基于金纳米粒子-多肽团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法

摘要

本发明公开了一种基于金纳米粒子-多肽复合物团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法，属于光学传感技术领域。它先将蛋白激酶对应的底物多肽通过半胱氨酸的巯基连接到金纳米粒子表面，制备金纳米粒子-多肽复合物；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽的丝氨酸位点发生磷酸化，当有Zr

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于金纳米粒子-多肽团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法，属于光学传感技术领域。

背景技术

蛋白质的磷酸化是人体内翻译后修饰的重要过程，在新陈代谢及细胞间信息传导等方面起着重要的作用，异常的磷酸化反应会导致多种疾病。至今，一些相关的研究表明人体的一些重大疾病如白血病，阿茨海默症，甚至是癌症等都与相关蛋白质磷酸化异常表达有关。磷酸化反应的产生是由于蛋白质激酶催化蛋白质发生磷酸化，因此快速、灵敏地识别蛋白质激酶的活性一直是生物学科中一个重要的研究课题，它不仅有助于研究细胞内信号传导的分子机制，也在一些重大疾病的早期诊断和药物研发中起着十分重要的作用。

金纳米粒子（AuNPs）是一种金属纳米粒子。近年来的研究表明金纳米粒子除了具有纳米粒子的性质外，还具有荧光、超分子与分子识别等特性。因此，在生物分析和临床诊断方面，AuNPs常常作为第一选择用来进行相关的免疫标记，这是由于AuNPs当遇到目标物质时会产生相应的颜色变化，从而引起金纳米粒子紫外吸收的变化，实现分析检测。利用AuNPs的团聚反应检测蛋白激酶的活性，为分析检测蛋白激酶提供了一种简单、灵敏、有效的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于AuNPs -多肽团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法。

本发明是这样来实现的，首先合成AuNPs，采用涡旋偶联的方法将蛋白激酶对应的底物多肽连接于AuNPs表面，再通过构建磷酸化反使AuNPs表面的多肽带有磷酸基团，利用磷酸基团与Zr⁴⁺离子之间的多重螯合作用诱导AuNPs发生团聚，通过紫外吸收峰的减弱以及共振光散射峰的增强，建立了一种基于AuNPs -多肽团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法。

本发明采用以下技术方案：

（1）AuNPs的制备：将50 mL 0.05 g/L的HAuCl₄.4H₂O在磁力搅拌下加热煮沸，再快速加入1 mL质量百分数为5%的柠檬酸钠溶液，溶液颜色由黄色变成深酒红色后，持续沸腾5分钟，即合成了单分散的AuNPs；

（2）AuNPs-多肽复合物的制备：将1 mg牛血清蛋白、1 mL的AuNPs溶液和10 μL 500 μM多肽混合，在涡旋仪上旋转10分钟，4 ℃下反应12小时后，在15000 rpm的转速下离心15分钟，去除上层清液，将沉淀重悬于1mL浓度为35 mM、pH为7.5的Hepes缓冲溶液中，制备成AuNPs-多肽复合物；

（3）AuNPs-多肽的磷酸化：将50 μL的AuNPs-多肽复合物、30 μL 500 U/mL蛋白激酶A（PKA）、20 μL 1 mM三磷酸腺苷（ATP）和100 μL超纯水混合，在37 ℃孵育2小时，制得AuNPs-磷酸化多肽复合物；

（4）PKA及其抑制剂检测：将20 μL的AuNPs-磷酸化多肽复合物、330 μL超纯水和50 μL 0.8 mM的Zr⁴⁺溶液混合，在Zr⁴⁺的诱导作用下，AuNPs-多肽复合物发生团聚，随着PKA浓度的增加，AuNPs的紫外吸收减小，PKA的浓度在1.2-9.4 U/mL范围内与AuNPs的紫外吸收强度呈线性关系，检测限为0.4 U/mL。AuNPs的光散射强度随着PKA抑制剂鞣花酸浓度的增加而降低，当鞣花酸浓度为15 μM时，光散射强度降到最低，表明随着鞣花酸浓度的增加，鞣花酸抑制了PKA的活性，使得PKA催化多肽磷酸化反应的能力下降，AuNPs-多肽发生磷酸化的程度降低，计算得到的鞣花酸的半抑制浓度为4.02 μM。

