获得人源OPCs的方法和OPCs培养基

摘要

本发明涉及获得人源OPCs的方法和OPCs培养基。本发明将神经干细胞作为分选来源，通过免疫磁珠的方法分离得到人源OPCs，并找到了适合OPCs体外培养和传代的较经济型的培养基，可以在短时间内获得大量的高纯度的人源OPCs，为临床应用提供了新的选择。

说明书

技术领域

本发明涉及获得人源OPCs的方法和OPCs培养基。

背景技术

脑白质损伤、脊髓损伤、多发性硬化等髓鞘相关疾病由于神经元的髓鞘化障碍或脱髓鞘 化，导致了神经元不能正常传递电兴奋，从而导致机体运动等功能失能。由于目前还没有任 何一种药物可以有效地治疗这些髓鞘相关疾病，这给这些疾病的患者及家庭带来了极大的伤 害，这使得有效治疗髓鞘相关疾病成为当今急待解决的社会和医学难题。

不论是髓鞘化障碍还是脱髓鞘病变，其根源都是神经元轴突髓鞘程度减少或丢失，因此 如果能够恢复神经元轴突的髓鞘化程度，使得神经元电流得以稳定快速地传导，理论上这些 疾病就可以被治愈。研究发现，少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs) 是负责中枢神经系统髓鞘化的关键细胞，在中枢神经系统中，OPCs可以分化为少突胶质细 胞(oligodendrocyte，OL)，OL进一步包绕神经元轴突形成完整的髓鞘结构，从而保证神经 元电流的稳定快速传导。髓鞘相关的疾病一方面是因为疾病破坏了已经形成的髓鞘结构；另 一方面更是由于神经系统中OPCs受到了损伤，使得OL失去了源泉。少突胶质细胞减少， 导致脑白质髓鞘化延迟或被破坏，从而使得神经电信号传导异常或者轴突受损，导致神经功 能损伤。

对脱髓鞘病变患者来说，由于内源性OPCs大量丢失，要促进脑中髓鞘的再生，植入外 源成髓鞘细胞是一个有希望的治疗方法。由于OPCs是中枢神经系统中成髓鞘细胞的天然来 源，OPCs移植可能对治疗脱髓鞘病变起到很好的疗效。实验发现，将啮齿类动物的OPCs移 植到新生的啮齿类动物脑内，植入细胞能在宿主脑内广泛迁移、增殖并分化为成熟OL，形成 包绕轴突的髓鞘结构并恢复神经功能，表明外源植入OPCs能发挥与内源OPCs同样的功能， OPCs移植可能是治疗髓鞘损伤疾病的一个新的方向，这对脱髓鞘病变治疗具有积极的意义。

尽管啮齿类动物的OPCs很容易获得，人源OPCs获得却相当困难。依赖于免疫表型， 通过流式细胞术或是免疫磁珠技术从胎儿中枢神经系统组织或是成人脑白质组织中分选可以 得到OPCs。Windrem等从胎儿或是成人脑组织中分离出了A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型的细胞，认 为该细胞即为OPCs，将该细胞移植入先天脱髓鞘的小鼠内，可以形成髓鞘。然而由于人源的 供体组织较少，分离得到的OPCs数量相当有限，且其存在伦理学问题，因此距离临床应用还 非常遥远。另一种可以通过胚胎干细胞或是神经干细胞定向诱导分化获得人源OPCs。美国的 Hans等人研究发现，胚胎干细胞体外可以分化为OPCs，且OPCs移植有助于脊髓损伤的神经 功能恢复，该方法在美国进入了临床I期的治疗研究。但胚胎干细胞的全能性是把双刃剑， 既能分化为各种细胞，也有致瘤的风险，因此该方法获得的OPCs在临床应用上还存在一定的 致瘤风险。神经干细胞是一种成体干细胞，由于成体干细胞分化能力受到限制，在一定程度 上避免了致瘤的风险，临床应用上更为安全。但这两种细胞的诱导过程都需要较长时间及多 种细胞因子的共同作用，这必然导致培养的费用增加，限制细胞的产量。

