通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法

摘要

本发明公开了一种通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法。此外，利用本发明，在回补了已知生存必需基因而不能敲除基因组中对应的区域时，通过进一步的将该区域细分，可以定位出可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因组工程和分子生物学领域，具体涉及大肠杆菌生存必需基因在酵母中的拼接克隆和验证，并将正确拼接的质粒转入大肠杆菌。然后对大肠杆菌染色体中包含已克隆的生存必需基因的大片段DNA进行敲除。

背景技术

大肠杆菌是基础研究最透彻，工业应用最广泛的模式菌株。研究表明，大肠杆菌基因组中只有7-15%左右的基因为生长所必需（1,2）。通过敲除生长非必需的基因，可以获得遗传更为稳定及背景更清晰的大肠杆菌菌株，有利于更好地研究其调控机制。具有减小基因组的细胞也减少了非必需的代谢途径，有利于获得高产的优化菌株。通过连续删除生长非必需区域，目前已经将大肠杆菌的基因组从4.6M删减到了2.9M，基因组减小了39%（3）。

传统的基因组敲除方法必须跳过大肠杆菌基因组中的生存必需基因，因此敲除片段的大小受到很大的限制，敲除速度较为缓慢（5）。与现有的基因组敲除方法相比，本发明能更快速和高效地删减大肠杆菌基因组。

发明内容

本发明旨在加快大肠杆菌基因组敲除的速度。通过将大肠杆菌生存必需基因拼接克隆到单拷贝载体上，然后可快速敲除染色体中包含已克隆的生存必需基因的大片段DNA，敲除速度大大提高。

本发明公开了一种通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法。通过将大肠杆菌基因组中不能被敲除的生存所必需的基因拼接并克隆到单拷贝的载体上，称为“小染色体”；然后利用精确打靶的方法可将大肠杆菌原染色体上对应的大片段区域敲除，称为“大染色体”。同常规的基因组敲除方法只能跳过生存必需基因而敲除基因组中较小的片段相比，本发明可以一次敲除更大的片段，从而大幅度加快基因组敲除的速度。此外，利用本发明，在回补了已知生存必需基因而不能敲除基因组中对应的区域时，通过进一步的将该区域细分，可以定位出可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

本发明高效敲除大肠杆菌基因组的方法具有下列特征：

1）在大肠杆菌生存必需基因的选择上，不仅收集了单基因敲除和基因回补等实验数据，还包含了在生化和代谢途径等生物信息学预测中认为组成一个完整生命体的最小基因集合，因此为目前已知的较为完整的大肠杆菌生存必需基因集合；

2）构建的酵母-大肠杆菌穿梭载体pXX11，在酵母和大肠杆菌都能稳定存在，且均为单拷贝。利用该载体可在酵母体内高效拼接和克隆多个DNA片段；

3）回补了大肠杆菌生存必需基因后，将染色体上对应的大片段区域分成较小区域进行平行敲除，迅速对染色体上可敲除区域进行初步筛查。对于连续的可敲除的较小区域可并在一起进行大片段的一次敲除，提高了敲除速度；

4）对于已回补了生存必需基因，但对应的染色体区域仍不能敲除的，可进一步分小段敲除并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件。本发明选择已经商业化的菌株MDS42（购自SG公司（Scarab Genomics））为出发菌株，该菌株敲除了前噬菌体、转座子、插入系列等DNA片段，基因组更稳定并减小了14%（4）。

本发明提供一种包括骨架载体的核酸序列，其中所述骨架载体能在酵母和大肠杆菌中稳定存在。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体在酵母和大肠杆菌中均为单拷贝。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体包括酵母载体复制区和筛选标记以及Bac载体的复制区、分配区和筛选标记。酵母载体复制区是酵母载体中用于控制其自主复制的区域。Bac载体的复制区是Bac载体中用于控制其自主复制的区域。Bac载体的分配区是Bac载体中用于控制其拷贝数的区域。筛选标记是用于选择性筛选分别的阳性转化子的基因。

在一个具体实施方式中，本发明所用的酵母载体为pSH47，本发明所用的Bac载体为pBeloBAC11。

在一个具体实施方式中，酵母载体复制区为CEN6ARS4，筛选标记为URA3；在一个具体实施方式中，Bac载体复制区包括复制起始ori、repA，分配区包括调控基因sopA、sopB、sopC，筛选标记为Cm。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体具有SEQ ID NO:1所示的序列。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体为穿梭质粒pXX11。

