湖北海棠中根皮苷的提取方法

摘要

本发明提供了湖北海棠中根皮苷的提取方法，它包括如下操作步骤：取湖北海棠叶或/和嫩枝，加水回流提取三次，第一次加入8～10倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上，第二次加入3～5倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上，第三次加入3～5倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上，合并三次提取液即可。采用本发明方法，仅使用水为溶剂，仍然可以有效对湖北海棠中根皮苷进行提取，为大工业生产提供了便利。

说明书

技术领域

本发明涉及湖北海棠中根皮苷的提取方法。

背景技术

根皮苷最早是从苹果、苹果树皮及叶等提取而得，由根皮素和配糖体为 葡糖苷结合成的黄酮苷类化合物，属于二氢查尔酮苷。目前研究表明，根皮 苷对糖尿病及其并发症的防治有独特效果，同时具有良好抗氧化、抗癌、美 白等作用。

湖北海棠(Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.)，产湖北、湖南、江西、江苏、 浙江、安徽、福建、广东、甘肃、陕西、河南、山西、山东、四川、云南、 贵州。生山坡或山谷丛林中，海拔50-2900米。湖北海棠中含有根皮苷，各 部位含量在0.9～13％不等，其中，湖北海棠嫩枝及叶中含量最高，可以作为 提取根皮苷的来源。

目前未见关于湖北海棠叶及嫩枝中根皮苷工业提取方法的文献报道，仅 在根皮苷含量测定方面见有采用甲醇作为溶剂进行提取，在以苹果等为原料 进行提取时大多采用低浓度乙醇溶液进行提取，未有在工业生产中采用水作 为溶剂进行湖北海棠叶及嫩枝中根皮苷提取的先例。

发明内容

本发明的目的在于提供从湖北海棠中有效提取根皮苷的工业化生产方 法。

具体地，本发明提供了湖北海棠中根皮苷的提取方法，它包括如下操作 步骤：

取湖北海棠叶或/和嫩枝，加水回流提取三次，第一次加入8～10倍量水 在80±2℃回流提取60±5min以上，第二次加入3～5倍量水在80±2℃回流 提取60±5min以上，第三次加入3～5倍量水在80±2℃回流提取60±5min 以上，合并三次提取液即可。

目前对湖北海棠中根皮苷含量的研究表明，湖北海棠枝条中根皮苷含量 较高，又属嫩枝中含量最高，湖北海棠叶中根皮苷含量次之，但又以嫩叶含 量高(方荣，等，湖北海棠中根皮苷含量测定，食品科技，2008年33卷6 期)。为了能够全面利用湖北海棠的植物资源，实现对湖北海棠中根皮苷的有 效提取，在生产操作过程中，通常会连同带叶嫩枝部分同时采收，用于后续 提取。本发明提取工艺中，可将湖北海棠叶和嫩枝同时进行提取，也可以将 湖北海棠叶和嫩枝分开提取。但嫩枝部分采收量较少，因此，若单独使用嫩 枝进行提取，其原料来源有限，因此，可以优选单独用湖北海棠叶进行提取 或湖北海棠叶和嫩枝同时进行提取。

另外，由于湖北海棠老叶和制备的茶叶中，根皮苷含量明显降低，因此， 在根皮苷的实际提取过程中，优选使用湖北海棠嫩叶。

本发明研究发现，对湖北海棠的提取次数、以及每次提取时的溶剂用量、 提取时间等因素，对湖北海棠的提取率有显著影响，为了尽量达到对根皮苷 的完全提取，本发明最终可使用如下提取条件：

进一步地，第一次加入8倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上。

进一步地，第二次加入5倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上。

进一步地，第三次加入3倍量水在80±2℃回流提取60±5min以上。

本发明在提取过程中发现，当提取时间达到60±5min时，根皮苷已基 本提取完全，若提取时间再长，将不利于能耗成本的节约，因此，本发明优 选回流提取时间为60±5min。

叶片体积较大，为了充分利用提取器空间，增加每次投料量，可以将湖 北海棠叶或/和嫩枝切碎或粉碎后再提取。例如，将切碎至(5～15)mm×(5～15) mm的碎片，可以是(10±2)mm×(10±2)mm、(5±2)mm×(5±2)mm、 (7±2)mm×(7±2)mm、(13±2)mm×(13±2)mm、(15±2)mm×(15 ±2)mm。

采用本发明方法，仅使用水为溶剂，仍然可以有效对湖北海棠中根皮苷 进行提取，为大工业生产提供了便利。本生产方法不使用有机溶剂，提高生 产安全性，无污染，无残留，有效降低生产成本，是对湖北海棠进行综合开 发与利用的有效技术手段。

附图说明

图1根皮苷的HPLC图谱

图2湖北海棠的HPLC图谱

图3根皮苷标准曲线

图4温度对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

图5提取时间对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

图6溶剂量对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

图7提取流程图

具体实施方式

实施例1  本发明提取方法

取湖北海棠叶300kg，加水回流提取三次，第一次加入8倍量水在80℃ 回流提取60min，第二次加入5倍量水在80℃回流提取60min，第三次加入 3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例2  本发明提取方法

