一株枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂和它们的应用方法

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂和它们的应用方法，该枯草芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014053。该菌株通过抗猪产毒巴氏杆菌筛选，能在培养皿实验中抑制猪产毒巴氏杆菌的生长繁殖。将枯草芽孢杆菌AP139在动物养殖舍中进行喷雾，具有显著的抑制空气中巴氏杆菌的生长特性，减少了养殖场巴氏杆菌发病率，同时也对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有很好的抑制效果，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物杀菌剂领域，更具体涉及一种枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂，同时还涉及它们在制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种制剂中的应用。 

背景技术

多杀性巴氏杆菌是畜、禽、野生动物和人类的一种重要共患性病原，主要通过呼吸道传播，可引起禽霍乱、猪肺疫和牛出血型败血症等，是养殖场一种非常常见的呼吸道传染性疾病，在无抗生素使用的条件下发病率较高。巴氏杆菌在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中均有存在，养殖场环境中存在多种巴氏杆菌，空气中一定滴度的巴氏杆菌在适宜的条件下致病。 

随着畜禽养殖集约化和规模化程度不断提高，养殖场空气质量逐渐降低，巴氏杆菌引起动物发病的概率和损害程度不断增加。目前，养殖场对巴氏杆菌引起的疾病进行控制主要通过抗生素进行预防和治疗。然而，抗生素的大量使用引起内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、畜禽免疫力下降和畜产品及环境中残留引起二次污染等一系列严重问题，很多国家和地区比如欧盟和韩国都已经禁止使用抗生素。因此，如何在对人和环境影响较小或不影响的条件下，有效预防巴氏杆菌的感染与传播，是一个急需解决的问题。 

本发明研制的枯草芽孢杆菌AP139及其发酵菌剂能抑制养殖舍中巴氏杆 菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长繁殖，尤其是巴氏杆菌，降低了养殖场由巴氏杆菌引起的发病率，具有良好的应用前景和重大的经济及社会意义。 

发明内容

本发明的主要目的是在于提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139及其发酵菌剂和它们的应用方法，该菌株及其菌剂能显著的抑制养殖舍中巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的生长繁殖，尤其是巴氏杆菌，降低了养殖场由巴氏杆菌引起的发病率。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一株保藏编号为CCTCC NO：M2014053的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂，是由以下方法制备而成的： 

第一步：所述的枯草芽孢杆菌AP139在LB固体培养基上进行划线培养，培养温度30-37℃，培养时间18-36h； 

第二步：从第一步的LB固体培养基上挑取枯草芽孢杆菌AP139单个克隆株至装有20-40％容积LB液体培养基的10ml EP管中，培养温度为30-37℃，转速为150-225r/min，培养时间18-36h；然后用LB液体培养基调整细菌浓度为1×10⁹-10¹⁰CFU/ml，取3-5ml接种于100mlLB液体培养基中，在摇床中进行培养，培养温度30-37℃，转速150-225r/min，培养时间18-36h； 

第三步：取第二步所得到的枯草芽孢杆菌AP139液体摇瓶培养液，按照3-5％体积接种量，接种到10L发酵罐中，发酵条件为：装液量4-7L的LB液体培养 基，发酵温度25-40℃，pH值6.8-7.8，发酵时间18-36h，转速，200-400r/min。 

所述的枯草芽孢杆菌用于抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种，优选用于抑制巴氏杆菌。 

所述的枯草芽孢杆菌用于制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的制剂，优选用于制备抑制巴氏杆菌的制剂。 

所述的枯草芽孢杆菌用于制备养殖舍消毒的制剂，或者动物饲料的添加剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种，优选用于抑制巴氏杆菌。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于制备抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的制剂，优选用于制备抑制巴氏杆菌的制剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂也用于制备养殖舍消毒的制剂，或者动物饲料的添加剂。 

所述的枯草芽孢杆菌AP139的发酵菌剂的应用方法具体是将所述菌株的发酵菌剂先制备成1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的溶液，LB液体培养基500-3000倍稀释后在养殖舍中进行喷雾，使得喷雾后养殖舍枯草芽孢杆菌AP139的浓度为1×10⁵-1×10⁶CFU/m³。 

优选将所述菌株的发酵菌剂先制备成10⁸CFU/mL的溶液，LB液体培养基1000倍稀释后在养殖舍中进行喷雾，使得喷雾后养殖舍枯草芽孢杆菌AP139的浓度为3×10⁵CFU/m³。 

LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g、蒸馏水1000ml，PH值6.8-7.2。 

LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、蒸馏水1000ml，PH值6.8-7.2； 

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139功能鉴定与特性： 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139于2014年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2014053，地址：中国.武汉.武汉大学。 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139其16S ribosomal RNA基因序列，为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139的16S ribosomal RNA基因序列，通过PUBMED数据库进行比对，(数据库网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Bla stSearch&LINK_LOC＝blasthome)发现与Bacillus subtilis strain SY1 16S ribosomal RNA gene(JX489618.1)同源性最高。 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139在LB固体培养基上形成的单个细菌特点为：颜色呈白色、圆形、有分泌物。 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139抑菌活性：取1个LB营养琼脂平板，取20μL活化的猪产毒巴氏杆菌菌液，均匀涂布在LB固体平板上，置于恒温箱30-37℃培养10-30分钟后，利用打孔器在培养皿上打孔；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139发酵液10000-12000r/m离心1-5min后，取20-100μL上清加入培养皿的孔中，于恒温箱30-37℃培养24-48h。结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139对巴氏杆菌的抑菌圈直径为18-25mm。 