本发明提供一种敲除大肠杆菌基因组的方法，所述方法包括：

1）将至少一个骨架载体与2个以上大肠杆菌生存必需基因串联拼接后转化大肠杆菌；

2）敲除大肠杆菌基因组或其片段。

在一个实施方式中，步骤2）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤1）所述的2个以上大肠杆菌生存必需基因。

本发明还提供一种定位生存必需基因或调控元件的方法，所述方法包括：

1）将至少一个骨架载体与2个以上大肠杆菌生存必需基因串联拼接后转化大肠杆菌；

2）敲除大肠杆菌基因组或其片段；和

3）对于已回补了生存必需基因，但敲除包含该基因的染色体区域后仍导致大肠杆菌无法生存的情况，进一步分段敲除该区域并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

在一个实施方式中，步骤2）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤1）所述的2个以上大肠杆菌生存必需基因。

本发明一个具体实施方式中，提供一种敲除大肠杆菌基因组的方法，所述方法包括：

1）通过将酵母复制区和筛选标记与大肠杆菌Bac载体复制、分配区和筛选标记连接后转化大肠杆菌，构建大肠杆菌和酵母的穿梭载体pXX11；

2）将2个以上大肠杆菌生存必需基因与至少一个线性化的载体pXX11一起转入酵母中进行拼接；

3）抽取酵母质粒后转化已含辅助质粒的大肠杆菌菌株（例如MDS42）；和

4）平行敲除大肠杆菌基因组或其片段。

在一个实施方式中，步骤4）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤2）所述的生存必需基因。

本发明还提供一种定位生存必需基因或调控元件的方法，所述方法包括：

1）通过将酵母复制区和筛选标记与大肠杆菌Bac载体复制、分配区和筛选标记连接后转化大肠杆菌，构建大肠杆菌和酵母的穿梭载体pXX11；

2）将2个以上大肠杆菌生存必需基因与至少一个线性化的载体pXX11一起转入酵母中进行拼接；

3）抽取酵母质粒后转化已含辅助质粒的大肠杆菌菌株（例如MDS42）；

4）平行敲除大肠杆菌基因组或其片段；和

5）对于已回补了生存必需基因，但敲除包含该基因的染色体区域后仍导致大肠杆菌无法生存的情况，进一步分段敲除该区域并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

在一个实施方式中，步骤4）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤2）所述的生存必需基因。

附图说明

图1：通过构建“大小染色体”高效删减大肠杆菌基因组方法的原理图。“小染色体”：将大肠杆菌生存必需基因拼接和克隆在单拷贝的骨架载体，称为“小染色体”；“大染色体”：将大肠杆菌染色体上含已克隆生存必需基因的大片段DNA通过精确打靶而迅速地删除，删减后的染色体称为“大染色体”；A，B：用于精确打靶的同源臂；R:抗生素选择标记。

图2：通过构建“大小染色体”高效删减大肠杆菌基因组方法的流程图。P1/P2，P3/P4：验证引物对。pREDI:用于无痕敲除的辅助质粒（11），该质粒为温敏（T^S）复制；且包含可由阿拉伯糖诱导的λ-Red同源重组蛋白αβγ，用于精确打靶敲除染色体大片段DNA；还包含可由鼠李糖诱导的I-SceI核酸内切酶，用于无痕去除筛选标记。

图3：大肠杆菌-酵母穿梭载体pXX11。其中酵母复制区（CEN6 ARS4）和筛选标记(URA3)来源于质粒pSH47；大肠杆菌复制区（Bac载体复制起始ori、repA及分配调控sopA、sopB、sopC）和筛选标记（Cm），来源于pBeloBAC11。

具体实施方式

I定义

如本文所用，术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

对于数值x来说，术语“约”指，例如x±10%。

本文所用术语“核酸”可以指DNA或RNA。本文所用的术语“核酸序列”可以指DNA或RNA的序列。核酸序列可为环形。DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码区序列可以是SEQ ID NO：1所示的编码序列的简并变异体。此处所用的“简并变异体”指与参比核酸编码相同氨基酸序列、但核酸序列不同于参比核酸的核酸变异体。

本文所用的术语“载体”和“表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。这些载体能够在宿主体内复制和稳定。这些载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