因此，临床的治疗研究需要一种简单获得且经济培养人源OPCs的方法。神经干细胞体 外有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，且约有16％的细胞表达 A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型，同时由于是成体干细胞又在一定程度上避免了致瘤的风险。神经干 细胞还可以在体外大量扩增，可以说神经干细胞是很好的分选OPCs的来源。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题，提供一种获得人源OPCs的新方法。为此，申请人经过 深入研究，将神经干细胞(不论是低代数还是较高代数)作为分选来源，通过免疫磁珠的方 法分离得到人源OPCs，并找到了适合OPCs体外培养和传代的较经济型的培养基，可以在短 时间内获得大量的高纯度的人源OPCs，为临床应用提供了新的选择。

本发明提供的获得人源OPCs的方法为，将神经干细胞作为分选来源，通过免疫磁珠的 方法分离得到人源OPCs，采用的磁珠为Anti-PSA-NCAM磁珠。

优选地，包括以下步骤：

①神经干细胞在胰蛋白酶溶液中被消化成单个细胞，过筛网；

②离心收集细胞，去上清；

③细胞重悬在磁珠分选缓冲液中，混匀后在2-8℃中温育；

④加入Anti-PSA-NCAM磁珠，混匀后在2-8℃中温育；

⑤加入磁珠分选缓冲液，离心；

⑥离心过程中，将分选柱放入磁珠分离器中，加入磁珠分选缓冲液平衡分选柱；

⑦离心后，完全弃去上清液，重悬于磁珠分选缓冲液，将细胞悬液加入到分选柱内，收 集流出液体，此为未标记的细胞；

⑧加入磁珠分选缓冲液洗分离柱，离心收集细胞；

⑨加入Anti-A2B5磁珠，温育，重复⑤-⑧步骤，此次收集细胞应为柱内集合上的细胞， 缓冲液洗柱后，将分选柱从磁珠分离器内取出放置在离心管内；

⑩加入磁珠分选缓冲液后，立即推压活塞洗脱掉结合上的细胞，离心，收集到的细胞为 A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型的亚细胞群，即为OPCs。

更优选地，各步骤的具体操作方法如下：

①神经干细胞在0.025％胰蛋白酶溶液中被消化成单个细胞，过40μm尼龙筛网以滤除细 胞团块，台酚蓝计算细胞总数；以上“％”是“g/100ml”的惯常简略表示方式，0.025％即 为0.025g/100ml。

②取10⁷细胞，300g离心10分钟收集细胞，去上清；

③10⁷细胞重悬在60μl的磁珠分选缓冲液中，混匀后在2-8℃中温育10分钟；

④加入20μl的Anti-PSA-NCAM磁珠，混匀后在2-8℃中温育15分钟；

⑤加入1ml磁珠分选缓冲液，300g离心10分钟；

⑥离心过程中，将MS分选柱放入磁珠分离器中，加入0.5ml的磁珠分选缓冲液平衡分 选柱；

⑦离心后，完全弃去上清液，重悬于0.5ml的磁珠分选缓冲液，将细胞悬液加入到分选 柱内，收集流出液体，此为未标记的细胞；

⑧加入0.5ml的磁珠分选缓冲液洗分离柱，共三次，离心收集细胞；

⑨加入20μl的Anti-A2B5磁珠，温育，重复上面⑤-⑧的步骤，此次收集细胞应为柱内集 合上的细胞，缓冲液洗柱三次后，将分选柱从磁珠分离器内取出放置在1.5ml的离心管内；

⑩加入1ml磁珠分选缓冲液后，立即推压活塞洗脱掉结合上的细胞，300g离心10分钟， 收集到的细胞为A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型的亚细胞群，即为OPCs。

优选地，利用OPCs培养基对分离得到的人源OPCs进行体外扩增培养，所述培养基由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin组成，Neurobasal A medium、B27和 L-glutamin的体积比为97∶2∶1，bFGF的含量为20-40ng/ml，肝素的含量为5μg/ml。

更优选地，体外扩增培养的具体操作方法为：磁珠分选后得到的细胞按照4×10⁴/cm²密 度接种至培养器皿内，在OPCs培养基中培养，置于37℃、5％CO₂培养箱内，每3-4天，更 换2/3培养基为新鲜OPCs培养基，细胞达到80％-90％的融合度时，传代培养，传代培养的 次数为2-4次。