本发明的技术效果是：本发明利用Zr⁴⁺与磷酸基团之间的螯合作用，在PKA和ATP的作用下，诱导AuNPs-磷酸化多肽复合物发生团聚，使得AuNPs的紫外吸收峰下降和共振光散射峰增强，构建了一种基于AuNPs-多肽复合物团聚效应的蛋白激酶及其抑制剂检测方法，该方法具有灵敏度高、检测限低和稳定性好等特点。

附图说明

图1是基于AuNPs-多肽复合物团聚效应的PKA检测原理图。

图2是（A）AuNPs和（B）AuNPs-多肽在加入75 U/mL PKA+100 μM ATP发生磷酸化反应后再加入0.1 mM Zr⁴⁺，（C）AuNPs-多肽中加入4.02 μM 鞣花酸，再加入75 U/mL PKA+100 μM ATP+0.1 mM Zr⁴⁺反应后的透射电镜图。

图3是（a）AuNPs和（b）AuNPs-多肽复合物的紫外-可见吸收光谱图。

图4是AuNPs-多肽复合物中（a）不加PKA和（b）加75 U/mL PKA，再分别加入100 μM ATP，0.1 mM Zr⁴⁺反应后的紫外-可见吸收光谱图。内插图：分别与（a）和（b）对应的照片。

图5是（A）在AuNPs-多肽中加入不同浓度PKA（a~g：1.2，2.3，4.7，9.4，18.6，37.5，75 U/mL），再分别加入100 μM ATP+0.1 mM Zr⁴⁺发生团聚反应的紫外-可见吸收光谱图。（B）是吸光度-PKA浓度曲线。

图6是（A）AuNPs-多肽复合物团聚的共振光散射光谱图：PKA浓度分别为0，1.2，2.3，4.7，9.4，18.6，37.5，75 U/mL，ATP浓度为100 μM，Zr⁴⁺浓度为0.1 mM。（B）共振光散射强度-PKA浓度曲线。

具体实施方式

实施例1

（1）AuNPs的制备：将50 mL 0.05 g/L的HAuCl₄.4H₂O在磁力搅拌下加热煮沸，再快速加入1 mL质量百分数为5%的柠檬酸钠溶液，溶液颜色由黄色变成深酒红色后，持续沸腾5分钟，即合成了单分散的AuNPs；

（2）AuNPs-多肽复合物的制备：将1 mg牛血清蛋白、1 mL的AuNPs溶液和10 μL 500 μM多肽混合，在涡旋仪上旋转10分钟，4 ℃下反应12小时后，在15000 rpm的转速下离心15分钟，去除上层清液，将沉淀重悬于1mL浓度为35 mM、pH为7.5的Hepes缓冲溶液中，制备成AuNPs-多肽复合物；

（3）AuNPs-多肽的磷酸化：将50 μL的AuNPs-多肽复合物、30 μL 500 U/mL的PKA、20 μL 1 mM的ATP和100 μL超纯水混合，在37 ℃孵育2小时，制得AuNPs-磷酸化多肽复合物。

采用透射电镜对AuNPs和AuNPs-多肽复合物的形貌进行表征，结果如图2所示。由图2A可见，AuNPs的平均粒径约为13 nm；在AuNPs-多肽复合物中加入PKA和ATP催化多肽的磷酸化反应，再加入Zr⁴⁺诱导AuNPs-多肽复合物发生团聚（图2B）；当AuNPs-多肽复合物和鞣花酸预先混合，再加入PKA、ATP和Zr⁴⁺时，鞣花酸抑制了PKA的活性，使得AuNPs-多肽复合物的磷酸化程度降低，故而AuNPs-多肽复合物仍然保持较好的分散状态（图2C）。

