环酯肽类抗生素黑莫他丁的高产菌株及其构建方法

摘要

本发明公开了环酯肽类抗生素黑莫他丁的高产菌株及其构建方法。黑莫他丁的高产菌株是将S.himastatinicus sp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此获得himastatin高产突变株S.himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过失活S.himastatinicus sp.Nov的环脂肽类抗生素himastatin的生物合成基因簇上游的Mer家族转录调控基因hmtA和乙酰谷氨酸激酶基因hmtB而分别得到hmtA失活的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB失活的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2015。突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和Ju2015的himastatin的产量是野生型S.himastatinicus sp.Nov的10倍以上。因此，该环脂肽类抗生素himastatin两个高产突变株的成功构建为加速himastatin产业化进程带来了可能与希望。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程和代谢工程领域，具体涉及环酯肽类抗生素黑莫他丁 (himastatin)的高产菌株及其构建方法。

背景技术：

环肽类化合物是一类以酰胺键形成的环状化合物，主要是由氨基酸、糖肽、脂肽和核苷 肽经过一系列修饰后组合而成的复杂分子。该类化合物广泛存在于无脊椎动物(海绵、海鞘、 苔藓虫类等)、细菌、蓝细菌、真菌和放线菌中，多数具有复杂新颖的结构特征，其最突出 的特点是环状结构以及各种氨基酸衍生物结构单元。环状结构赋予该类化合物一定的物理刚 性以及对蛋白水解作用的耐受性，而不同的衍生结构更使得该类化合物具备各种生理生化特 质。因其多数具有出色的生物学性能(抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、免疫抑制活性、抗虫、 抗疟及生理生化调控作用等)，使得该类化合物已经成为了合成化学、药物筛选和开发的重 点关注对象。其中的一些化合物已经成功用于临床疾病的治疗。例如抗真菌作用短杆菌酪肽 A(tyrocidine A)、用于器官移植抗排斥作用的环孢菌素A(cyclosporin A)、对甲氧西林耐 药的金葡菌具有良好活性的万古霉素(Vancomycin)、对甲氧西林耐药金葡菌和万古霉素耐药 肠球菌均具有良好的抗菌活性的达托霉素(daptomycin)等，均是该类化合物用于临床治疗 的成功典范。

但是，其中的一些环肽类化合物由于其水溶性较差、副作用较大或化合物的产量低等原 因而退出了临床试验，但这也间接说明了对这些化合物进行结构改造和优化或提高其产量的 必要性和迫切性。而且由于这些化合物多数具有复杂结构、众多的手性中心及闭环位置的选 择严重制约着对这类化合物进行结构改造的效率或产业化的进程。针对传统的天然产物筛选 和研发手段的局限性，在二十世纪九十年代发展出一种以基因工程和酶学研究为基础的生物 合成技术——组合生物合成(combinatorial biosynthesis)，不仅弥补了传统研究方法的不足， 而且为生物医药领域的进一步拓展提供了新的研究思路和研究方向。而且随着基因组测序技 术和基因重组技术等的飞速发展，组合生物合成已给生物学领域带来了革命性的变化，同时 也给化学学科创造新的化学结构和构建化合物库带来了新的方法和提供了有益的补充。此外， 抗生素的生物合成基因通常在染色体或巨型质粒的一段连续区域成簇排列的特征，(包括结 构基因、自我抵抗基因、转运基因和调控基因)为进一步开发和改造抗生素提供了新的契机。 截至2006年，已有近300种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇得到克隆和功能鉴定，为 利用组合生物合成技术、代谢工程技术和体外酶学技术来创造或改造以得到新的化合物奠定 了基础。已经有诸多研究通过生物合成和组合生物合成技术成功完成了较多结构复杂的天然 产物的结构修饰、改造或某些目标成分的定向积累，构建了一系列活性相当或活性较强的衍 生物，或高产突变株，为链霉菌的基因工程改造提供了有益的方法学的借鉴样本，为解决日 益棘手的病原微生物的耐药问题和肿瘤疾病的治疗带来了新希望。

环脂肽类抗生素黑莫他丁(himastatin)，其结构如图1所示，体外活性分析显示其对革 兰氏阳性菌有较好的抑菌活性，对P388细胞系和褪黑色素瘤B16细胞系有显著的细胞毒活 性。