优选地，所述神经干细胞采用神经干细胞培养基进行体外扩增而得，所述神经干细胞培 养基由DMED/F12、N2、bFGF、EGF、肝素和L-glutamin组成，DMED/F12、N2和L-glutamin 的体积比为98∶1∶1，bFGF的浓度为10-30ng/ml，EGF的浓度为10-30ng/ml。

更优选地，神经干细胞体外扩增的操作步骤如下：

①100g离心5分钟收集神经干细胞；

②将上清转移入离心管内，为旧培养基；

③向收集好的神经干细胞内加入1ml由0.01M dPBS稀释得到的0.025％胰蛋白酶，混匀， 置37℃培养箱孵育5-7min至细胞球松散；

④加入1.2mg/ml胰酶抑制剂100μl，200μl移液器吸管轻轻吹打成单细胞悬液；

⑤加入15ml dPBS，细胞计数，100g离心5min；

⑥弃上清，加入2/3新鲜神经干细胞培养基和1/3旧培养基，以2×10⁶/mL密度接种于 T25ml培养瓶，置细胞培养箱内培养；

⑦每3-4天更换2/3培养基为新鲜培养基，每10天传代一次。

本发明提供的获得人源OPCs的方法也包括利用OPCs培养基对其它方式获得的人源 OPCs进行体外扩增培养，所述培养基由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin 组成，Neurobasal A medium、B27和L-glutamin的体积比为97∶2∶1，bFGF的含量为20-40 ng/ml，肝素的含量为5μg/ml。

优选地，其它方式获得的人源OPCs体外扩增培养的具体操作方法为：人源OPCs按照 4×10⁴/cm²密度接种至培养器皿内，在OPCs培养基中培养，置于37℃、5％CO₂培养箱内， 每3-4天，更换2/3培养基为新鲜OPCS培养基，细胞达到80％-90％的融合度时，传代培养， 传代培养的次数为2-4次。

OPCs培养基也是本发明的保护内容，其由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin组成，Neurobasal A medium、B27和L-glutamin的体积比为97∶2∶1，bFGF的含 量为20-40ng/ml，肝素的含量为5μg/ml。

本发明提供的获得人源OPCs的方法易于操作，可以在短时间内获得大量的高纯度的人 源OPCs，为临床应用提供了新的选择。

附图说明

图1显示为流式分析分选得到的细胞纯度到达85％以上。

图2显示为分选细胞表达了多种特异OPCs标志：A为分选三天后，细胞为典型的双极 或三极形态；B-D分别为免疫荧光染色表明分选细胞表达OPCs特异标志O4、PDGFαR和 Sox10；E为星形胶质细胞标志GFAP阳性细胞；F为神经元标志Tuj-1阳性细胞。比例尺： 50μm(A-E)，100μm(F)。

图3显示为分选得到的OPCs可以体外至少培养四代：显微镜观察第二代到第四代OPCs， 均为典型的双极或三极形态；免疫荧光染色表明各代数OPCs均高表达少突胶质前体细胞标 志O4。比例尺：50μm。

图4显示为分选得到的第四代OPCs免疫荧光染色结果：OPCs高表达少突前体细胞标志 PDGFαR和Sox10、极低表达星形胶质细胞标志GFAP和神经元标志Tuj-1。比例尺：50μm (PDGFαR、Sox10和GFAP)，100μm(Tuj-1)。

图5显示为第一代到第四代OPCs增殖曲线：经过四代的体外扩增，细胞增殖14倍以上。

图6显示为OPCs分化为少突细胞。A：显微镜下观察分化后的细胞形态，细胞呈复杂多 分枝结构；B：免疫荧光染色结果表明分化细胞可以表达多分枝的O4；C：免疫荧光染色结 果表明分化细胞表达Galc。比例尺：25μm。

