水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用

摘要

本发明涉及一种水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，通过对粳型超级稻“沈农265”和云南地方品种“丽江新团黑谷”的F

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，属于水稻育种中的检 测技术领域。

背景技术

倒伏是影响水稻、小麦、玉米等作物高产的重要因素之一，水稻等作物在大风、大 雨作用下，易导致倒伏，由此会造成作物减产20-30％。此外，作物群体倒伏后，其冠层 结构被破坏，导致光合和干物质生产能力下降，严重的倒伏还会引起水、营养物质和同 化物的转运受阻，减少籽粒灌浆时的养分供给。同时倒伏会使群体内部的湿度增加，诱 发真菌性病害或引起穗发芽，进而影响稻米的品质和外观。随着黑龙江“国家战略粮 仓”地位的日益突出，水稻高产稳产已成为关系国计民生的关键问题。据不完全统计， 黑龙江每年因为倒伏导致的减产在10％左右，严重年份达到20％以上。因此，深入开展 对水稻抗倒能力的研究，进一步提高黑龙江省水稻的抗倒性，实现水稻高产、稳产有着 重要的现实意义。已有研究表明株高是影响水稻倒伏的最重要因素，绿色革命(矮化育 种)使矮化品种代替了传统的高秆品种，提高了水稻的耐肥抗倒性和收获指数，但植株 过矮，致使叶片密集、相互遮掩，从而降低群体的光能利用率。近年来的研究表明，欲 使水稻产量进一步增加，通过提高收获指数的难度越来越大，只能通过提高品种的生物 产量来实现。然而，实现生物产量的突破必然依赖于株高的增加，但这一策略将会重新 带来倒伏的危险。因此，在保证适当提高株高的前提下，发掘“矮秆”以外的优良抗倒 基因资源，揭示新的抗倒机制，培育优良的抗倒材料，对于破解倒伏难题，实现水稻生 产潜力的下一个跨越，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是筛选和开发位于prl4两侧的特异性分子标记，并将这个 分子标记命名为prl4-1和prl4-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 所示。具体地，本发明设计开发的分子标记的核苷酸序列如下：

prl4-1的上游引物序列为：5’-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；

prl4-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；

prl4-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；

prl4-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’。

本发明采用以下技术方案：根据前期定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265 的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并设计出该标记。将此标记 应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有prl4的丽江新团黑谷在利用prl4-1 检测时，能够扩增出210bp左右的条带，而沈农265能够扩增出200bp左右的条带。在 利用prl4-2检测时，丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带，而沈农265能够扩 增出190bp左右的条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与 prl4共分离。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在prl4座位上含有丽江新 团黑谷的抗倒伏增效等位基因。

水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，应用下述步骤检测待测材料是否在 prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具体实施步骤为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中。

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液[2％(w/v)CTAB；l00mmol/LTris-Hcl，pH8.0； 20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl]600μL。

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期 间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充 分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中。

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止。

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以 上。

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去 残液，在超净工作台上吹干。

(1h)用100μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0)回溶待 用。

(1i)取1.5μL用于PCR扩增。

(2)进行PCR扩增，具体过程为：PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μMeach of dNTPs，0.2μMof each primer， 5％(v/v)dimethyl sulfoxide和0.5U Taq DNA聚合酶。应用美国AB公司的ABI-9700 进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min， 72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。

(3)进行PCR产物检测：扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上样于3.5％的琼脂 糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。

该发明的有益效果在于：本发明技术筛选了两个水稻抗倒伏基因prl4的分子标记， 所述分子标记与prl4不仅紧密连锁而且在植株后代与所述基因共分离，因而为筛选适 于直播水稻品种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径。

附图说明

图1是本发明实施例中prl4-1分子标记的检测结果示意图。

图2是本发明实施例中prl4-2分子标记的检测结果示意图。

图中标记说明：M：分子标记标准；1：沈农265；2：丽江新团黑谷；3-12：不抗倒 伏株系；13-22：抗倒伏株系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发 明。

