法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽及其应用

摘要

本发明公开了一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽及其应用，属于蛋白质多肽技术领域。法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的氨基酸序列为：短肽1：PINMQTLNCMAA，短肽2：GCTLNPMSDLLG，短肽3：MSSTLNGMLNSL，三条短肽的保守序列为TLNXM。本发明筛选得到的结合肽能与法氏囊活性五肽BP5特异性结合，且在一定浓度下抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性，在制备抑制法氏囊活性五肽BP5抗肿瘤细胞增殖的药物方面具有良好的应用前景，为BP5抑制剂的研究开发及应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽，以及法氏囊五肽BP5特异性结合 肽的应用，属于蛋白质多肽技术领域。

背景技术

法氏囊(bursa of Fabricus，BF)是禽类特有的中枢淋巴器官，是B细胞发育的最早发 生场所，B细胞发育成熟后由此迁移到外周淋巴器官定居和繁衍，执行免疫功能。法氏囊 微环境中含有多种促进B淋巴细胞发育的生物活性物质，除了囊素三肽(bursin,BS)作为 法氏囊组织中第一个化学结构明确的生物活性因子之外，近年来，有多条生物活性肽从法 氏囊组织中被分离鉴定。研究发现，法氏囊活性肽大多具有免疫调节功能，有些还具有抗 肿瘤潜能。

法氏囊活性五肽BP5是从法氏囊中新分离出来的一种活性五肽，其氨基酸组成为 Cys-Lys-Arg-VaL-Tyr，分子量为626.27Da。学者们对BP5的生物学功能进行了一系列研究， 证实BP5能够促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，增强机体体液免疫和细胞免疫反应， 且在活细胞系统中具有较强的抗氧化能力，而且能够抑制杂交瘤细胞、MCF-7细胞及Hela 细胞等肿瘤细胞的增殖，是一种多功能生物活性因子。

噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，具有快 捷、高效、表型和基因型一致等特点，广泛应用于生物活性肽、肽类药物筛选、抗原模拟 表位筛选等研究领域。有资料证实，具有生物学功能的免疫因子大多是通过与细胞膜受体 相互作用或通过受体介导而发挥生物学功能，如生长因子、胸腺五肽TP5等。BP5作为一 种多功能免疫因子，其发挥生物学功能的机制尚不清晰。因此利用噬菌体展示技术筛选BP5 特异性结合肽，并研究BP5结合肽是否对BP5的生物学功能有所影响。对BP5抑制剂的 研究开发及应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽。

同时，本发明还提供一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 或SEQ ID NO.3所示。

上述三条均为短肽，其中短肽1：PINMQTLNCMAA，短肽2：GCTLNPMSDLLG， 短肽3：MSSTLNGMLNSL，保守序列为TLNXM。

一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的应用，具体的，法氏囊活性五肽BP5特异性 结合肽在制备抑制法氏囊活性五肽BP5抗肿瘤细胞增殖的药物方面的应用。

所述的肿瘤细胞为淋巴瘤细胞，具体为鸡DT40细胞。

本发明的有益效果：

本发明以BP5-BSA融合蛋白作为靶分子，通过噬菌体随机12肽库筛选，结合ELISA 鉴定和竞争抑制试验，获得与BP5特异性结合的噬菌体，进行序列测定，人工合成BP5 特异性结合肽。由此筛选得到的结合肽能与法氏囊活性五肽BP5特异性结合，且在一定浓 度下抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性。标准MTT法检测BP5特异性结合肽对BP5抗鸡 DT40细胞增殖功能的影响，分析结果发现，短肽1、2、3本身对鸡DT40细胞的增殖均无 明显影响；短肽1在0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL浓度下能够抑制BP5抗鸡DT40细胞 增殖功能，在20μg/mL浓度下时抑制作用最为显著(P<0.01)；短肽2在2μg/mL和20μg/mL 浓度下能够显著抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能(P<0.05)；短肽3在0.2μg/mL、2μg/mL、 20μg/mL浓度下能够抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能(P<0.05)；表明3个BP5特异性 结合肽在一定浓度下均可抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性，为BP5抑制剂的研究开发及 应用奠定了基础，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；