具体实施方式

下面为本发明的具体的实施方式。

1从神经干细胞中分选获得OPCs

1.1人神经干细胞体外扩增

①100g离心5分钟收集神经干细胞；

②将上清转移入离心管内，为旧培养基；

③向收集好的神经干细胞内加入1ml0.025％胰蛋白酶(0.01M dPBS稀释)，混匀，置37℃ 培养箱孵育5-7min至细胞球松散；

④加入1.2mg/ml胰酶抑制剂100μl，200μl移液器吸管轻轻吹打成单细胞悬液；

⑤加入15ml dPBS，细胞计数，100g离心5min；

⑥弃上清，加入2/3新鲜神经干细胞培养基和1/3旧培养基，以2×10⁶/mL密度接种于 T25ml培养瓶，置细胞培养箱内培养。

⑦每3-4天更换2/3培养基为新鲜培养基，每10天传代一次。

神经干细胞培养基：

1.2使用磁珠从神经干细胞中分选得到人源的OPCs

①神经干细胞在0.025％胰蛋白酶溶液中被消化成单个细胞，过40μm尼龙筛网以滤除细 胞团块，台酚蓝计算细胞总数；

②取10⁷细胞，300g离心10分钟收集细胞，去上清；

③10⁷细胞重悬在60μl的磁珠分选缓冲液中，混匀后在2-8℃中温育10分钟；

④加入20μl的Anti-PSA-NCAM磁珠，混匀后在2-8℃中温育15分钟；

⑤加入1ml磁珠分选缓冲液，300g离心10分钟；

⑥离心过程中，将MS分选柱放入磁珠分离器中，加入0.5ml的磁珠分选缓冲液平衡分 选柱；

⑦离心后，完全弃去上清液，重悬于0.5ml的磁珠分选缓冲液。将细胞悬液加入到分选 柱内，收集流出液体，此为未标记的细胞；

⑧加入0.5ml的磁珠分选缓冲液洗分离柱，共三次，离心收集细胞；

⑨加入Anti-A2B5磁珠，混匀后在2-8℃中温育，重复⑤-⑧步骤，温育后过柱，此次收 集细胞应为柱内集合上的细胞，缓冲液洗柱三次后，将MS分选柱从磁珠分离器内取出放置 在1.5ml的离心管内；

⑩加入1ml磁珠分选缓冲液后，立即推压活塞洗脱掉结合上的细胞，300g离心10分钟， 收集到的细胞为A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型的亚细胞群，即为OPCs。

磁珠分选缓冲液：PBS(pH7.2)+0.5％FBS+2mM EDTA。

通过免疫磁珠的方法，分选出A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型亚细胞群，分选纯度高达85％以上。 该细胞亚群高表达O₄、PDGFαR和Sox10(OPCs的标志)，只有极少数细胞表达GFAP(星形 胶质细胞标志)和Tuj-1(神经元标志)，表明从神经干细胞中可以获得高纯度的较早期的 OPCs。且从不同代数的神经干细胞中，如低代数P2、P5、P8等，较高代数P25、P30等，都 可以使用磁珠分选的方法获得较高纯度的OPCs。

2OPCs的体外扩增培养

临床应用需要大量细胞，因此如果分选得到的细胞可以在体外扩增培养，必将使得过程 更简单，费用更低廉。磁珠分选后得到的细胞按照4×10⁴/cm²密度接种至培养器皿内，在OPCs 培养基中培养，置于37℃、5％CO₂培养箱内。每3-4天，更换2/3培养基为新鲜OPCs培养 基。细胞达到80％-90％的融合度时，传代培养。

每7-10天传代一次，传代时，将细胞用吸管轻轻吹起，加入适量的新鲜培养基，以4×10⁴/cm²密度接种于细胞培养板中，置细胞培养箱内继续扩增培养。同时取部分细胞接种于 PDL/laminin预处理的48孔板中，4天后进行免疫荧光染色。

分选得到的高纯度的OPCs可以在维持初始性状不变的情况下在体外至少传代培养四次。 这四代的细胞都具有双极或是三极的形态，持续高表达O4，第四代细胞高表达Sox10和 PDGFαR，低表达GFAP和Tuj-1，并且绝大多数仍处于早期。