在本发明中适用的载体包括但不限于：pXX11（例如，其序列可如SEQ IDNO:1所示）、pREDI、pBeloBAC11、pSH47。本文所用术语“重组表达载体”和“重组载体”指包含目标核酸的表达载体。例如本发明的重组表达载体包含以适于核酸在宿主细胞中表达形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞而选择的条件序列，其与表达的核酸可操作的连接。在重组表达载体中，“可操作的连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明核酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac、trp、阿拉伯糖诱导的（araC）、鼠李糖诱导的（rhaRS）启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。此外，“重组表达载体”优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

本文所用的术语“生存必需基因”和“必需基因”可互换使用，指在一定环境条件下，某种生物体包含的全部基因中维持该生物体的正常生命活动所必不可少的基因。这些基因所编码蛋白质的功能被认为是生命的基础。本文所用的术语“最小基因集合”是指在理想条件下（如具有足够的必需营养物质、没有外界环境的压力因素等）维持细胞正常生命活动的尽可能小的基因组合。一般情况下，最优的生长条件对应的是最小基因集合。本发明中的生存必需基因包括但不限于大肠杆菌452个生存必需基因的最小基因集合。在另一实施方式中，本发明核酸序列中包含的大肠杆菌生存必需基因为asnT、yefM、dcd、gatB、gatA、metG、folE、rplY、yejM或proL。在另一实施方式中，本发明核酸序列中包含的大肠杆菌生存必需基因为rpiA、fabA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、parC、mqsA、parE或ribB。本文所用的术语“生长非必需基因”或“非必需基因”可互换使用，指某种生物体包含的全部基因中除生存必需基因以外的任何基因。

本文所用术语“小染色体”指拼接和克隆有大肠杆菌生存必需基因的单拷贝载体。在一个优选的实施方式中，所述载体为Bac来源的质粒。在一个具体实施方式中，所述Bac来源的质粒为pBeloBAC11。在一个具体实施方式中，所述Bac来源的质粒包括Bac载体复制起始ori、repA及分配调控sopA、sopB、sopC以及筛选标记Cm。“大染色体”指将大肠杆菌染色体上含已克隆生存必需基因的大片段DNA通过精确打靶而迅速地删除后减小的染色体。在一个优选的实施方式中，所述染色体为大肠杆菌MDS42。

本文所用术语“大片段区域”指染色体上包含对应生存必需基因的较大片段。本文所用术语“较小区域”指大片段区域中的一个或多个较小片段。本文所用术语“能敲除”或“可敲除”指染色体上对应区域敲除后，大肠杆菌仍能维持细胞正常生命活动。本文所用术语“不能敲除”或“不可敲除”指染色体上对应区域敲除后，大肠杆菌不能维持细胞正常生命活动。在一个实施方式中，在回补了生存必需基因后，可敲除区域包括生长必需基因和/或生长非必需基因。

本文所用术语“调控元件”可包括启动子、增强子、响应元件、信号肽、内部核糖体进入序列、聚腺苷酸信号、终止子、或调控核酸表达（如转录或翻译）的可诱导元件。

本文所用术语“基因组”指包含在一个生物体的DNA（部分病毒是RNA）中的全部遗传信息。基因组包括基因和非编码DNA。一般地，一个生物体的基因组是指一套染色体中的完整的DNA序列。例如，生物个体体细胞中的二倍体由两套染色体组成，其中一套DNA序列就是一个基因组。基因组一词可特指核DNA（例如，核基因组），也可用于包含自身DNA序列的细胞器基因组，如粒线体基因组或叶绿体基因组。

在一个实施方式中，本文所述酵母为BY4742。本文所述“大肠杆菌”可为MG1655、MDS42、Top10、DH10B。在一个实施方式中，本文所述大肠杆菌为Top10或MDS42。

本文所述“敲除”或“删除”指将目标基因从基因组中删除的技术。本文所述“精确打靶敲除”基因组的精确打靶敲除方法见文献（11）。本文所述“平行敲除”指将大片段区域分成较小区域，然后平行进行敲除。原则上，包含已回补的生存必需基因的基因组大片段DNA可以被一次敲除。但是，若该区域存在生存重要的调控区域，则大片段的敲除比较困难。为了快速确定可敲除区域，本文所述“敲除”可指将大片段区域分成20-50kb的较小区域，平行进行敲除，然后连续的可敲除区域再并成一个大区域进行敲除。本发明中，敲除的大肠杆菌基因组或其片段可包含敲除步骤前转入的2个或2个以上大肠杆菌生存必需基因，也可包含其它元件。文献（11）所述的精确打靶敲除方法的主要步骤为：1）通过导入含染色体敲除片段两端同源臂的线性片段（该片段还含2个I-SceI位点及敲除片段一侧外端的同源臂），并用阿拉伯糖诱导λ-Red蛋白αβγ，通过同源重组可以精确打靶敲除染色体大片段DNA；2）由鼠李糖诱导I-SceI核酸内切酶，切割I-SceI位点，造成双链断裂重组，用于无痕去除筛选标记。

