一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法。该方法包括如下步骤：(1)外植体消毒；(2)诱导培养；(3)增殖培养；(4)生根壮苗培养；(5)炼苗移栽。本发明采用高盆樱桃(原变种)茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良母本进行取材，快速获得大量高度一致同时具有优良表型的群体；而且由于组织培养不受季节限制，并且能保持通过有性繁殖不能保持的优良性状，能够满足园林绿化对其需求量的要求，为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及的是一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法。 

背景技术

高盆樱桃(原变种)(Cerasus cerasoides var.cerasoides)为蔷薇科樱属(Cerasus)落叶乔木，高达3－10米。高盆樱桃作为野生樱花资源中极为特殊的一个类群，是樱属植物中惟一在冬季开花的原始种类，花期一般从11月～翌年1月，几乎没有任何观赏树木的自然花期与之重叠，团簇花相，花感强烈，其叶初发时为紫红色，舒展成熟后呈黄绿色，秋季又逐渐变为黄色，是一种典型的具有明显季相变化的春色叶和秋色叶树种。其果实由于成熟先后时间不同，呈现出五彩斑斓的色彩。高盆樱桃无论从花期、叶色、果实方面，都具有很高的观赏价值，是极具应用潜力的优良园林观赏树种，自然花期填补了大自然深冬无花盛开的空白期，这为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。 

高盆樱桃(原变种)广泛分布于中国云南、西藏等地，尼泊尔、日本、缅甸也有分布，其中以云南为现代分布中心，天然分布范围为北纬2l°43’～26°，东经96°12’～104°41’，生于沟谷密林中，海拔1300-2200米。高盆樱桃系阳性树，喜温暖湿润气候，适宜生长区气候条件是年均气温13.2—20.9℃，最冷月(1月)均温>14.6℃，且≥10℃，积温应在3750℃以上，年降水量>609mm。花期繁盛程度与平均温度和光照相关，平均温度高则开花率高，高盆樱桃(原变种)虽能忍耐荫庇环境，但在其生长发育时期则需要充足的光照，阳光充足时，生长快且花繁而艳，反之则生长不良，花朵稀少。它对土质不甚选择，以排水良好的肥沃的沙质酸性土壤为佳，不耐积水。 

高盆樱桃(原变种)种子具有寿命短、含水量大、油脂含量高、易失水，不易贮藏的特点，采取随采随播的方法、但出苗率不高，由于种子产量低而不稳定，尚不能满足其园林绿化的需求。而且高盆樱桃(原变种)自然生长耗时长、成型慢、采种困难，良种少，优质种苗产量低，在一定程度上限制了栽培面积的扩大。因此，通过无性繁殖的手段提高高盆樱桃的产量和质量显得比较重要，但高盆樱桃的扦插、嫁接的存活率一般仅为30％-50％，因而其无性繁殖也受到一定限制。而组织培养结合相关生物技术，如基因工程、花药培养和原生质融合等，在植物种质资源创新和品种选育等方面的作用日益突出。近20年来，植物组织培养研究取得了很大的进展，尤其是脱毒技术和快速繁殖，其应用已涉及到观赏植物、果树、农作物、林木、药用植物及工业原料植物等的繁殖。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法。 

本发明的技术方案如下： 

一种高盆樱桃(原变种)茎段组织培养获得再生植株的方法，其步骤如下： 

(1)外植体消毒 

在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃(原变种)新稍，装入塑料袋中，带回室内，稍作修剪，用2.0g/l洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm；将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h；吸干外植体表面的水分，再用0.2％(W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒；在超净工作台下用体积百分浓度为75％的酒精消毒10-20s后，再用0.1％(W/V)的升汞浸泡4-6min，然后在无菌条件下用无菌水清洗4-6次，用无菌纱布吸干备用； 

(2)诱导培养 

从(1)中处理后的小枝条上截取2.5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培养基中，先置于黑暗培养箱中培养72-120h，再置于光照培养箱中培养，12d～15d即有芽开始膨大萌动，40d～45d即长出丛生芽； 

(3)增殖培养 

将诱导产生的丛生芽分株，每株约含3个芽，接种到增殖培养基上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； 

(4)生根壮苗培养 

在(3)中培养后的丛生芽中，剪取3-5cm带顶芽的材料，接种到生根培养基，置于光照培养箱中培养25d～30d后，获得生长健壮且具有效根的幼苗； 

(5)炼苗移栽 

将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出(避免伤根)栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体积比为1:1，28d～30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。 

所述的诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.6-1.0mg·L^-1+IBA0.04-0.08mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1。 

所述的增殖培养基为MS基本培养基+6-BA0.5-0.8mg·L^-1+IBA0.02-0.04mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1。 

所述的生根培养基为1/2MS基本培养基+IBA0.05-0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1。 

所述的方法，步骤(4)中，所述光照培养箱的温度为20-25℃，光照强度为1500-2000Lx，光照时间为12-15h/d。 

本发明采用高盆樱桃(原变种)茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良母本进行取材，快速获得大量高度一致同时具有优良表型的群体；而且由于组织培养不受季节限制，并且能保持通过有性繁殖不能保持的优良性状，能够满足园林绿化对其需求量的要求，为提高户外园林景观的周年观赏价值具有极其重要的意义。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 

1、主要试剂及药品 

植物生长调节剂6-BA、IBA均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基本培养基配方中所有试剂、蔗糖、琼脂粉、以及消毒试剂等均为国产分析纯。 