OPCs分选后计数，取1.5×10⁵细胞接种到24孔板内，即为P0。10天后，用200μl移液 器轻轻吹起细胞，计数，即为第一代P1。连续检测4代，绘制出OPCs的增殖曲线。从增殖 曲线可以看出，细胞处于对数生长期，具有较强的增殖能力，经过四代的培养，OPCs数量上 可以增殖到14倍以上。

OPCs培养基：

通常人源OPCs体外长期培养都需要三种到四种细胞因子的联合应用，而发明者所使用 的该OPCs培养基只含有一种细胞因子——bFGF，大大的降低了培养的成本，为大规模临床 应用提供了可能。

3OPCs的体外诱导分化能力

为了确定分选的细胞是否具有分化能力，将其接种到PDL-Laminin包被过的孔板中，在 OPCs分化培养基中培养。经过14天的培养，部分细胞突触形成了较长的、树枝状的多分枝 复杂网状形态，大部分处于非成熟少突胶质细胞阶段，且可以被多分枝的O4和Galc所识别。 表明通过分选得到的OPCs具有分化为少突细胞的能力。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下实施例所用试剂或仪器的生产公司和货号如下 表所示，未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

产品名称 公司 货号 DMED/F12 Gibco C11330500BT Neurobasal-A medium Gibco 10888-022 N2 supplement Gibco 17502-048 B27 supplement Gibco 17504-044

Recombinant human FGF-basic PeproTech AF-100-18B Recombinant human EGF PeproTech AF-100-15 MS-Column Miltenyi Biotec 130-091-506 Cell strainer BD Falcon 352340 laminin Invitrogen 23017-015 OPCDM ScienCell 1631 Poly-D-lysine hydrobromide Sigma p6407 EDTA disodium salt dehydrate Amresco 6381-92-6 L-glutamine Gibco 35050-061 胰酶抑制剂 Sigma T6522 0.25％胰酶 Gibco 15050-065 肝素 Sigma H3149 mouse anti-Sox10 R&D MAB2864 mouse anti-O4 antibody R&D MAB1326 Anti-A2B5 antibodies Miltenyi Biotec 130-093-581 Anti-A2B5 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-093-388 Anti-PSA-NCAM antibodies Miltenyi Biotec 130-093-273 Anti-PSA-NCAM MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-966 rabbit anti-PDGFαR antibody Cell Signaling 5241 rabbit anti-Galc Millipore AB142 mouse anti-Tuj-1 Abcam ab7751 rabbit anti-GFAP Invitrogen 18-0063 Alexa Fluor 488-AffiniPure Jackson 111-545-042 Alexa Fluor 594-AffiniPure Jackson 111-585-144

实施例1：从第三代人神经干细胞中分选人源OPCs

1第三代神经干细胞消化成单细胞

①100g离心5分钟收集神经干细胞，弃上清；

②加入1ml0.025％胰蛋白酶(0.01M dPBS稀释)，混匀，置37℃培养箱孵育5-7min至细 胞球松散；

③加入1.2mg/ml胰酶抑制剂100μl，200μl移液器吸管轻轻吹打成单细胞悬液；

神经干细胞培养基：

2使用磁珠从人神经干细胞中分选OPCs

①神经干细胞单细胞悬液，过40μm尼龙筛网以滤除细胞团块，台酚蓝计算细胞总数；

②取10⁷细胞，300g离心10分钟收集细胞，去上清；

③重悬在60μl的磁珠分选缓冲液中，混匀后在4℃中温育10分钟；

④加入20μl的Anti-PSA-NCAM磁珠，混匀后在4℃中温育15分钟；

⑤加入1ml磁珠分选缓冲液，300g离心10分钟；

⑥离心过程中，将MS分选柱放入磁珠分离器中，加入0.5ml的磁珠分选缓冲液平衡分 选柱；

⑦离心后，完全弃去上清液，重悬于0.5ml的磁珠分选缓冲液。将细胞悬液加入到分选 柱内，收集流出液体，此为未标记的细胞；

⑧加入0.5ml的磁珠分选缓冲液洗分离柱，共三次，离心收集细胞；

⑨加入Anti-A2B5磁珠，混匀后在2-8℃中温育，重复⑤-⑧步骤，此次收集细胞应为柱 内集合上的细胞，缓冲液洗柱三次后，将MS分选柱从磁珠分离器内取出放置在1.5ml的离 心管内；