取湖北海棠叶350kg，加水回流提取三次，第一次加入10倍量水在80 ℃回流提取60min，第二次加入3倍量水在80℃回流提取60min，第三次加 入3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例3  本发明提取方法

取湖北海棠叶400kg，加水回流提取三次，第一次加入9倍量水在80℃ 回流提取60min，第二次加入4倍量水在80℃回流提取60min，第三次加入 3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例4  本发明提取方法

取湖北海棠叶(含嫩枝)250kg，加水回流提取三次，第一次加入8倍 量水在80℃回流提取60min，第二次加入5倍量水在80℃回流提取60min， 第三次加入3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例5  本发明提取方法

取湖北海棠嫩枝(含叶)200kg，加水回流提取三次，第一次加入8倍 量水在80℃回流提取60min，第二次加入5倍量水在80℃回流提取60min， 第三次加入3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例6  本发明提取方法

取湖北海棠嫩枝300kg，加水回流提取三次，第一次加入8倍量水在80 ℃回流提取60min，第二次加入5倍量水在80℃回流提取60min，第三次加 入3倍量水在80℃回流提取60min，合并三次提取液即可。

实施例7  本发明提取方法的工艺考察

一、湖北海棠叶中根皮苷提取溶剂的选择

1实验材料

1.1原料

原料采自湖北省神农架林区海拔1500米左右的高山，经天然产物研究与 利用湖北省重点实验室(三峡大学)汪鋆植教授鉴定为湖北海棠叶。

1.2  仪器

AL204电子分析天平；WF2VV-2100型紫外分光光度计；Waters2690高 效液相色谱仪；自动双重纯水蒸馏器。

1.3  标准品与试剂

根皮苷标准品(Sigma公司)；乙腈(色谱纯,天津科密欧)；甲醇(色谱纯, 天津科密欧)；95％乙醇(分析纯，天津科密欧)；乙酸乙酯(分析纯，天津 科密欧)。

2试验方法

2.1原料的预处理

将采集的湖北海棠鲜叶洗净,置于烘箱中60℃干燥至水分含量低于12％, 切成10mm×10mm左右的碎片备用。

2.2标准曲线的制备

色谱条件色谱柱为YMCPack AQ C18，250mm×4.6mm ID；流动相为25％ 的乙腈-水(体积比)；进样量为10μl,流速为1.0ml/min；柱温为25℃， 检测波长为283nm。

对照品溶液的制备：精密称取对照品根皮苷10mg，置10ml容量瓶中， 用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得每1ml中含对照品1mg,再稀释成各种浓 度，即得。

标准曲线制备准确吸取对照品溶液2、4、6、8、10μl,按色谱条件 测得峰面积,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

2.3湖北海棠叶中根皮苷含量的标定

准确称取湖北海棠叶碎块1g,加入甲醇100ml，于60℃恒温水浴中回流 提取1h,提取结束后置100ml容量瓶中，用甲醇补足至刻度作为检测样本备 用。

准确吸取上述稀释后的提取液10μl注入液相色谱测得相应色谱峰面积， 再依据标准曲线计算湖北海棠叶中根皮苷含量。

2.4湖北海棠叶中根皮苷提取溶剂的选择

准确称取湖北海棠叶碎块1g,依据工业生产的需要选择分别加入蒸馏 水、5％Na₂CO₃水溶液、1％NaOH水溶液、30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液5种 溶剂各100ml，于60℃恒温水浴中回流提取1h,再依据试验2.3中的方法测 定各溶剂提取的湖北海棠叶中根皮苷的含量。

2.5湖北海棠叶中根皮苷提取率的计算

用各种溶剂测得的湖北海棠叶中根皮苷的含量与甲醇标示的湖北海棠叶 中根皮苷的含量的比值即为相应溶剂对湖北海棠叶中根皮苷提取率，公式如 下:

3结果与讨论

3.1根皮苷标准曲线

在实验色谱条件下，湖北海棠叶中待测组分能达到基线分离，根皮苷标 准曲线的回归方程为：Y＝5359183X+119704，R＝0.9998，在2-10mg.mL-1呈 良好的线性关系。

3.2湖北海棠叶中根皮苷的标定含量

依据3.1根皮苷的标准曲线，用测得的峰面积换算得湖北海棠叶中根皮 苷含量为7.48％。

3.3各溶剂对湖北海棠叶中根皮苷的提取率

表1各溶剂对湖北海棠叶中根皮苷的提取率

表1数据显示70％乙醇对根皮苷的提取效果最好，但提取液显墨绿色， 提示溶液中含有大量叶绿素，对后续分离提纯造成困难；5％Na₂CO₃水溶液与 1％NaOH水溶液对根皮苷的溶解度应该大于蒸馏水，但测得的数据明显低于蒸 馏水的提取率，可能与根皮苷在碱液中易于氧化有关，提取生产不应采用； 蒸馏水在加热条件下对根皮苷有良好的溶解度，且价格低廉，安全无毒，是 湖北海棠叶中根皮苷提取的理想溶剂。

