR组；3：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；4：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；5：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组；与假手术组比较，^aP<0.05，^bP<0.01；与IR组比较，^cP<0.05。 

图2为各组小鼠血清Scr水平比较图。注：1：假手术组；2：IR组；3：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；4：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；5：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组；与假手术组比较，^aP<0.05，^bP<0.01；与IR组比较，^cP<0.05。 

图3为各组小鼠肾小管病理评分结果比较图。注：1：假手术组；2：IR组；3：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；4：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；5：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组；与假手术组比较，^aP<0.01；与IR组比较，^bP<0.05,^cP<0.01。 

图4各组小鼠肾组织病理改变(HE×400).注：A：假手术组；B：IR组；C：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；D：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；E：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组。 

图5各组小鼠肾小管上皮细胞凋亡情况(TUNEL×400)比较图。注：A：假手术组；B：IR组；C：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；D：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；E：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组。 

图6为电镜观察各组小鼠肾小管上皮细胞凋亡情况。 

图7为各组小鼠肾皮质ICAM-1、IL-1β、TNF-αmRNA荧光实时定量PCR表达情况比较图。注：1：假手术组；2：IR组；3：N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组；4：N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组；5：N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组；与假手术组比较，^aP<0.05；与IR组比较，^bP<0.05。 

具体实施方式

本发明的具体实施方式只是作为本发明的一个具体实施方式来说明本发明所提到的化合物的新的功能的直接证明，但这不是对本发明的限制。 

1、材料和方法 

1.1材料 

1.1.1动物：28只雄性C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，质量为20-25g，实验动物生产许可号为SCXK(沪)2012-0002，动物质量合格证编号为SCXK(沪)2012-0002。 

1.1.2主要试剂和仪器 

戊巴比妥钠购自sigma；N6-(2-羟乙基)腺苷,胎牛血清购自四季青；小牛血清白蛋白；羊血清购自北京索莱宝生物科技有限公司；DAB工作液购自北京中衫金桥生物技术有限公司；Proteinase K工作液购自Roche；苏木素购自北京中衫金桥生物技术有限公司；DNase I购自sigma；中性树胶购自北京索莱宝生物科技有限公司；原位细胞凋亡(TUNEL法)试剂盒购自Roche；高纯总RNA快速提取试剂盒购自Generay公司；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit购自Fermentas公司；qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司。 OD值测量仪器(高精度分光光度计)为Merinton SMA4000；定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFX Manager；全自动分析仪Dimension Xpand plus西门子公司；电镜型号H7500,购自日立有限公司 

1.2小鼠肾脏IR模型的建立 

小鼠术前称重，戊巴比妥钠(75mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，腹部中间切口，钝性分离并充分暴露肾蒂，用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂造成肾缺血，肾脏颜色由鲜红色立刻变为紫黑色，实验模型是否成功的判定方法参照Vyacheslav等^[11]和张萱等^[12]的方法。缺血30min时松开动脉夹，恢复灌注，肾脏由暗红色逐渐变为鲜红，表明再灌注成功。缝合腹部伤口。动物自由摄水和食物。 

1.3实验动物分组 

经过1.2灌注的小鼠经适应性喂养一周后，随机分成五组：(1)、假手术组(n＝5)，(2)缺血再灌注(IR)组(n＝5)，(3)、N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组(n＝6)，(4)、N6-(2-羟乙基)腺苷中剂量组(n＝6)，(5)、N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组(n＝6)。 

N6-(2-羟乙基)腺苷首先溶解在二甲基亚砜，进一步稀释在蒸馏水中，二甲基亚砜的浓度约不超过200％。假手术组小鼠仅接受开腹、游离肾蒂及关腹操作。对照组小鼠建立肾脏IR模型而无N6-(2-羟乙基)腺苷处理(1.2节的描述)。N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组，中剂量组以及高剂量组建立小鼠肾脏IR模型，并在缺血前15min腹腔注射2.5mg/kg(体重)(低剂量组),5mg/kg(中剂量组)及7.5mg/kg(高剂量组)N6-(2-羟乙基)腺苷。 