发明内容：

本发明的目的是提供黑莫他丁(himastatin)高产突变株Streptomyces himastatinicus sp. Nov。

本发明的himastatin高产突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov，其是hmtA基因或者 hmtB基因失活的Streptomyces himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了himastatin高产突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov的构建方法， 其特征在于，是将Streptomyces himastatinicus sp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此 获得himastatin高产突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了hmtA基因或者hmtB基因在调控himastatin产量中的应用，所述的hmtA 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所 示。

本发明的原始菌株Streptomyces himastatinicus sp.Nov是一株陆源链霉菌，分别通过对其 次级代谢产物的生物合成基因簇中的1个MerR家族转录调控基因、1个乙酰谷氨酸激酶基因 的遗传改造得到了2株能高产himastatin的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 和Ju2015。用himastatin的培养基发酵菌株，用乙酸乙酯萃取发酵液，经过HPLC-DAD-UV 的分析其次级代谢产物。以HPLC程序进行程序分析，HPLC分析图谱显示，洗脱时间在17.45 min处并有特征紫外吸收值(λ_max210,285)的流分，该流分应为himastatin。为了确保17.45 min 处并有特征紫外吸收值(λ_max210,285)的流分为himastatin，故采用6L规模的发酵处理，随 后通过HPLC-UV分析得到化合物1的纯品；经核磁共振分析，其1D(¹H,¹³C)NMR光谱学 数据与文献报道的himastatin的图谱完全一致，即确定保留时间17.45 min处的化合物1是抗 生素himastatin(其结构式如图1所示)。

本发明还涉及到Streptomyces himastatinicus sp.Nov的全基因组扫描，和抗生素himastatin 的生物合成基因簇的确认。为了找到抗生素himastatin生物合成的基因簇，我们采用了全基 因组扫描的方法，利用Illumina’s Solexa测序技术，对Streptomyces himastatinicus sp.Nov菌 株的全基因组DNA进行序列测定，基因注释的结果显示一个大小为60 Kb的连续片段可能含 有himastatin生物合成所必需的基因信息，进一步的生物信息学分析揭示20个开放阅读框约 45 Kb大小的DNA序列包含了抗生素himastatin生物合成中的调控、结构、自我抵抗、转运 及后修饰等基因的信息(见图2)。基因簇的序列已经被EMBL数据库收录，序列号FR823394。

本发明涉及到himastatin生物合成基因簇中负责起转录调控作用的基因hmtA(核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白HmtA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，乙酰谷 氨酸激酶基因hmtB(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白HmtB的氨基酸序列如 SEQ ID NO.4所示)，将其单独进行置换突变后可得到高产抗生素himastatin的工程菌株。在 himastatin生物合成基因簇的上游，有个命名为hmtA的基因，它编码一个有247个氨基酸的 多肽，通过生物信息学分析鉴定该肽链属于MerR家族转录调控子。为了验证hmtA和hmtB 基因编码的蛋白质HmtA和HmtB在抗生素himastatin的生物合成中的具体作用，用一个具有 阿普拉霉素抗性的DNA片段分别进行阅读框内取代，使得hmtA和hmtB失活。将突变粘粒 转入到甲基化缺陷的E.coli ET12567/pUZ8002菌株中，与野生型S.himastatinicus sp.Nov菌株 进行种间接合转移，得到一些接合子，分别各选取3个抗性表型(阿普拉耐受，卡那霉素敏 感)和基因型均正确的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014，突变株S.himastatinicus sp.Nov  Ju2015，与野生型S.himastatinicus sp.Nov菌株同时同条件发酵，野生型菌株作为阳性对照。 通过HPLC分析突变菌株ΔhmtA的发酵液乙酸乙酯萃取，结果表明二个突变株克隆子一致的 高产himastatin，该目标产物的产量较野生型菌株高出了10倍以上。这些数据证明了HmtA 和HmtB蛋白在himastatin的生物合成中具有负调控因子的作用。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法 或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第1～744位的DNA作为探针以Southern杂交等方法 从其他生物体中得到与hmtA相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突 变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变， 不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外 线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达 体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包 括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之 后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致 力于得到的性质。

包含DNA片段或基因可以用来构建提高himastatin或其衍生物的产量的突变株，本发明 提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

