miRNA在心肌纤维化疾病治疗中的应用

摘要

本发明的目的在于提供一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，所述miRNA序列为SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5或SEQID6。尤其是将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA-19b混合应用，即将人源miRNA-19b序列SEQ ID1或SEQ ID2，与非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种或多种进行混合，对于在治疗心肌纤维化疾病中的应用，取得了显著的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及miRNA、miRNA的前体RNA、miRNA反义寡核苷酸序列 及其表达载体，及其在诊断和治疗心肌纤维化疾病中的应用。

背景技术

心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我国居 民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，并且每年另有数以万计 的人因患该病导致残疾。该病种类繁多、病因复杂。其中，由中、重度的冠状动脉粥样硬化 性狭窄所引起心肌纤维持续性和/或反复加重的缺血缺氧将导致心肌纤维化疾病。在该疾病的 早期，左心室舒张功能受损。任其发展将由于心室重塑致心肌正常结构丧失，最终使心室收 缩功能也受损，从而导致心功能不全。心肌纤维化疾病发展过程中，心肌组织结构中胶原纤 维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。这种病理变化在多种心血 管疾病中存在，现认为心肌纤维化与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关[Jessup  M and Brozena S：Heart fai lure.N Engl J Med2003；348：2007-2018；Swynghedauw B： Molecular mechanisms of myocardial remodeling.Physiol Rev1999；79：215-262.]。

细胞外基质蛋白(ECM)在心肌组织内的积累是心肌纤维化的主要特征，而结缔组织生长 因子(CTGF)已被确定为ECM的强力诱导因子[Koitabashi N，et al：Increased connective  tissue growth factor relative to brain natriuretic peptide as a determinant of  myocardial fibrosis.[J]Hypertension2007；49：1120-1127；Tsoutsman T，et al： CCN2plays a key role in extracellular matrix gene expression in severe hypertrophic  cardiomyopathy and heart failure.[J]J Mol Cell Cardiol.2013；62C：164-178；Chen  MM，et al：CTGF expression is induced by TGF-beta in cardiac fibroblasts and cardiac  myocytes：a potentiai role in heart fibrosis.[J]J Mol Cell Cardiol2000；32： 1805-1819.]。多项研究结果表明，心脏衰竭过程中，CTGF积极参与了血管紧张素II(Ang II) 诱导的心肌纤维化进程。因此，CTGF的表达在心肌纤维化所导致的多种心血管疾病中起及其 重要作用[Finckenberg P，et al：Angiotensin II induces connective tissue growth  factor gene expression via calcineurin-dependent pathways.[J]Am J Pathol2003； 163：355-366；Ahmed MS，et al：Connective tissue growth factor--a novel mediator  of angiotens in II-stimulated cardiac fibroblast activation in heart failure in rats. [J]J Mol Cell Cardiol2004；36：393-404；Sopel MJ，et al：Treatment with activated  protein C(aPC)is protective during the development of myocardial fibrosis：an  angiotensin II infusion model in mice.[J]PloS one2012；7：e45663；Matsui Y and  Sadoshima J：Rapid upregulation of CTGF in cardiac myocytes by hypertrophic stimuli： implication for cardiac fibrosis and hypertrophy.[J]J Mol Cell Cardiol2004；37： 477-481；He Z，et al：Differentiai regulation of angiotensin II-induced expression  of connective tissue growth factor by protein kinase C isoforms in the myocardium. [J]J Biol Chem2005；280：15719-15726.]。

心血管疾病发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多，严重威胁人类的生 命和健康。因此，世界各国对心脑血管疾病的研究、预防及治疗均十分重视。在心脏纤维化 疾病的治疗过程中，如何能有效的降低CTGF在心肌组织结构中表达量，进而减少ECM在在心肌 组织内的积累、降低心脏组织中胶原浓度，将成为治疗心脏纤维化所导致的多种心血管疾病 的关键。