2、仪器设备 

(1)高压灭菌锅：主要用于植物组织培养操作中的培养基及其它多种需要无菌用品的灭菌。高压灭菌时，要求的最低压力为1.06kg/cm²，温度为121℃，灭菌时间为20min。 

(2)超净工作台：超净工作台又称净化工作台，主要用于培养材料的接种等无菌操作过程。由于它具有机动的滤菌装置，可以在工作人员与操作对象之间形成风幕，使工作台面处于基本无菌的状态。在使用超净工作台前应先用70％的酒精棉将台面及周围擦净，再用紫外灯照射30min左右对台面进行灭菌，同时启动风机把贮存于机体内的含菌空气排出。经常使用的超净工作台每隔半年左右要把滤料清洗一次，否则会因滤料附着太多的灰尘而影响正常的工作。滤料清洗后，超净工作台必须启动一个小时后才能进行正常的无菌操作。由于从超净工作台中吹出的空气也不是绝对无菌的，因此操作时要借助于酒精灯进行无菌操作，否则难以达到完全无菌的效果。本实施例所用的超净工作台型号为苏州安泰空气技术有限公司生产的SW-CJ-ZFD。 

(3)智能人工气候箱：具有光照、加湿功能的高精度冷热恒温设备。主要用于植物材料的恒温培养、光照培养以及用于愈伤组织分化和植株再生过程的培养。气候箱的温度变化范围为5-50℃(无光照)、10℃-50℃(有光照)，组织培养时的使用温度常为20-30℃。气候箱内通常有四层活动的金属网格，每层网格都可以放满培养瓶，但上下层培养物之间必须保留一定的空隙，以保证箱内空气的流动和温度的恒定。本实施例所用的是宁波江南仪器厂制造的RXZ型智能人工气候箱。 

除了上述仪器设备以外，还用到电子天平、电炉、冰箱、容量瓶、烧杯、玻璃棒、 移液管、洗耳球、量筒、酒精灯、试管、组培瓶、解剖刀、镊子、封口膜等。 

实施例1 

(1)外植体消毒 

在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃(原变种)新稍，装入塑料袋中，带回室内，稍作修剪，用2.0g/l洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的水分，再用0.2％(W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒。在超净工作台下用75％(V/V)的酒精消毒10s后，再用0.1％(W/V)的升汞浸泡6min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。 

(2)诱导培养 

从(1)中处理后的小枝条上截取2.5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培养基(诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，15d即有芽开始膨大萌动，45d长出丛生芽； 

(3)增殖培养 

将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基(增殖培养基为MS基本培养基+6-BA0.5mg·L^-1+IBA0.02mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； 

(4)生根壮苗培养 

在(3)中培养后的丛生芽中，剪取4cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根培养基为1/2MS基本培养基+IBA0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)，置于培养箱温度为20℃、光照强度为1500lx光照培养箱中培养30d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且具有效根的幼苗； 

(5)炼苗移栽 

将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接 着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出(避免伤根)栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体积比为1:1，30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。 

实施例2 

(1)外植体消毒 

在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃(原变种)新稍，装入塑料袋中，带回室内，稍作修剪，用2.0g/l洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的水分，再用0.2％(W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒。在超净工作台下用75％(V/V)的酒精消毒15s后，再用0.1％(W/V)的升汞浸泡5min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。 

(2)诱导培养 

从(1)中处理后的小枝条上截取2.5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培养基(诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.08mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，15d即有芽开始膨大萌动，40d长出丛生芽； 

(3)增殖培养 

将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基(增殖培养基为MS基本培养基+6-BA0.8mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； 

(4)生根壮苗培养 

在(3)中培养后的丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根培养基为1/2MS基本培养基+IBA0.08mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)，置于培养箱温度为20℃、光照强度为1500lx光照培养箱中培养30d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且具有效根的幼苗； 

(5)炼苗移栽 

将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出(避免伤根)栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体积比为1:1，28d后长出新的嫩芽，幼苗成活。 

实施例3 

(1)外植体消毒 

在天气晴朗的下午，取林间半木质化高盆樱桃(原变种)新稍，装入塑料袋中，带回室内，稍作修剪，用2.0g/l洗衣粉溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm。将小枝条置于烧杯中，流水冲洗3h。吸干外植体表面的水分，再用0.2％(W/V)的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒。在超净工作台下用75％(V/V)的酒精消毒20s后，再用0.1％(W/V)的升汞浸泡4min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用。 

(2)诱导培养 

从(1)中处理后的小枝条上截取2.5cm的茎段，每个茎段带一个芽点，接入诱导培养基(诱导培养基为MS基本培养基+6-BA1.0mg·L^-1+IBA0.06mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)中，先置于黑暗培养箱中培养100h，再置于光照培养箱中培养，12d即有芽开始膨大萌动，40d长出丛生芽； 

(3)增殖培养 

将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基(增殖培养基为MS基本培养基+6-BA0.8mg·L^-1+IBA0.02mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； 

(4)生根壮苗培养 

在(3)中培养后的丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根培养基为1/2MS基本培养基+IBA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1)，置于培养箱温度为20℃、光照强度为1500lx光照培养箱中培养25d，每天光照时间为13h，获得生长健壮且具有效根的幼苗； 

(5)炼苗移栽 

将已经生根的幼苗置于自然光下闭瓶培养10d，然后解开封口膜绳子炼苗5d，接着打开封口膜炼苗7d，再将幼苗小心取出(避免伤根)栽种，栽种基质是泥炭和红壤，其体积比为1:1，30d后长出新的嫩芽，幼苗成活。 

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。