采用紫外-可见吸收光谱对合成的AuNPs以及PKA对应的底物多肽在AuNPs表面的组装，结果如图3所示。AuNPs在523 nm处有一个紫外吸收峰；当PKA识别的底物多肽LRRASLGGGGC通过端位半胱氨酸的巯基以金-巯键形式连接于AuNPs表面时，AuNPs-多肽复合物的吸收峰红移了5 nm，表明PKA识别的底物多肽连接到了AuNPs表面，成功制备了AuNPs-多肽复合物。

实施例2

采用紫外-可见吸收光谱对AuNPs-多肽复合物的团聚现象进行表征（图4）。合成的AuNPs-多肽复合物有良好的紫外吸收峰（曲线a）；在PKA和ATP的作用下，AuNPs-多肽复合物表面的丝氨酸位点发生磷酸化，加入的Zr⁴⁺与AuNPs-磷酸化多肽的丝氨酸位点的磷酸基团发生多重螯合作用，使得AuNPs-多肽复合物发生团聚，AuNPs的紫外吸收峰减小（曲线b）。AuNPs-多肽复合物长时间放置后溶液的颜色保持酒红色不变（a），表明本发明制备的AuNPs-多肽复合物具有良好的稳定性；而在AuNPs-多肽复合物中加入PKA和ATP反应后，再加入Zr⁴⁺时，溶液的颜色从酒红色变成蓝色，并在管底产生沉淀（b），表明AuNPs-多肽复合物的团聚是由于PKA和ATP对多肽的磷酸化反应所致。

PKA及其抑制剂检测：检测原理如图1所示，将AuNPs-磷酸化多肽复合物与Zr⁴⁺溶液混合，在Zr⁴⁺的诱导作用下，AuNPs-多肽复合物发生团聚，随着PKA浓度的增加，AuNPs的紫外吸收峰减小，PKA的浓度在1.2-9.4 U/mL范围内与AuNPs的紫外吸收强度呈线性关系，检测限为0.4 U/mL，结果如图5所示。本发明方法是基于Zr⁴⁺诱导AuNPs-磷酸化多肽复合物的团聚反应来检测PKA活性，所以，AuNPs之间距离的改变将导致共振光散射的变化，利用AuNPs共振光散射峰的增强也可检测PKA的活性，结果如图6A所示。以AuNPs-多肽复合物加入Zr⁴⁺的共振光散射峰强度为对照，向AuNPs-多肽复合物中加入不同浓度的PKA发生磷酸化反应，再加入Zr⁴⁺，测量共振光散射峰；随着PKA浓度的增加，共振光散射峰以相似的峰形逐渐增大，表明AuNPs-多肽复合物的团聚程度随着PKA浓度的增大而增大，由图6B可见，共振光散射峰的强度与PKA浓度在1.2-9.4 U/mL范围内呈良好的线性关系，检测限为0.38 U/mL。采用共振光散射法检测PKA的灵敏度可与紫外吸收光谱法相媲美，进而表明共振光散射法可用于生物样品中蛋白激酶活性的分析。

本研究以鞣花酸为例采用共振光散射法对PKA的抑制剂进行筛选。先将PKA与不同浓度的鞣花酸混合，再加入AuNPs-多肽复合物和ATP，反应2小时，再向该混合溶液中加入Zr⁴⁺，随后检测共振光散射峰强度变化。当鞣花酸浓度为0时的共振光散射强度较强，而随着鞣花酸浓度的增加，共振光散射强度逐渐降低。这是由于随着鞣花酸浓度的增加，鞣花酸抑制了PKA的活性，使得PKA催化多肽发生磷酸化反应的能力降低，AuNPs-多肽表面的磷酸基团减少，表明鞣花酸对PKA活性具有良好的抑制作用。