实施例

按照水稻倒伏发生的位置，通常将倒伏分为两种类型：“茎倒”和“根倒”。针 对两种不同类型，分别通过“秆强化”和“支持力强化”两种策略加以解决。本发明实 施例中，前期通过对粳型超级稻“沈农265”和云南地方品种“丽江新团黑谷”的F₂和 RILs群体进行抗倒伏相关性状的QTL分析，鉴定了一个在不同群体类型(F₂和RILs)、 不同年份(2008年、2009年和2011年)、不同地点(沈阳和哈尔滨)稳定表达的主效 QTL，其增效等位基因来自于地方品种“丽江新团黑谷”，表1为利用沈农265/丽江新 团黑谷的F₂群体(176)和重组自交系群体(94)分别于2008、2009和2011年在沈阳 和哈尔滨两地检测到的第4染色体上控制倒伏相关性状的主效QTL，分析发现其控制植 株下部茎秆抗折力，也就是具有“强秆化”的应用潜力，暂命名为pushing resistance  of the lower part4(prl4)。进一步分析发现该区间未定位到与株高及其构成相关的 QTL，这也避免了株高对该位点抗倒伏分析的影响。通过全基因组的分子标记辅助选择， 从重组自交系群体中选出目标区域为“黑谷”，而75％的遗传背景为“沈农265”的“初 始材料”，其茎秆解剖结构与“沈农265”差异显著。此外，为保障能够将本基因成功 克隆，于2012年利用“黑谷/二九南”的F2群体进行了植株下部茎秆抗折力的QTL分 析，共检测到3个控制植株下部茎秆抗折力的QTL。其中，位于第4染色体的主效 QTL-qPRL4与prl4在相同区域，且增效等位基因也来自“黑谷”，表2为利用丽江新团 黑谷/二九南的F₂群体(190)于2012年在哈尔滨检测到的控制植株下部茎秆抗折力的 QTL，从中可以看出，不仅表明prl4的真实存在，也表明其在不同遗传背景下稳定表达。 2013年利用该群体的F_2∶3家系进行了验证，表3为利用丽江新团黑谷/二九南的F_2∶3家系 群体(190)于2013年在哈尔滨检测到的控制植株下部茎秆抗折力的QTL，发现该QTL 稳定表达且真实存在，并筛选了两个水稻抗倒伏基因prl4的分子标记，所述分子标记 与prl4不仅紧密连锁而且在植株后代与所述基因共分离，因而为筛选适于直播水稻品 种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径。

表1

表2

表3

本发明实施例中，筛选和开发位于prl4两侧的特异性分子标记，并将这个分子标 记命名为prl4-1和prl4-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。 具体地，本发明设计开发的分子标记的核苷酸序列如下：

prl4-1的上游引物序列为：5’-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；

prl4-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；

prl4-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；

prl4-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’。

本发明实施例中，根据前期定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标 区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并设计出该标记。将此标记应用于 丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有prl4的丽江新团黑谷在利用prl4-1检测 时，能够扩增出210bp左右的条带，而沈农265能够扩增出200bp左右的条带。在利用 prl4-2检测时，丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带，而沈农265能够扩增出 190bp左右的条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与prl4 共分离。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑 谷的抗倒伏增效等位基因。

本发明实施例中的水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记，应用下述步骤检测待测材 料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具体实施步骤为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中。

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液[2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0； 20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl]600μL。

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期 间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充 分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中。

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止。

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以 上。

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去 残液，在超净工作台上吹干。

(1h)用100μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0)回溶待 用。

(1i)取1.5μL用于PCR扩增。

(2)进行PCR扩增，具体过程为：PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μMeach of dNTPs，0.2μMof each primer， 5％(v/v)dimethyl sulfoxide和0.5U Taq DNA聚合酶。应用美国AB公司的ABI-9700 进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min， 72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。

(3)进行PCR产物检测：扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上样于3.5％的琼脂 糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。如图1所示 为prl4-1分子标记的检测结果，能够扩增出210bP条带的株系具有prl4基因。如图2 所示为prl4-2分子标记的检测结果，能够扩增出200bP条带的株系具有prl4基因。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视 为本发明的保护范围。