一种优化百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法

摘要

本发明公开了一种优化百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法，为采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理大花蕙兰类原球茎以提高其保存效果，具体包括：预培养、装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L石墨烯量子点。本发明中公开的方法对百子莲胚性愈伤组织的保存效果优化显著，通过添加石墨烯量子点作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种优化百子莲胚性愈伤组织玻璃化 超低温保存效果的方法。

背景技术

超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮 中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学 状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方 式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成 的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态， 并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛， 保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首 选方法。

百子莲别名蓝百合、非洲百合，为百子莲科百子莲属多年生植物，原产于非洲南部。因 其植株挺拔，叶形秀美、叶色浓绿，花量大、色彩鲜艳而备受人们的喜爱，在国外已成为 常见的观赏花卉，多用于庭院栽培和切花生产；此外，百子莲还具有固沙护坡的生态作用 以及镇痛等药用。我国引入百子莲的时间不长(2000年)，且在上海的结实率低，多依赖 于国外进口种子繁殖，因此，通过体细胞胚胎发生的离体快速繁殖和百子莲种质资源的保 存对百子莲优质种苗的需求至关重要。相关研究建立了百子莲胚性愈伤组织超低温保存体 系，保存后细胞的相对存活率达到了56.94％，但仍不足以满足生产与科研的需求。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的优化百子莲胚性愈伤 组织玻璃化超低温保存效果的方法，以克服现有技术中植物及其组织中长期保存难以实现， 以及超低温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

一种优化百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法，采用玻璃化超低温保存 的方法对百子莲胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下：

1)预培养：将百子莲胚性愈伤组织置于预培养基上，在0～10℃下预培养1～4天；

2)装载液处理：室温下，将百子莲胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40～60分钟后移 除装载液；

3)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百子莲胚性愈伤组织 40～60分钟；

4)液氮保存：保持百子莲胚性愈伤组织被玻璃化溶液浸泡的状态，并将其置于液氮中

保存；

所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L石墨烯量子点的玻璃化冷冻保护液。

本发明中所述MS培养液含有1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄， 370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，37.3mg/L Na₂-EDTA，27.8mg/L  FeSO₄·7H₂O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺 素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/L  ZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L  CoCl₂·6H₂O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。

优选地，所述预培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基。

优选地，所述预培养基为含有0.5mol/L蔗糖的MS固体培养基。

优选地，所述MS固体培养基含有1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L  KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，37.3mg/L Na₂-EDTA，27.8mg/L  FeSO₄·7H₂O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素， 2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O， 0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，30g/L蔗糖， 10g/L琼脂粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5.8。

优选地，上述步骤1)中所述百子莲胚性愈伤组织为在预培养基上培养的方法为：将百 子莲胚性愈伤组织在4℃下置于预培养基上1～4天。

优选地，上述步骤1)中所述百子莲胚性愈伤组织为在预培养基上培养的方法为：将百 子莲胚性愈伤组织在4℃下置于预培养基上2天。

优选地，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇、0.3～0.5mol/L蔗糖和5～10mmol/L KNO₃的MS培养液。

优选地，所述装载液为含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖和10mmol/L KNO₃的MS培 养液。

优选地，上述步骤2)中，室温下，将百子莲胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理60分 钟后移除装载液；

优选地，上述步骤3)中，在0℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百子莲胚性愈伤组 织40分钟。

优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、 0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L石墨烯量子点的MS培养液。

优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、 0.4mol/L蔗糖和0.1～0.3g/L石墨烯量子点的MS培养液。

更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、 0.4mol/L蔗糖和0.1g/L石墨烯量子点的MS培养液；或所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三 醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.3g/L石墨烯量子点的MS培养 液。

一种百子莲胚性愈伤组织的解冻及再培养方法，所述百子莲胚性愈伤组织为采用如上 述所述方法保存的百子莲胚性愈伤组织，所述百子莲胚性愈伤组织的解冻及再培养方法为 将百子莲胚性愈伤组织从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤， 最后转入恢复培养基中恢复培养。

优选地，水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s。

更优选地，水浴解冻的条件为在40℃的水浴中解冻90s。

更优选地，水浴解冻时采用摇动加速解冻方案。

优选地，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖和5～10mmol/L KNO₃的MS培养液。

优选地，所述洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖和10mmol/L KNO₃的MS培养液，洗涤工艺 为：用洗涤液在室温下将百子莲胚性愈伤组织浸泡10～30分钟。

更优选地，所述洗涤工艺为：用洗涤液在室温下处理30分钟，每隔10分钟更换一次 洗涤液。

优选地，所述恢复培养基为含有1.0～3.0mg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培养基。

优选地，所述恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培养基。

本发明中公开的方法适合现有技术中所有百子莲胚性愈伤组织。优选地，所述百子莲 胚性愈伤组织的制备方法参考文献：蓝百合快速繁殖技术的研究，范现丽，上海交通大学 硕士学位论文，2009。