⑩加入1ml磁珠分选缓冲液后，立即推压活塞洗脱掉结合上的细胞，300g离心10分钟， 收集到的细胞为A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型的亚细胞群，即为OPCs。

磁珠分选缓冲液：PBS(pH7.2)+0.5％FBS+2mM EDTA。

分选出的细胞检测A₂B₅⁺PSA-NCAM^-表型亚细胞群纯度，流式结果表明分选纯度高达85％ (图1)以上。

同时取部分细胞接种于PDL/laminin预处理的48孔板中，4天后进行免疫荧光染色。

①将孔板中的细胞用4％多聚甲醛室温固定15min，PBS漂洗3×10min；

②封闭液室温封闭60min，吸去封闭液，PBS漂洗3×10min；

③加入稀释液配制的一抗，4℃湿盒中孵育过夜；PBS漂洗3×10min；

④加入配制好的二抗，避光，室温孵育45min，PBS漂洗3×10min；

⑤荧光显微镜下观察拍照。

该细胞亚群高表达O₄、PDGFαR和Sox10(OPCs的标志)，只有极少数细胞表达GFAP(星 形胶质细胞标志)和Tuj-1(神经元标志)，表明从神经干细胞中可以获得高纯度的较早期的 OPCs(图2)。

3OPCs的体外扩增能力及分化能力检测

①OPCs的体外培养及传代扩增

磁珠分选后得到的细胞按照4×10⁴/cm²密度接种至培养器皿内，在OPCs培养基中培养， 置于37℃、5％CO2培养箱内。每3-4天，更换2/3培养基为新鲜OPCs培养基。细胞达到 80％-90％的融合度时，传代培养。

每7-10天传代一次，传代时，将细胞用吸管轻轻吹起，加入适量的新鲜培养基，以4×10⁴/cm²密度接种于细胞培养板中，置细胞培养箱内继续扩增培养。同时取部分细胞接种于 PDL/laminin预处理的48孔板中，4天后进行免疫荧光染色。

分选得到的高纯度的OPCs可以在维持初始性状不变的情况下在体外至少传代培养四次。 这四代的细胞都具有双极或是三极的形态，持续高表达O4(图3)第四代细胞高表达Sox10 和PDGFαR，低表达GFAP和Tuj-1，并且绝大多数仍处于早期(图4)。

OPCs分选后计数，取1.5×10⁵细胞接种到24孔板内，即为P0。10天后，用200μl移液 器轻轻吹起细胞，计数，即为第一代P1。连续检测4代，绘制出OPCs的增殖曲线。从增殖 曲线可以看出，细胞处于对数生长期，具有较强的增殖能力，经过四代的培养，OPCs数量上 可以增殖到14倍以上(图5)。

OPCs培养基：

②OPCs的诱导分化

OPCs传代时，取部分细胞，计数，以1×10⁵/孔接种于PDL/laminin预处理的24孔板中。 待细胞贴壁后，加入OPCs分化培养基，每2-3天，更换2/3培养基为新鲜OPC分化培养基。 14天后收集细胞进行免疫荧光染色观察。部分细胞突触形成了较长的、树枝状的多分枝复杂 网状形态，大部分处于非成熟少突胶质细胞阶段，且可以被多分枝的O4和Galc所识别(图 6)。表明通过分选得到的OPCs具有分化为少突细胞的能力。

实施例2：从第三十代人神经干细胞中分选人源OPCs

1第三十代神经干细胞消化成单细胞(方法同实施例1)

2使用磁珠从人神经干细胞中分选OPCs(方法同实施例1)

3OPCs的体外扩增能力及分化能力检测(方法同实施例1)

显微镜下观察发现从P30的神经干细胞中分选的OPCs也都具有典型的双极或是三极形 态，且高表达OPCs特异标志O4、PDGFαR和Sox10，只有极少数细胞表达星形胶质细胞标 志GFAP和神经元标志Tuj-1，诱导后部分细胞突触形成了较长的、树枝状的多分枝复杂网状 形态，且可以被多分枝的O4和Galc所识别。