本发明通过失活S.himastatinicus sp.Nov的环脂肽类抗生素himastatin的生物合成基因簇 上游的Mer家族转录调控基因hmtA和乙酰谷氨酸激酶基因hmtB而分别得到hmtA失活的突 变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB失活的突变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2015。突 变株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和Ju2015的himastatin的产量是野生型S.himastatinicus sp. Nov的10倍以上。因此，该环脂肽类抗生素himastatin两个高产突变株的成功构建为加速 himastatin产业化进程带来了可能与希望。

本发明的黑莫它丁链霉菌Streptomyces himastatinicus sp.Nov，购自于美国模式培养物集 存库(American type culture collection)，编号为：ATCC53653，该菌株对外销售，任何人都可 以从该保藏库购买到。

附图说明：

图1是黑莫它丁(himastatin)的化学结构式。

图2是链霉菌Streptomyces himastatinicus sp.Nov中himastatin生物合成基因簇组织结构图。

图3是hmtA双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的构建示意图，其中 Mutant Ju2014表示突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014；

图4是hmtA双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的PCR验证图，wt表 示野生型Streptomyces himastatinicus sp.Nov，ΔhmtA1、ΔhmtA2、ΔhmtA3表示突变株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的三个克隆子；

图5是hmtB双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的构建示意图，其中 Mutant Ju2015表示突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015；

图6是hmtB双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的PCR验证图，其中 wt表示野生型Streptomyces himastatinicus sp.Nov，ΔhmtB1、ΔhmtB2、ΔhmtB3表示突变株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的三个克隆子；

图7是hmtA双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014与野生型同等条件下分 别发酵后的HPLC分析结果，其中wt表示野生型Streptomyces himastatinicus sp.Nov，ΔhmtA1、 ΔhmtA2、ΔhmtA3表示突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的三个克隆子， ΔhmtA1、ΔhmtA2、ΔhmtA3是稀释10倍后进样后的HPLC结果。

图8是hmtB双交换突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015与野生型同等条件下分 别发酵后的HPLC分析结果，其中wt表示野生型Streptomyces himastatinicus sp.Nov，ΔhmtB1、 ΔhmtB2、ΔhmtB3表示突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的三个克隆子， ΔhmtB1、ΔhmtB2、ΔhmtB3是稀释10倍后进样后的HPLC结果。

图9是活性化合物1的H谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.S.himastatinicus sp.Nov的培养

在本发明的S.himastatinicus sp.Nov野生型菌株和突变菌株生长所使用的培养基，每升是 这样配制的：将鱼粉10g、甘油20g、碳酸钙5g和酵母提取物5g加入1L水中，pH为7.2-7.4 之间，常规灭菌备用。其最适生长的温度是在28℃-30℃。

2.链霉菌S.himastatinicus sp.Nov的次级代谢产物himastatin的分离纯化及结构鉴定

首先，S.himastatinicus sp.Nov菌株在装有50mL步骤1的培养基的250 mL三角瓶中发 酵7天，温度28～30℃，转速200 rpm；然后，发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，上层有机 相50℃减压蒸馏，用1mL甲醇溶解，得到粗提液，进行HPLC分析，根据紫外吸收特征进 行目标化合物的标定(210nm，285nm)。接着利用同样的发酵条件，对S.himastatinicus sp.Nov 进行4L规模发酵。对发酵产物的粗体物进行HPLC分析后进行目标化合物的分离。HPLC分 析所用流动相的组成如下：A相，15％乙腈+85％水+0.1％冰醋酸；B相，20％水+80 ％乙腈+0.1％冰醋酸。HPLC程序为：0～20 min，B相0％～80％梯度洗脱；21～23min，B 相80％～100％梯度洗脱；24～30min，100％B相洗脱。UV检测波长(210 nm，285nm，流速 为1 min/mL。在此程序中，目标化合物1的保留时间大约17.45min。对活性化合物1进行 HR-ESI-MS,1D(¹H,¹³C)NMR(图9)测试，综合分析波谱数据，与文献：JOHN E.LEET， DANIEL R.SCHROEDER，BALA S.KRISHNAN and JAMES A.MATSON,HIMASTATIN,A  NEW ANTITUMOR ANTIBIOTIC FROM STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS

Ⅱ.ISOLATION AND CHARACTERIZATION,THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS,VOL.XLⅢ NO.8,961～966,1990,8.中的himastatin的核磁数据进行对比，进行目标化合物1的确认，鉴定 目标化合物1为himastatin，其结构式如图1所示。