图2为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；

图3为试验例中BP5对鸡DT40细胞增殖的影响；

图4为试验例中BP5特异性结合肽对鸡DT40细胞增殖的影响；

图5为试验例中BP5特异性结合肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响；

图6为试验例中无关G-G-G-G-S五肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中BP5特异性结合肽的筛选，包括以下步骤：

1)噬菌体随机12肽库的亲和筛选

(1)包被纯化的BP5-BSA

将BP5-BSA(BP5-BSA融合蛋白由BP5和BSA参照常规化学方法偶联制备，由上海 科肽生物有限公司合成，纯度95％以上)以TBS稀释为100μg/mL，同倍稀释BSA，分别 取稀释后的BP5-BSA和BSA包被酶标板，100μL/孔，放置湿盒中4℃过夜；次日倾弃包 被液，加入含0.05％Tween20的TBST洗涤3次(每次静置3min)，扣干，然后以含5％ 脱脂奶粉的TBS按100μL/孔加入各孔，置湿盒中37℃封闭2h；倾弃封闭液，以含0.05％ Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被好的酶标板封口，于4℃保存待用。

(2)预筛选

以TBST稀释噬菌体随机12肽库(购于美国New England Biolabs，NEB公司)至1×10¹¹pfu/mL，取稀释后的文库液100μL加入到预先包被BSA的酶标板孔内，于湿盒中37℃放 置2h，吸出孔内液体，并用100μL TBS清洗微孔一次，合并吸出的孔内液和清洗液为预 筛选液。

(3)亲和筛选

将100μL的预筛选液加入到预先包被BP5-BSA的酶标板孔内，放置湿盒中4℃过夜， 弃孔内液体，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100μL0.2M Glycine-HCl(pH2.2)， 于室温温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15μL1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。测定少量(～1μL)洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738 培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，4℃ 12,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。取80％上清转入新管中，加 入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜。次日，4℃12,000rpm离心PEG沉淀15min。弃 上清，再短暂离心，弃去残留上清。沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中， 4℃离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl 再沉淀。冰上孵育30min(或15-60min)。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微 量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200μL TBS0.02％NaN₃中。离心1min，沉淀任何 残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规 M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以 TBS稀释为1×10¹¹pfu/mL，取100μL加入到预先包被BP5-BSA的酶标板孔中进行第二轮 筛选，37℃温育2h，弃孔内液，并用含0.05％Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进 行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮和第四轮筛选。

在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input，洗脱得到的噬菌体量记为 Output，分析比较每轮产出/投入比(Input/Output)情况，来反映特异性结合噬菌体的富集 程度。经过4轮筛选发现：淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第四轮噬 菌体滴度为2.2×10⁶pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高(见表1)，表明具有特异性结合 作用的噬菌体显示较好的富集效果。

表1四轮亲和筛选对噬菌体的富集

2)单克隆噬菌体的扩增

将ER2738接种于20mL LB培养基中，37℃培养至稍浑浊。用灭菌的吸头从第三轮和 第四轮淘选物中随机分别挑取10个克隆。每个噬菌体克隆加入到每管ER2738培养液中， 37℃培养4.5h。将上述培养物于4℃12,000rpm离心10min，上清移入新的离心管，再离 心。取80％上清于新离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1h或过夜。4℃12,000 rpm15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于1mL TBS 中，将悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。上清转入新的微量离 心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用30min(或15-60min)。4℃离心10min， 弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于50μL TBS中，按常规M13方法进 行噬菌体滴度测定。