1.4样品采集和处理 

再灌注24h后再次麻醉小鼠，获取静脉血及肾脏标本。血液于室温静置1h，以4000×g离心20min，分离血清，于一80℃保存用于后续检测。取部分肾组织，用体积分数10％甲醛溶液固定后制备石蜡切片；另一部分用2.5％戊二醛保存送电镜室留作电镜标本。另取部分肾组织迅速置人液氮中，于一80℃冰箱保存，用于提取mRNA。 

1.5相关检测 

1.5.1肾功能指标检测 

运用全自动生化分析系统，分别采用苦味酸速率法和酶学速率法检测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)水平。 

1.5.2肾脏组织病理检查 

肾脏标本经10％甲醛溶液固定后，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化。肾脏病理变化评价参照Pallers标准^[13]在400倍光镜下随机选取5个视野，每个视野选10肾小管进行评分，其中皮质髓质各半。 

1.5.3TUNEL染色分析细胞凋亡 

取部分保存的肾脏组织，常规石蜡包埋4μm切片。按试剂盒方法操作：常规脱蜡，二甲苯及无水乙醇作用，修复抗原37℃与Proteinase K作用，封闭非特异性反应加胎牛血清和小牛血清白蛋白，PBS漂洗，加TUNEL缓冲液，PBS漂洗，3％甲醇溶液你阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗，再次封闭非特异性抗原加羊血清，PBS漂洗，加1:2稀释的POD，PBS漂洗，DAB显色，苏木精衬染，光学显微镜下观察。阳性染色结果判断：阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色。凋亡细胞定量：在外髓质中随机选取l0个400倍视野，计数每个视野中的凋亡细胞数，取平均数。每视野中凋亡细胞，1～10个，记1分；11～20个，记2分；21～30个，记3分；31～40个，记4分；>40个，记5分。 

1.5.4电镜切片制备及亚细胞情况观察 

用锋利的刀片切取1mm³肾脏组织，立即投入到2.5％戊二醛中，PBS液漂洗，1％锇酸后固定，双蒸水漂洗，1％醋酸铀块染，梯度丙酮脱水(70％，80％，90％，100％)，丙酮：包埋液＝(1:1；1:4)分别浸透，包埋聚合，切片，超薄切片。何种电镜(查型号，厂家)，几倍下观察。 

1.5.5荧光实时定量PCR 

将样本用液氮研磨至粉末状，用Trizol试剂提取总RNA。测定并评估RNA的纯度。使用M—MLV逆转录酶将样品RNA逆转录为cDNA。将标准样品和待测样品分别加入PCR反应液中，进行PCR扩增。RT-PCR反应体系所用引物序列如下。GAPDH：上游5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'。下游5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3'；TNF-α：上游5'-AACTTAGAAAGGGGATTATGGCT-3'。下游5'-TCAGGGAAGAATCTGGAAAGGT-3'；IL-1β：上游5'-TGGGAAACAACAGTGGTCAGG-3'。下游5'-CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC-3'；ICAM-1：上游5'-TCTTCTGAGCGGCGTCG-3'。下游5'-TTGCCAGGTCCAGTTCCC-3'。PCR扩增反应体系：IQ SYBR Green Super mix 12.5μl，Forward primer(10μM)1μl，Reverse primer(10μM)1μl，cDNA(加水稀释成一致水平)10.5μl。反应条件：50.0℃3min、95.0℃3min；95.0℃10s、60.0℃10s、72.0℃20s，共45个循环。实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行统计和计算。目的基因mRNA表达水平采用2^一△△Ct方法计算，并以相应标本内GAPDH mRNA为基准进行标准化^[14]

1.6统计学方法 

各组实验数据采用均数±标准差表示。采用SPSSl6.0软件进行统计学分析，多个样本均数间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，多个均数间两两比较采用LSD检验， 

2、结果 

2.1 N6-(2-羟乙基)腺苷对对小鼠IR肾功能损害的影响 

各组小鼠缺血再灌注后24h时血清Scr和BUN水平见图1和图2。与假手术组比较，缺血再灌注组BUN，Scr水平明显升高(p<0.01，p<0.05)，表示造模成功。而N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组和N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组与IR组比较，Scr和BUN水平差异无统计学意义(p>0.05)，N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组与IR组Scr和BUN水平比较明显降低(p<0.05，p<0.05)，具有显著差异。 