3.含有基因hmtA和hmtB的Cosmid 12H8的筛选

S.himastatinicus sp.Nov基因组文库的构建：以SuperCos I为载体，具体过程参照SuperCos  1 Cosmid Vector Kit的操作手册。操作过程可大致概述如下：从S.himastatinicus sp.Nov菌丝 体中提取基因组DNA，经Sau3AI部分酶解，用牛小肠磷酸酶去磷酸化，然后连接到已被XbaI 和BamHI酶解处理的SuperCos 1载体上，用Packagene Lambda DNA包装系统进行体外包装， 侵染大肠杆菌LE392，在LB+kanamycin(Kan,终浓度50μg/mL)平板上筛选。选取约1920 个克隆子挑选到20块96孔板中，培养12h后，每孔中加入等体积50％的甘油。-80℃保存。

S.himastatinicus sp.Nov的基因组测序交由华大公司完成。根据华大公司提供的序列。为 了找到抗生素himastatin生物合成的基因簇，我们采用了全基因组扫描的方法，利用Illumina’s  Solexa测序技术，对Streptomyces himastatinicus sp.Nov菌株的全基因组DNA进行序列测定， 基因注释的结果显示一个大小为60 Kb的连续片段可能含有himastatin生物合成所必需的基因 信息，进一步的生物信息学分析揭示20个开放阅读框约45 Kb大小的DNA序列包含了抗生 素himastatin生物合成中的调控、结构、自我抵抗、转运及后修饰等基因的信息，推测himastatin 生物合成基因簇的组织结构如图2所示。himastatin基因簇的序列已经被EMBL数据库收录， 序列号FR823394。其中基因簇中的hmtA基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)编码 MerR家族转录调控因子；hmtB基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)编码乙酰谷氨酸 激酶。为了研究hmtA和hmtB基因在himastatin生物合成过程中的功能，我们对其分别进行 基因的敲除。根据PCR-targeting操作要求，为了得到能够对hmtA和hmtB进行敲除的粘粒， 我们在hmtA序列附近设计了两对引物，SAF(5′-CGCAGATCCACGCCGCACTC-3′)，SAR(5′- AGT TCCGCGTGACGGAGGTG-3′)和SBF(5′-CGCCACCTGCTCGTCACCG-3′)，SBR(5′- TCG GCG TAC AGC CAC AGC AG-3′)。两对引物PCR所得目的带分别为622 bp和1679bp。 分别利用这两对引物，从构建的基因组文库中利用PCR技术筛选阳性克隆。PCR程序如下： 95℃5min；95℃45s，58℃45s，72℃90s，30个循环；72℃10min。其中筛选到多个阳性 克隆。我们选定第12块96孔板对应(H，8)位置的阳性克隆，命名为Cosmid 12H8，其含 有完整的hmtA和hmtB基因，进行下一步的hmtA和hmtB基因的敲除。

4.hmtA基因缺失突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的构建

hmtA基因的阅读框内失活是采用了λ-RED介导的PCR-Targeting技术。包含有hmtA基因 的Cosmid 12H8被转化入E.coli BW25113/pIJ790中，命名为E.coli BW25113/pIJ790/12H8。 以已被EcoRI和HindIII酶解过的pIJ773质粒为模板，用与hmtA基因分别具有39bp同源臂 的敲除引物(hmtAdelF:5’-acgctcggcgcgacatacgcccggacccgacgacccgatATTCCGGGGATCCGT  CGAC-3’,hmtAdelR:5’-tagccggtacccgacgtcgatggcctcgagcccgaggagTGTAGGCTGGAGCTGCT  TC-3’下划线部分代表与hmtA基因同源)进行具有Apr抗性的aac(3)IV-oriT抗性片段的PCR 扩增反应。将扩增好的aac(3)IV-oriT抗性片段电转化入E.coli BW25113/pIJ790/12H8感受态 细胞中，通过λ-RED介导的同源重组得到改造后的重组cosmid，命名为重组cosmid pJu201 4。用hmtA基因的PCR验证引物(IDhmtAF:5’-GAACCGATTCCGCCTGACC-3’，IDhmtAR: 3’-ACATCGCCCTCGCCCTCAC-3’)进行扩增反应确定重组cosmid pJu2014的正确性。随后， 重组cosmid pJu2014被转入E.coli ET12567/pUZ8002中，命名为E.coli ET12567/pUZ8002/p  Ju2014，其与野生型菌株S.himastatinicus sp.Nov进行接合转移。