本文所述“基因回补”指将被敲除的基因以游离存在的质粒或整合到染色体的方式转入回宿主。所述被敲除的基因包括生长必需基因和/或生长非必需基因。本领域技术人员熟知任何所述转入方法，包括但不限于通过载体的电转化，化学转化等。在一个实施方式中，所述宿主为大肠杆菌MDS42。

本文所用术语“骨架载体”或“骨架质粒”指载体中除目标片段以外的部分。在一个实施方式中，所述骨架载体能在酵母和大肠杆菌中稳定存在。在一个实施方式中，所述骨架载体在酵母和大肠杆菌中均为单拷贝。在一个实施方式中，所述骨架载体为pXX11。在一个实施方式中，所述骨架载体具有SEQ IDNO:1所示的核酸序列。本文所用术语“穿梭载体”或“穿梭质粒”可互换使用，是指能在两种不同的生物中复制的载体或质粒。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体或质粒。穿梭载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状（筛选标记），并具有多克隆位点。在一个实施方式中，本发明骨架载体或穿梭载体包括酵母质粒pSH47的复制区和筛选标记以及大肠杆菌质粒pBeloBAC11的复制、分配区和筛选标记。本文所述骨架载体或穿梭载体包括但不限于pXX11。

本发明所用术语“串联拼接”或“串联的”指序列中两个或两个以上的元件头尾相连的拼接方式。所述元件包括基因。串联拼接或串联的元件可为天然相邻的元件或天然不相邻的元件。本领域技术人员已知串联拼接中各元件可以任何顺序头尾相连。在本发明一个实施方式中，串联拼接指骨架载体与多个大肠杆菌生存必需基因头尾相连拼接。串联拼接或串联可包括2个以上的元件。在一个实施方式中，串联拼接或串联可包括2-452、2-300、2-200、2-100、2-50、2-40、2-30、2-25、2-20、2-15、2-11或2-10个元件。串联拼接或串联的序列长度至少为0.5kb。在一个实施方式中，串联拼接或串联的序列长度为0.5-500kb、0.5-400kb、0.5-300kb、0.5-200kb、0.5-100kb、0.5-50kb或0.5-25kb。

II大肠杆菌生存必需基因的选择

通过综合已报道实验数据，包括单基因敲除实验，基因敲除回补实验及其他文献数据（1，2，6）；同时，加上生物信息学预测的数据（7，8,9），包括生化预测及代谢途径的预测中认为构建一个完整生命体必需的最小基因集合。共整合成了含452个生存必需基因的集合。

III大肠杆菌-酵母穿梭载体的构建

通过将酵母质粒复制区和筛选标记（来源于pSH47，PCR扩增、克隆测序后以HpaI和BamHI酶切）与大肠杆菌Bac载体复制、分配区和筛选标记（来源于pBeloBAC11，HpaI和BamHI酶切）连接后转化大肠杆菌，构建大肠杆菌和酵母的穿梭载体。在一个实施方式中，所述骨架载体能在酵母和大肠杆菌中稳定存在。在一个实施方式中，所述穿梭载体在大肠杆菌和酵母中为单拷贝。在一个实施方式中，所述穿梭载体为pXX11。

IV大肠杆菌生存必需基因的扩增

所有生存必需基因取200-300bp启动子+CDS+50-100bp终止子序列(参考EcoCyc（http://ecocyc.org）中的基因转录单元信息,同时参考PEC（http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp）中预测的启动子及敲除中的回补区域等信息)，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。每个片段之间及片段与载体之间均有100bp的重叠（overlap），通过引物带入。用于拼接的每组DNA的第一个片段5’端及最后一个片段3’端含NotI或其他稀有酶切位点，便于酶切释放拼接好的DNA片段进行第二轮的拼接。