3)ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的结合活性

为了检测筛选得到的噬菌体克隆是否与BP5特异性结合，从第三轮和第四轮筛选后测 滴度的琼脂板中随机挑选20个单个噬菌体克隆，以BP5-BSA和BSA包被酶联板做间接 ELISA试验。用100μL100μg/mL的靶分子BP5-BSA(溶于0.1M pH8.6NaHCO₃中)包 被ELISA板，并设BSA蛋白对照。在密封的湿盒中4℃包被过夜。经封闭液4℃封闭1h 后，PBST洗涤，加入100μL待测单个克隆的噬菌体上清(稀释至：10¹¹pfu/mL)为待测 短肽，室温反应1h。PBST洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP结合物，室温反 应1h。PBST充分洗涤，加入TMB底物显色溶液，室温30min，后加50μL2M的H₂SO₄终止反应，测A450值。

结果显示其中10个克隆显示较强的阳性结果(见图1)。分别命名为P1、P2、P3、P4、 P5、P6、P7、P8、P9、P10。

4)竞争抑制试验

将上述10个克隆，做竞争ELISA实验，以人工合成的BP5来阻断阳性噬菌体与BP5 结合，以进一步鉴定所筛选的噬菌体展示肽是否与BP5特异性结合，在湿盒中，包被靶分 子BP5-BSA并封闭(方法同上)，加入100μL不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、 150μg/mL、200μg/mL)人工合成的BP5与上述单克隆噬菌体(稀释至：10¹¹pfu/mL)等 体积混合，室温作用10min，每孔100μL，室温轻摇孵育1h。PBST洗6次，加抗M13-HRP 抗体，室温轻摇孵育1h，PBST洗6次，加TMB底物显色，测A450值。

抑制率的计算公式见下式(1)：

抑制率(％)＝(未抑制A450值－抑制后A450值)/未抑制A450值×100％  (1)

结果表明，人工合成的多肽对噬菌体P2、P6、P7与BP5结合具有一定的阻断作用(见 图2)。说明噬菌体P2、P6、P7为BP5的特异性结合肽。

5)单链噬菌体DNA的制备

按1:100稀释ER2738过夜培养物并接种于LB培养基，分装到培养管中，每管1mL。 用灭菌吸头挑一蓝色噬菌斑(从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以保证每个噬菌斑 仅含一个DNA序列)加入上述1mL培养管中，每个要鉴定的克隆一管。37℃摇床培养 5h(或4.5-5h)。培养物转入微量离心管中，离心30s。上清转入新管中，再离心，然后将 500μL含噬菌体的上清转入新离心管中。加200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。 离心10min，弃上清，再短暂离心，小心吸弃残余上清。用70％乙醇洗涤沉淀，充分干燥 后，沉淀重悬于30μL TE(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。

6)阳性噬菌体DNA序列测定

提取上述3个噬菌体阳性克隆的单链DNA后，用-28gIII和-96gIII测序引物(-28gIII 测序引物如SEQ ID NO.4，-96gIII测序引物SEQ ID NO.5所示)交由上海生工生物有限公 司测序，以推测其相应的氨基酸序列，结果显示，得到的BP5特异性结合肽的氨基酸序列 分别如下，P2-12(SEQ ID NO.1)：PINMQTLNCMAA；P6-12(SEQ ID NO.2)： GCTLNPMSDLLG；P7-12(SEQ ID NO.3)：MSSTLNGMLNSL；其中保守序列为TLNXM。

7)化学合成多肽

采用固相合成法合成上述多肽P2-12、P6-12、P7-12，由上海科肽生物有限公司合成， 纯度95％以上。

实施例2

本实施例中法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽在制备抑制法氏囊活性五肽BP5抗鸡 DT40肿瘤细胞增殖的药物方面的应用。

本实施例中BP5特异性结合多肽采用通用的固相多肽合成方式合成，用反向高效液相 色谱法进行纯化，纯化后冻干为95％以上纯度级别的多肽粉末。取多肽粉末与医药领域常 规辅料混合，即得抗鸡DT40肿瘤细胞增殖的药物。或者先将多肽粉末用PBS缓冲液溶解， 配制成不同浓度的多肽溶液，用于抑制BP5抗肿瘤增殖试验。