2.2小鼠缺血再灌注肾组织的形态学改变 

各组肾小管病理评分结果：IR组和N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组的肾小管-间质损伤评分比假手术组明显升高(p<0.01)，N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组与IR组比明显降低(p<0.05)，N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组与IR比明显降低(p<0.01)，见图3。假手术组(A)肾脏组织结构基本正常，仅见局部肾小管上皮细胞变性，局部肾小管腔内有脱落的坏死细胞,空泡变性。缺血再灌注组(B)肾组织见大量小官上皮细胞肿胀、空泡变性，严重部位见细泡片状坏死，脱落，基底膜不完整；部分肾小管官腔扩张，部分见上皮细胞碎片和管型，肾间质见炎性细胞浸润。N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组(C)可见间质轻度水肿，肾小管上皮细胞扁平，坏死细胞较少，部分管腔扩张，可见少量管型。N6-(2-羟乙基)腺苷中剂量组(D)及N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组(E)标本病理改变较IR组明显减轻，仅部分细胞出现肿胀，脱落及空泡变性，坏死细胞较少，肾小管形状保持良好，见图4. 

2.3 TUNEL检测小鼠肾小管上皮细胞的凋亡情况 

肾脏TUNEL染色阳性细胞以近曲小管上皮细胞和远曲小管上皮细胞为主，部分肾小球上皮细胞也有改变，凋亡细胞核呈棕黄色。假手术组(A)肾脏组织只有极少数细胞发生凋亡，而缺血再灌注组(B)细胞凋亡明显增多，N6-(2-羟乙基)腺苷治疗组与缺血再灌注组比较，细胞凋亡数减少，但仍多于假手术组。N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组(C)凋亡细胞较与N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组(D)和N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组(E)要多，而N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组凋亡细胞最少，见图5。假手术组、缺血再灌注组、N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组、N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组、N6-(2-羟乙基)腺苷7.5mg/kg组凋亡细胞定量为(1.9±1.2) 分、(4.0±0)分、(3.0±0.1)分、(2.6±0.1)分和(2.1±0.1)分。统计学分析显示缺血再灌注组凋亡细胞明显多于假手术组(P<0.05)，而N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组可显著减少缺血再灌注损伤肾组织中凋亡细胞数量(P<0.05)。 

2.4电镜观察细胞凋亡情况 

电镜观察肾小管上皮细胞凋亡情况如图5所示。假手术组(A)细胞核整个完整。细胞核和细胞器的结构清晰易辩。细胞核膜双层。线粒体完整，线粒体嵴明显。缺血再灌注组(B)细胞核固缩，肿胀，有变性；没有一个结构完整的线粒体；细胞核部分溶解；染色质浓缩成块并边聚；线粒体空泡；细胞边缘不那么光滑；细胞膜模糊，褶皱；染色质稀疏呈细颗粒状，分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀，细胞器结构破坏。核塌陷并断裂(C)。N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组(D)整体较缺血再灌注组有所改善，部分线粒体结构完整，线粒体嵴明显。细胞核膜双层，但是具有较大的脂质空泡，还有溶酶体。N6-(2-羟乙基)腺苷中剂量组(E)细胞核膜较缺血再灌注组双层明显，大部分线粒体正常，线粒体嵴较明显。N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组(F)较缺血再灌注组线粒体保护明显，大部分线粒体结构完整，线粒体嵴较明显，细胞核膜双层明显。 

N6-(2-羟乙基)腺苷对肾组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA表达的影响 

确定肾脏炎症通过测量促炎症因子的mRNA表达，包括ICAM-1、IL-1β、TNF-α在肾缺血再灌注损伤后24小时。小鼠经历30分钟缺血再灌注时，缺血再灌注组，N6-(2-羟乙基)腺苷2.5mg/kg组和N6-(2-羟乙基)腺苷5mg/kg组较假手术组ICAM-1、IL-1β、TNF-αmRNA表达均增加，在缺血前15分钟预处理给药N6-(2-羟乙基)腺苷，ICAM-1、IL-1β、TNF-αmRNA表达相对缺血再灌注组降低，差异有统计学意义，见图7。 

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