V大肠杆菌生存必需基因的拼接和克隆

以8-10个生存必需基因为一组，与PCR扩增的线性化的载体pXX11一起,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进行拼接。酵母转化方法见文献（10）。酵母转化子通过KOD-FX酶（购自东洋公司(Toyobo)）进行菌落PCR验证是否含正确拼接。含正确拼接质粒的酵母克隆通过蜗牛酶裂解细胞壁后，利用BAC/PAC试剂盒（购自欧米茄公司（Omega））抽取质粒后转化大肠杆菌DH10B或Top10。从大肠杆菌抽取质粒后进行酶切验证。酶切验证的质粒转化已含辅助质粒pREDI（11）的大肠杆菌菌株MDS42。

VI大肠杆菌基因组的大片段精确打靶敲除

基因组的精确打靶敲除方法见文献（11）。原则上，包含已回补的生存必需基因的基因组大片段DNA可以被一次敲除。但是，若该区域存在生存重要的调控区域，则大片段的敲除比较困难。为了快速确定可敲除区域，一般先将大片段区域分成20-50kb的较小区域，平行进行敲除。连续的可敲除区域再并成一个大区域进行敲除。

VII定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件

对于已回补了生存必需基因，但不能敲除染色体上对应区域的，分小段敲除，最后定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件，并进行深入的研究。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook和Russell所著的Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆实验指南第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1敲除大肠杆菌MDS42染色体中的SLD2区域。

SLD2区域对应于大肠杆菌MDS42染色体1,656,840-1,906,407bp，该区域包括了10个生存必需基因(asnT,yefM,dcd,gatB,gatA,metG,folE,rplY,yejM,proL)。将这10个生存必需基因及其调控区用9对引物以高保真酶分别扩增后与线性化的载体（200ng）以5:1的摩尔比一起转入酵母中。其中gatB和gatA在一个转录单元，所以用一对引物扩增整个转录单位为一个片段。所用引物为：SLD2-1-F/R至SLD2-xx-F/R（SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:19）。酵母转化方法及试剂、培养基的配制见参考文献（10），在该文献的基础上做了一些改进，基本步骤为：

1.酵母菌BY4742在YPD板上划线，30℃培养2天；

2.挑酵母菌单菌落接至5mL2*YPAD液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养；

3.过夜酵母菌液稀释10倍测OD₆₀₀，此时OD应为0.4-0.5（表示生长良好）。1:20到1:25转接到2*YPAD液体培养基，使起始OD₆₀₀小于或等于0.2。30℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，约4-5个小时；

4.20℃，5,000g离心5分钟收菌，用1/2体积无菌水重悬（如50mL菌液用25mL无菌水重悬）离心收菌；

5.1/2体积无菌水再洗一次，离心收菌，用1mL无菌水重悬后转至1.5mLEP管中，13,000g，30秒离心收菌；

6.用1/50体积无菌水重悬（如50mL菌液最后用1mL无菌水重悬），100μL每管分装备用；

7.取出-20℃冻存的ssDNA（鲑精DNA）100℃变性5分钟后，立刻插入冰里；

8.将备用的酵母菌13,000g离心30秒，弃上清。依次加入（可先准备除DNA片段外的混合物，再分别加DNA片段）：

注：正对照：环形的酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXX11。负对照：只加ddH2O34μL。

9.用上述混合液重悬酵母菌（可涡旋）；

10.42℃热击25分钟（每5分钟混匀一次）；

11.13,000g离心1分钟去上清，用1mL ddH₂O重悬酵母菌，分别取200μL和800μL涂SC板。

12.30℃培养2-3天，长出200-300个菌落。

在每个拼接片段与相邻片段间设计验证引物验证，引物序列对为SLD2-a-F/R至SLD2-e-F/R（SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:29）。扩增片段长度为0.8-2.0kb之间。挑取12个酵母转化子分别悬于20ul无菌水中，混匀后取1uL为模板，用KOD-FX酶进行PCR验证。PCR验证拼接正确率为20%-100%。

含正确拼接质粒的酵母转化子接种于5mL SC培养基，30℃200rpm过夜培养。取3mL酵母培养液离心，重悬于500uL破壁缓冲液中（1M D-山梨醇和0.1M EDTA，pH7.5，加入1.5%的蜗牛酶及100mM EDTA）。37℃温育2小时破壁（中间混匀几次）。2,000g离心10分钟收集原生质体。用BAC/PAC试剂盒抽提质粒（正确拼接的质粒大小应为25kb），转化大肠杆菌Top10。

