法氏囊活性肽BP5肿瘤细胞相互作用蛋白的筛选及鉴定

摘要

法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽类特有的体液中枢免疫器官，负责B细胞的发育和抗体的分泌。法氏囊活性肽 BP5（Bursopentin）是从鸡 BF中分离到的一种新的免疫活性肽，不仅能够调节体液免疫和细胞免疫反应，还具有抗氧化和抗肿瘤活性。目前，BP5抗肿瘤的作用机制尚不清楚。本研究旨在利用噬菌体展示技术，结合 BP5诱导的肿瘤细胞基因表达谱分析及生物信息学分析，以期筛选出 BP5肿瘤细胞相互作用蛋白并对其进行初步鉴定，同时初步揭示 BP5抗肿瘤作用机制。本研究主要包括以下三个方面的内容：
　　1、法氏囊BP5特异性结合肽的筛选及鉴定
　　利用噬菌体展示技术，以BP5-BSA为靶分子对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选，结合 ELISA鉴定和竞争抑制试验，筛选出3个BP5特异性结合肽，分别为：PINMQTLNCMAA（ P2-12）、GCTLNPMSDLLG（ P6-12）和MSSTLNGMLNSL（P7-12），其核心基序为 TLNXM。采用 MTT法检测其对BP5抗肿瘤细胞增殖能力的影响，结果显示，P2-12和 P7-12肽在0.2-20μg/mL下，P6-12在2-20μg/mL浓度下均能抑制 BP5抗小鼠 WEHI-231细胞增殖作用，其中P2-12在2-20μg/mL浓度下抑制作用最显著（p<0.01）。此外，p53荧光素酶检测活性结果显示，3种 BP5结合肽在实验浓度下均能下调 BP5促 p53基因转录活性。表明这3种 BP5特异性结合肽均能下调 BP5的抗肿瘤活性。为研究BP5的抗肿瘤作用机制奠定了基础。
　　2、鸡DT40细胞cDNA T7噬菌体文库的构建及BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白的筛选
　　以鸡 DT40细胞为肿瘤细胞模型，利用 T7噬菌体展示技术构建鸡 DT40细胞cDNA T7噬菌体文库，并以BP5-BSA为靶分子对文库进行亲和筛选，结合序列测定和生物信息学分析，筛选 BP5鸡 DT40细胞相互作用蛋白。结果显示，构建的鸡DT40细胞cDNA T7噬菌体文库原始滴度为1.2×104pfu/mL，扩增后滴度达1.9×109 pfu/mL，文库重组率为91.7％，且插入片段大多在250-1000 bp。随机选取12个PCR产物进行测序，结果显示插入序列均为鸡源序列。通过三轮亲和淘选，结合序列测定获得3条与 BP5结合的鸡源蛋白运输蛋白颗粒复合体2（TRAPPC2，trafficking protein particle complex2）、血管内皮生长因子A（VEGFA，vascular endothelial growth factor A）和细胞周期蛋白E1（CCNE1，cyclin E1）。生物信息学分析发现鸡的TRAPPC2与小鼠和人的TRAPPC2的同源相似性分别为97.9%、100%，鸡的 VEGFA与小鼠和人的VEGFA的同源相似性分别为76.8%、74.1%，鸡的CCNE1与小鼠和人的CCNE1的同源相似性分别为67.3%、71.3%，其中，VEGFA是血管生成的重要调控因子，CCNE1是调控细胞周期G1/S期的重要的细胞周期调节蛋白，二者的异常表达均与肿瘤的发生和发展密切相关，提示 BP5的抗肿瘤作用可能与 VEGFA和CCNE1相关，为进一步研究BP5肿瘤细胞相互作用蛋白提供科学依据。
　　3、BP5刺激的鸡DT40细胞基因表达谱分析
　　以 BP5刺激鸡 DT40细胞，通过基因芯片技术来分析 BP5刺激后鸡 DT40细胞中基因表达谱的变化情况。结果显示，BP5参与调节多条与抗肿瘤功能有关的通路，其中包括p53信号通路，且p53信号通路涉及的5个差异表达基因均与细胞周期调控或抗肿瘤相关，其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上调，CHEK2、CCNE1基因被下调。BP5依赖 p53肿瘤信号通路分析结果显示，在转录水平上，BP5在0.2-20μg/mL浓度下能够明显提高HCT116细胞中p53相对 Luciferase活性，在蛋白表达水平上，BP5能显著促进 p53、p21蛋白的表达水平，显著降低CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平。结合 BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白筛选结果，初步鉴定为CCNE1是BP5肿瘤细胞相互作用蛋白候选蛋白，为进一步研究BP5抗肿瘤作用的分子机制提供了重要的依据。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述

1.1 法氏囊活性肽研究进展

1.2 噬菌体展示技术研究进展

1.3 基因芯片技术研究进展

1.4 本研究的目的及意义

第2章 法氏囊活性肽BP5特异性结合肽的筛选及鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 鸡DT40细胞cDNA T7噬菌体文库的构建及BP5相互作用蛋白筛选

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 BP5刺激后鸡DT40细胞的基因表达谱分析

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果