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139具有显著的抗菌活性，可显 著抑制养殖舍中巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的繁殖。将所述菌株的发酵液先制备成10⁸CFU/mL溶液，LB培养基1000倍稀释后在养殖舍中进行喷雾，喷雾后养殖舍枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139的浓度为3×10⁵CFU/m³，喷雾后，养殖舍中的巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的含量显著降低。 

本发明的有益效果在于： 

1、本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139及其发酵菌剂能通过抑制空气中巴氏杆菌生长繁殖，降低巴氏杆菌发病率和危害程度。 

2、本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139及其发酵菌剂还能显著的抑制养殖舍中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长繁殖。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。 

实施例1： 

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139的筛选 

从动物肠道中分离得到200多株芽孢杆菌，分别对这200多株芽孢杆菌进行大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、巴氏杆菌439(低毒巴氏杆菌)、巴氏杆菌2010(中毒巴氏杆菌)、巴氏杆菌2011(强毒巴氏杆菌)抑菌试验，结果芽孢杆菌139菌株对巴氏杆菌的抑制效果最佳，达到18-25mm，芽孢杆菌139菌株经生化及分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌，并将其命名为枯草芽孢杆菌AP139，在中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC M2014053，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1。 

表1、部分芽孢杆菌菌株对巴氏杆菌及其它致病菌的抑制效果 

实施例2： 

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139发酵菌剂的制备方法： 

A.枯草芽孢杆菌AP139(保藏号：CCTCC M2014053)在LB固体培养基上进行划线培养，培养温度30-37℃，培养时间18-36h； 

B、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139发酵液的制备：将步骤A所培养的取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139挑取单克隆，置于10ml EP管中(装有4ml LB培养基)，培养温度为37℃，转速为200r/min，培养时间24h。然后用LB液体培养基调整细菌浓度为10¹⁰CFU/ml，取4ml接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，转速为200r/min，发酵时间为24h。摇瓶发酵培养基为LB培养基，成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化 钠10g、蒸馏水1000ml，pH值为7.2。 

C、摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验：取200ml摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，装液量5L，发酵温度为37℃，pH值为7.2，搅拌速度为300r/min，发酵24h。发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基成分一致。 

实施例3： 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139抑菌活性验证： 

A、取3个LB营养琼脂平板，取20μL活化的巴氏杆菌菌液，均匀涂布在一个LB固体平板上，取20μL活化的沙门氏菌菌液，均匀涂布在另一个LB固体平板上，取20μL活化的大肠杆菌菌液，均匀涂布在第三个LB固体平板上，置于恒温箱37℃培养10分钟； 

B、利用打孔器在培养皿上打孔，孔直径为5毫米； 

C、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139发酵液12000r/m离心1min后，取20μL上清加入培养皿的孔中，于恒温箱37℃培养24h； 

D、结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139对巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别为22mm、13mm、24mm和19mm。 

实施例4： 

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139在预防养殖场巴氏杆菌中的应用，其步骤是： 

1、按照实施例2制备了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139菌液； 

2、将菌液制备成10⁸CFU/mL溶液，用LB培养基1000倍稀释后在养殖舍中进行喷雾，喷雾后养殖舍枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139的浓度为3×10⁵ CFU/m³； 

3、试验为单因子试验，共3组，实验组(AP139喷雾)，空白对照组(喷等体积的LB培养基)，阳性对照组(1﹕2000稀释的苯扎氯铵)，各处理组喷洒周期为1次/周，每组猪养殖数量20栏共200头50公斤左右的肥育猪，养殖舍面积为400平方米。试验第一天进行巴氏杆菌喷雾攻毒，巴氏杆菌喷雾剂量为1×10⁵CFU/m³。 

A、枯草芽孢杆菌AP139对巴氏杆菌攻毒后养殖舍肥育猪生长性能及巴氏杆菌发病率的影响； 

本试验结果表明，枯草芽孢杆菌AP139，在注射用巴氏杆菌进行喷雾攻毒的情况下，能显著提高猪平均日增重(p<0.05)，改善料肉比和降低猪巴氏杆菌的发病率(p<0.05)，提高猪的生产性能及经济效益(表2)，适合大范围推广应用。 

表2、枯草芽孢杆菌AP139对育肥猪生长性能和发病率的影响 

注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(p<0.05) 

B、枯草芽孢杆菌AP139对猪舍巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色 葡萄球菌数量的影响； 

在试验期末，利用KHW-8(安德森)八级空气生物采样器采集养殖舍空气，然后进行空气中DNA提取，采用荧光定量PCR对巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌进行定量。结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AP139显著降低了养殖舍中巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的含量，有效改善了养殖舍中微生态环境。 

表3、枯草芽孢杆菌AP139对养殖舍中巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量影响。 

注：以总细菌为内参，数据值(以2^-△△CT表示)＝(C_T，Target-C_T,总细菌)_试验组-(C_T，Target-C_T,总细菌)_对照组，空白对照组的2^-△△CT等于1 

综上所述，枯草芽孢杆菌AP139能有效抑制巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长繁殖，尤其对巴氏杆菌有特别显著的抑制作用，本发明的菌株和制剂能促进动物生长，增强动物免疫机能，特别适合在养殖场进行喷雾消毒，也可以添加到饲料中应用。