用BAC/PAC试剂盒从大肠杆菌中抽提质粒后进行酶切验证。酶切正确的质粒转化大肠杆菌MDS42（已含辅助质粒pREDI）。

将大肠杆菌MDS42基因组SLD2区域共分为7段，分别为SLD2-1(1,656,840-1,680,704bp)、SLD2-2(1,681,160-1,700,136bp)、SLD2-3(1,700,240-1,732,787bp)、SLD2-4(1,733,280-1,767,868bp)、SLD2-5(1,771,010-1,815,410bp)、SLD2-6(1,815,816-1,856,030bp)、SLD2-7(1,854,535-1,906,407bp)，敲除片段大小为19-44kb。利用精确打靶敲除的方法进行平行敲除。针对敲除区域外部设计引物（只有成功打靶敲除的克隆能扩增得到产物）以及敲除区域内部的非必需基因设计引物（若成功打靶敲除，则无法扩增得到产物；若未敲除成功，则可扩增得到产物）。利用上述两对引物进行菌落PCR验证，6段敲除正确率为90%-100%，均证明已成功敲除。而第7段未能被敲除。目前已将前6段并在一起（即1，656，840-1，856，030bp区域，共199kb）进行大片段DNA的一次成功敲除，得到敲除子个数大于1000个，菌落PCR验证敲除正确率为100%。

若用传统的基因组敲除方法必须避开生存必需基因，因此敲除片段大小受到限制。在前人的工作中（3），对应于前6段199kb区域，在大肠杆菌菌株MG1655基因组中共进行了4次连续敲除，但仍无法把该区域都敲除掉。在该区域留下了大小为6.8kb，2.2kb和49.4kb的3个片段未能敲除。因此，本发明只需进行第一次的初筛加第二次的大片段敲除就能完整删去该区域，能更快速地减小大肠杆菌基因组DNA。

实施例2敲除大肠杆菌MDS42染色体中的LD4区域并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件

LD4区域对应于大肠杆菌MDS42染色体2,549,150-2,674,296bp，该区域包括了11个生存必需基因(rpiA,fabA,pgk,yqgD,metK,yqgF,plsC,parC,mqsA,parE,ribB)。将这11个生存必需基因及其调控区PCR扩增后与线性化的载体（200ng）以5:1的摩尔比，利用与实施例1中的相似的方法转入酵母中，并通过菌落PCR验证找到含正确拼接质粒的酵母菌，抽提质粒后转化大肠杆菌Top10。从Top10转化子中抽质粒（25kb）进行酶切验证，正确的质粒电转化导入大肠杆菌MDS42（已含辅助质粒pREDI）。

对MDS42染色体中的LD4区域分成5段（见表1）进行精确打靶敲除，分别为LD4-1(2,549,150-2,588,294bp)、LD4-2(2,588.572-2,601,149bp)、LD4-3(2,600,919-2,619,840bp)、LD4-4(2,619,969-2,647,967bp)、LD4-5(2,648,100-2,674,296bp)。其中，LD4-2～4-4可以成功敲除，LD4-1及LD4-5不能被敲除。对于连续的可敲除的片段LD4-234（2,588,572-2,647,967bp）成功地进行了大片段的一次敲除。LD4-234在大肠杆菌MG1655菌株基因组中对应的区域，在前人的工作中(3)进行了也2次的敲除，但由于生存必需基因的限制未能全部敲除，在前后还分别留有12kb和28kb的片段未能敲除。而本发明只进行了第一次的初筛加第二次的大片段敲除就删去了整个区域，敲除区域更大。

此外，对于不能被敲除的LD4-1，进一步分成了4个小段进行敲除，分别为LD4-1-1（2,549,148-2,557,323bp），LD4-1-2(2,557,809-2,567,236bp)，LD4-1-3（2,567,543-2,575,422bp），LD4-1-4（2,575,636-2,588,253bp）。其中，LD4-1-3及LD4-1-4可以被敲除，而LD4-1-1及LD4-1-2不能被敲除。由此暗示，这两个小段中可能存在新的生存必需基因或调控元件，具体需要进一步的定位和分析。因此，与传统的基因组敲除方法相比，本发明不仅提供了一个更快速的基因组敲除方法，还提供了一个发现新的生存必需基因或调控元件的方法。

表1.利用本发明敲除大肠杆菌MDS42染色体中的LD4区域的结果。

上文所列的各相关文献均以全篇引入本申请作为参考。本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明之精神与范围的前提下，对上述描述的任何修饰都是允许的。同样，类似的情况也包括在权利要求中。

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