接合转移的过程如下：将野生型S.himastatinicus sp.Nov的孢子在TSB培养液中，28℃ 震荡培养12-18小时，使其孢子萌发；E.coli ET12567/pUZ8002/pJu2014在加有卡那霉素(Kan, 终浓度为50μg/mL)、氨苄青霉素(Amp,终浓度为100μg/mL)、氯霉素(Cml,终浓度为25 μg/mL)和阿伯拉霉素(Apm,终浓度为50μg/mL)的LB培养液中培养至光密度值OD＝0.6， 离心收集细胞，用无菌的LB液体培养基洗涤两次，然后与萌发好的野生型孢子混合，将混 合液平铺在加有10mM MgSO₄的M-ISP₄固体培养基上；在28℃生长23小时后，每个固体培 养基平板上涂布800μL加有三甲氧苄胺嘧啶和阿普拉霉素的抗生素药物的无菌水，其中含甲 氧苄氨嘧啶(Tmp,50 mg/mL)30μL，阿伯拉霉素(Apm,50 mg/mL)30μL；让其在30℃培 养箱下生长4-5天，直到接合子出现即为双交换突变菌株，命名为Streptomyces himastatinicus  sp.Nov Ju2014。该双交换突变菌株通过其对抗生素的抗性表型(Kan^S&Apm^R)及基因型而 被筛选及鉴定出来，其中hmtA基因缺失的PCR验证利用引物(IDhmtAF,IDhmtAR)的进行 PCR扩增反应得到证实。由此得到hmtA被敲除的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov  Ju2014。

hmtB基因缺失突变菌株的构建过程同hmtA基因敲除，但是hmtB的缺失引物如下hmtBdelF: 5’-cttggcgtccggtacgaccgtggtgccggaccgctcgtcATTCCGGGGATCCGTCGAC-3’，hmtBdelR:5’- gaggcgtcgttcgccgacgacgtcgtacggatgcaccggTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’下划线部分代表与 hmtB基因同源。hmtB基因的PCR验证引物为：IDhmtBF:5’-aggctcgtgtcggaggtagt-3’,IDhmtBR: 5’-cggcgggacagaatcttg-3’。由此得到hmtB被敲除的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov  Ju2015。

具体的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的构建示意图如图3所示，突变 株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014的PCR验证图如图4所示。

具体的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的构建示意图如图5所示，突变 株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的PCR验证图如图6所示。

5.野生型菌株与双交换突变菌株hmtA被敲除的突变株Streptomyces himastatinicus sp. Nov Ju2014和hmtB被敲除的突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015的发酵及其 HPLC分析

野生型菌株和双交换突变菌株分别在改良的ISP4(M-ISP4)固体培养基平板上30℃培养 7天，挑取适量孢子接种于装有50mL himastatin步骤1的培养基的三角瓶中，在28℃和200rpm 转速的摇床上培养7天。发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，有机相的萃取液经旋蒸仪蒸干 后溶于1mL甲醇中，12000rpm离心5min后，取上清液进行HPLC分析。HPLC分析结果见 图7和图8。通过突变株和野生型菌株发酵产物的HPLC分析检测及HPLC图谱的积分比值 计算出了himastatin在突变株中产量提高的倍数。从图7和图8可以看出，野生型Streptomyces  himastatinicus sp.Nov、突变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB被敲除的突 变株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015在同等条件下发酵，与野生型比较，突变株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB被敲除的突变株Streptomyces himastatinicus  sp.Nov Ju2015的目标产物himastatin的产量较野生型菌株高出了10倍以上。因此，该环脂 肽类抗生素himastatin两种高产突变株的成功构建为加速抗生素himastatin的产业化进程带来 了可能与希望。

M-ISP4培养基(改良的ISP4液体培养基)：是在ISP4培养基的基础上加入蛋白胨、酵 母提取物和海盐，使终质量分数分别为：0.1％、0.05％、3％。即M-ISP4培养基的配方为： 每升M-ISP4培养基含有：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄1g，MgSO₄.7H₂O 1g，NaCl 1g，(NH₄)₂SO₄2g，CaCO₃2g，FeSO₄.7H₂O 0.001g，MnCl₂.4H₂O 0.001g，ZnSO₄.7H₂O 0.001g、蛋白胨1g、 酵母提取物0.5g、粗海盐30g，余量为水，pH7.0～7.4。固体培养基是在液体培养基的基础上 加入1.5％的琼脂。