牛卵泡颗粒细胞CART相互作用蛋白鉴定及受体筛选

摘要

旨在筛选牛卵泡发育关键负调控因子可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated tran-script peptide,CART)的相互作用蛋白及其受体.本研究采集3头健康母牛双侧卵巢,分离卵泡后刮取颗粒细胞(granulosa cells,GCs)混样;采用跨膜蛋白Extraction试剂盒提取膜蛋白,运用Protein G琼脂糖磁珠与重组CART蛋白、Anti-CART抗体共孵育(n=3);洗脱CART-蛋白复合物进行二级质谱(LC-MS/MS)分析;获得的蛋白经可信度过滤,利用生物信息学技术对其进行功能聚类分析,通过CELLO V2.5软件对蛋白进行亚细胞定位和跨膜区分析;获得7次跨膜的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs),经ProtScale软件分析其胞内外结构区段特点,符合神经肽与受体结合结构特点的GPCR作为CART的候选受体.抽提的膜蛋白经免疫亲和层析(n=3)后,分别鉴定出149、557和298个相互作用蛋白,经筛选剔除重复蛋白,共鉴定出620个蛋白.多数据库集功能富集分析表明,CART相互作用蛋白包含参与信号传导活性的GNAS、GNG8和JUP,参与类固醇生物合成的HSD3B,参与细胞凋亡或增殖调节的OPA1和S100A11,参与Notch信号通路的ERH,这些蛋白或信号通路均与牛卵泡发育密切相关.亚细胞定位和跨膜区分析共获得膜蛋白156个,占总蛋白数的20.53％;其中7次跨膜的GPCRs有8个.经TMHMM分析表明,8个GPCRs中仅ZMPSTE24、HM13和GPR108的N端在胞外,C端在胞内,与神经肽受体的结构特征一致;经PredictProtein结合位点分析表明,ZMPSTE24在5～6跨膜区间的胞内环存在G蛋白结合的位点.ZMPSTE24作为CART的候选受体,有待于分子互作和功能试验进一步加以验证.本研究为牛卵泡CART受体的鉴定奠定了基础,对丰富牛卵泡发育调控理论具有重要意义.