试验例

法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽对BP5功能的影响

(1)BP5对鸡DT40细胞增殖的影响

将鸡DT40细胞培养至2×10⁵cells/mL，重悬后分装至96孔细胞培养板中，均分为5 组，第1组加入PBS作为空白对照，第2-5组分别加入0.2μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、25 μg/mL浓度的BP5，刺激48h后，通过标准MTT法检测鸡DT40细胞增殖情况。

相对细胞增殖率的计算公式见下式(2)：

相对细胞增殖率＝实验组OD值/对照组OD值×100％  (2)

细胞抑制率的计算公式见下式(3)：

细胞抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％  (3)

结果显示，与PBS空白对照组相比，BP5在0.2μg/mL、1μg/mL、25μg/mL浓度下抑 制鸡DT40细胞的增殖差异显著(P<0.05)，而BP5在5μg/mL浓度时对细胞抑制作用最 为显著，抑制率为27.5％(P<0.01)(见图3)。

(2)BP5特异性结合肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响

为分析BP5特异性结合肽对鸡DT40细胞增殖的影响，将鸡DT40细胞约2×10⁵cells/mL重悬后分装至细胞培养板中，实验分为四组，P2-12肽组：设四个浓度(0.02μg/mL、 0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)；P6-12肽组和P7-12肽组浓度设置同P2-12肽组，同时 以PBS为空白对照组，各组刺激细胞48h后，通过MTT法检测不同组鸡DT40细胞增殖 情况，分析BP5特异性结合肽对鸡DT40细胞增殖的影响。

为进一步分析BP5结合肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响，将鸡DT40细胞约 2×10⁵cells/mL重悬后分装至细胞培养板中，实验分为五组，第1组为加PBS空白对照组， 第2组为加5μg/mL BP5单独刺激组，第3组为加5μg/mL BP5+P2-12肽组，P2-12肽设置 不同浓度(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)，第4组为加5μg/mL BP5+P6-12 肽组，第5组为加5μg/mLBP5+P7-12肽组，第4组和第5组中12肽浓度设置和第3组相 同。各组刺激细胞48h后，通过MTT法检测鸡DT40细胞增殖情况。

实验同时设置无关G-G-G-G-S五肽(由上海科肽生物有限公司合成，纯度95％以上) 作为对照，实验分为3组，第1组为加PBS空白对照组，第2组为加5μg/mLBP5单独刺 激组，第3组为加5μg/mLBP5+G-G-G-G-S五肽组，G-G-G-G-S五肽设置四个浓度(0.02 μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)，刺激细胞48h后，通过MTT法检测鸡DT40 细胞增殖情况。

结果显示，与PBS空白对照组相比，人工合成的P2-12、P6-12和P7-12肽在不同浓度 (0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)下刺激鸡DT40细胞时，细胞相对增殖率 均无显著变化(见图4)(P>0.05)，表明BP5结合肽P2-12、P6-12、P7-12本身对鸡DT40 细胞的增殖无明显影响。不同浓度(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)的P2-12、 P6-12、P7-12肽与5μg/mLBP5联合刺激细胞，分别设PBS组、不同浓度(0.02μg/mL、 0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)的无关G-G-G-G-S五肽和BP5单独刺激组作为对照，结 果显示，P2-12肽在0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL浓度下能够抑制BP5抗鸡DT40细胞 增殖功能，在20μg/mL浓度下时抑制作用最为显著(P<0.01)(见图5)；P6-12肽在2μg/mL 和20μg/mL浓度下能够显著抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能(P<0.05)(图5)；P7-12 肽在0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL浓度下能够显著抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能 (P<0.05)(见图5)；而无关G-G-G-G-S五肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能无明显影 响(P>0.05)(见图6)。以上结果表明，BP5特异性结合肽(P2-12、P6-12和P7-12)在 一定浓度下均可抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性。