二、湖北海棠叶中根皮苷提取工艺的研究

1实验材料

同实验一。

2试验方法

2.1原料的预处理

同实验一。

2.2标准曲线的制备

同实验一。

2.3湖北海棠叶中根皮苷含量的标定

同实验一。

2.4温度对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

准确称取1.0g湖北海棠叶碎块,加入100mL蒸馏水，分别置于30℃、40 ℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃恒温水浴中回流提取180min,抽滤,定容 至100mL后上液相检测并计算提取率。

2.5提取时间对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

准确称取1.0g湖北海棠叶碎块,加入100mL蒸馏水，分别置于90℃恒温 水浴中分别浸提15min、30min、45min、60min、90min、120min，抽滤,定容 至100mL后上液相检测并计算提取率。

2.6溶剂量对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

准确称取1.0g湖北海棠叶碎块,以干叶浸没溶剂体积8倍量开始分别以 10、12、14、16、18倍量加入蒸馏水置于90℃恒温水浴中回流提取180min， 抽滤定容至100mL后上液相检测并计算提取率。

2.7提取因素的正交实验优化

根据前面三个部分的单因素实验，基本确定了每个因素对根皮苷提 取率最有利的大致范围，再选取确定的最佳提取单因素参数及附近参数采用 L4(2³)正交表进行正交实验，以确定根皮苷提取的最佳工艺条件。

表2L4(2³)正交表

3结果与讨论

3.1温度对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

由图4可知，根皮苷在冷水中溶解度较低，在水温升至60℃以后，其溶 解度显著提高，80℃以后提取率不再有显著的提升，在生产工程中80℃热水 可以达到满意的提取率。

3.2提取时间对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

由图5可知，根皮苷在热水中溶解迅速，在60min以后溶液中根皮苷的 含量基本不再变化，已经达到了分配平衡，在生产过程中只需在温度提升至 80℃后回流提取60min即可。

3.3溶剂量对湖北海棠叶中根皮苷提取效率的影响

由图6可知，当溶液刚好完全浸泡原料时，还达不到有效的提取率，只 有当溶剂达到原料的16倍(质量比)以后，才基本将原料中的根皮苷提取完 全，继续增加溶剂，对提取率的增加贡献较小，效费比较低，所以在生产过 程中只需使用16倍量的蒸馏水进行提取即可。

3.4正交优化实验结果

表3正交试验因素分布表

表4试验因素水平分布表

表5正交实验结果分析表

通过对正交实验结果的极差分析，温度对湖北海棠中根皮苷的提取率 的影响最大，其次是提取时间，溶剂倍量的稍微调整对根皮苷的提取率影响 不大，在工业化生产中最宜采用的提取工艺为在80℃的条件下投入16倍量 的溶剂回流提取60min,其提取率可达到94％，与单因素实验结果基本吻合。

三、湖北海棠叶中根皮苷水提取中试工艺研究

1实验材料

1.1原料

同实验一。

1.2仪器

TQ-8型多功能回流提取罐，Waters2690高效液相色谱仪；

1.3标准品与试剂

根皮苷标准品(Sigma公司)；乙腈(色谱纯,天津科密欧)；甲醇(色谱纯, 天津科密欧)；

2方法与结果

2.1原料的预处理

将采集的湖北海棠鲜叶洗净,置于烘箱中60℃干燥至水分含量低于12％ 备用。

2.2湖北海棠叶中根皮苷残留的测定

将提取后的湖北海棠叶置60℃鼓风干燥箱中充分干燥，参照2.3的方法 提取，将提取液浓缩后置10ml容量中，用甲醇稀释至刻度线作为检测样本 备用。

准确吸取上述稀释后的提取液10μl注入液相色谱测得相应色谱峰面积， 再依据标准曲线计算湖北海棠叶中根皮苷的残留含量。

2.3提取次数试验

基于80℃热水对根皮苷的溶解度，本实验采用不增加溶剂的情况下将16 倍量溶剂分次投入提取，TQ-8型多功能提取罐的容积为8m³,有效投料空间 6.4m³,最大湖北海棠叶投料量为700kg,为保证实验一致性，故采取统一每批 次投料量为300kg,其最小浸泡体积为提取前8倍，一次提取后3倍，每次提 取时间为60min，分次研究方法见表6。

表6分次提取溶剂体积分配表

3结果与讨论

3.1提取次数试验结果

表7分次提取湖北海棠叶中根皮苷的残留结果

由实验二知在80℃的条件下一次性投入16倍量的溶剂回流提取60min, 其提取率可达到94％，海棠叶中还残留6％的产品，由于原料昂贵，在生产 过程中应使原料中的残留含量低于0.5％。本实验研究发现，将16倍量溶剂 分开三次提取以后，以8:5:3的溶剂倍量分三次加入提取可有效提高提取产 率，是原料内产品残留降低到0.5％以下，同时使第一次加入的溶剂量减半， 可增大提取罐内一次性投料量，有助于生产效率的提高。