更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、 0.4mol/L蔗糖和0.3g/L石墨烯量子点的MS培养液。

更优选地，采用相对成活率来统计，具体地，在恢复培养30天后利用氯化三苯四氮唑 (缩写为TTC)法统计百子莲胚性愈伤组织相对成活率，并辅以荧光素二乙酸酯(缩写为 FDA)染色法观察。

根据纳米科学原理，向冷冻保护剂中添加纳米材料能够有效提高冷冻保护剂的粘度和 热导率，改变冰晶的形成状况、减少对细胞的伤害。本发明对百子莲胚性愈伤组织在玻璃 化超低温条件下保存，先进行预培养，然后依次用装载液、玻璃化溶液处理，其中玻璃化 溶液又为添加了石墨烯量子点的玻璃化溶液，这种外源物质的添加配合方法中的其他工艺， 能够有效的提高百子莲胚性愈伤组织的保存效果。按照本发明公开的保存方法，采用浓度 为0.1～0.5g/L的石墨烯量子点作为外源物质使用时，百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保 存后的恢复生长率显著提高，本发明中公开的方法对百子莲胚性愈伤组织的保存效果优化 显著，通过添加石墨烯量子点作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。

附图说明

图1为实验组和对照组中百子莲胚性愈伤组织超低温保存恢复生长的FDA染色照片。 FDA能够进入活细胞原生质体内产生荧光，可以作为判断细胞死活的标志。

图1中由左到右分别为对照组超低温保存后的百子莲胚性愈伤组织、实验组组1超低 温保存后的百子莲胚性愈伤组织、实验组组2超低温保存后的百子莲胚性愈伤组织、实验 组组3超低温保存后的百子莲胚性愈伤组织。如图1所示，亮度越大表示荧光强度越强， 细胞活力越高。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

本发明实施例中所用的百子莲胚性愈伤组织由花梗诱导，具体方法参照《蓝百合快速繁 殖技术的研究》范现丽，上海交通大学硕士学位论文，2009。

本发明实施例中实验试剂的配方如下：

1)MS培养液为：MS培养液含有1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄， 370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，37.3mg/L Na₂-EDTA，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O， 100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L  Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水，所述MS 培养液的pH为5.8。

2)MS固体培养基为：MS固体培养基含有1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L  KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，37.3mg/L Na₂-EDTA，27.8mg/L  FeSO₄·7H₂O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素， 2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/L  ZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O， 30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5.8。

3)预培养基为含有0.7mol/L蔗糖的MS培养基。

4)装载液为：含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖和10mmol/L KNO₃的MS培养液。

5)玻璃化溶液为：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗 糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。

6)洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖和10mmol/L KNO₃的MS培养液。

7)恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定和30g/L蔗糖的MS培养基。

实施例

1)将继代培养20天的百子莲胚性愈伤组织在含有0.5mol/L蔗糖的MS固体培养基上在 4℃下低温预培养2天；

2)转至装载液中室温浸泡处理60分钟；

3)转入玻璃化溶液中在0℃条件下脱水处理40分钟；

4)最后置于液氮中超低温保存。

步骤3)结束后，无需除去玻璃化溶液，直接将浸泡于玻璃化溶液中的百子莲胚性愈伤 组织置于液氮中超低温保存。

按照上述步骤将百子莲胚性愈伤组织分为实验组和对照组。

其中，实验组的玻璃化溶液中含有0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L的石墨烯量子点。

具体地，实验组组1的玻璃化溶液中含有0.1g/L的石墨烯量子点；实验组组2的玻璃 化溶液中含有0.3g/L的石墨烯量子点；实验组组3的玻璃化溶液中含有0.5g/L的石墨烯量 子点；对照组中不同之处在于玻璃化溶液不含有石墨烯量子点，其他与实验组相同。

在液氮中保存1小时后取出，快速放入40℃水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动； 将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理30min，每隔10min换一次洗涤液；洗涤后的百 子莲胚性愈伤组织移到恢复培养基培养30天后，计算并比较实验组和对照组内百子莲胚性 愈伤组织的相对成活率率。

实验组与对照组的百子莲胚性愈伤组织的相对成活率见表1。

表1

实验结果

由表1可知，采用含有0.1g/L、0.3g/L和0.5g/L的石墨烯量子点的百子莲胚性愈伤组织 超低温保存的玻璃化溶液，使百子莲胚性愈伤组织相对成活率由53.42％提高到68.34％、 72.34％和60.87％。其中，以含有0.3g/L石墨烯量子点效果最好，具体效果见图1。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术 的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切 等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。