微小RNA(miRNA或microRNA)是一种长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小 RNA，是由前体在酶的加工下生成，前体的序列一般为70～120个核苷酸。通过与靶基因序列 特异性相互作用在转录水平调节基因表达，参与多种生物学过程，进化过程保守。最初发现 的内源性miRNA是lin24和let27，它们参与基因表达转录后调节，通过与靶mRNA的3’端非编 码区或编码区(3’-UTR)相结合而发挥负性调节作用。近年来已经鉴定出超过400种miRNA， 但仍有很多种尚未被发现[Berezikov E，Thuemmler F，van Laake LW，et al.Diversity  of microRNAs in human and chimpanzee brain[J].Nat Genet，2006，38(12)： 1375-1377.]。对miRNA空间表达的系统性分析表明，很多miRNAs以组织特异性方式表达 [Wienholds E，KloostermanWP，Miska E，et al.MicroRNA expression in zebrafish  embryonic development[J].Science，2005，309(5732)：310-311.]。每一种miRNA 可以定位于很多种mRNA，使其转录抑制或降解，因此很多种转录子可能受到miRNA的精细调节， 使转录-翻译系统有效运转，进而细胞得以快速而有效地控制阈值依赖性的细胞事件。目前普 遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程如生长发育、器官形成、造血、细胞增殖与凋 亡、应激反应和肿瘤生成等。

最初科学家们发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，对肿瘤抑制基因起作用的 miRNA下降或者缺失会导致肿瘤的发生。已发现的的miRNA与肺癌、乳腺癌、结肠癌、慢性淋 巴细胞白血病等多种癌症密切相关。2006年末，科学家开始注意到miRNA在心脏疾病发生发 展过程中所起的重要作用[Van Rooij E，Sutherland LB，L iu N，et a1.A signature  pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart  failure[J].PNAS，2006，103：18255-18260.]，并在心律失常、心力衰竭等疾病的 研究中取得了一系列重要进展，使miRNA成为国际心血管研究领域的热点。

心血管疾病相关miRNA的发现可能对该疾病的相关基因治疗产生重大的影响。通过对心 血管疾病患者和正常人群的miRNA差异表达分析，可以鉴定得到相关的敏感miRNA，进而通过 引入特异性的miRNA互补的反义核苷酸抑制或者通过病毒载体或质粒载体过表达的方法，调控 相关miRNA或其前体的表达量，从而达到治疗心血管疾病的目的。因此，发现特异性表达的 miRNA对于心血管疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于通过体外实验发现miRNA-19b的一种新用途。

本发明提供miRNA-19b作为制备治疗心肌纤维化疾病的药物治疗应用。

具体的说，本发明所提供的人源miRNA-19b(has-miR-19b)和鼠源miRNA-19b(mmu-miR-19b 和rno-miR-19b)均包含如下序列：

5’-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3’(SEQ ID7)。

本发明所提供的人源miRNA-19b的前体RNA有2种，包含如下序列：

hsa-mir-19b-1(MI0000074)：

5’-CACUGUUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUGUGAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAA CUGACUGUGGUAGUG-3’(SEQ ID1)

hsa-mir-19b-2(MI0000075)：

5’-ACAUUGCUACUUACAAUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCAGCGUAUAUAUGUAUAUGUGGCUGUGCAAAUCC AUGCAAAACUGAUUGUGAUAAUGU-3’(SEQ ID 2)

本发明所提供的小鼠鼠源miRNA-19b的前体RNA有2种，包含如下序列：

mmu-mir-19b-1(MI0000718)：

5’-CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAA ACUGACUGUGGUGGUG-3’(SEQ ID3)

mmu-mir-19b-2(MI0000546)

5’-ACUUACGAUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGAAUAUAUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAA CUGAUUGUGGGA-3’(SEQ ID4)

本发明所提供的大鼠鼠源miRNA-19b的前体RNA有2种，包含如下序列：

rno-mir-19b-1(MI0000847)

5’-CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAA CUGACUGUGGUGGUG-3’(SEQ ID5)

rno-mir-19b-2(MI0000848)

5’-ACAUUGCUACUUACGGUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGGAUAUAUGGCUGUGCAAAUCC AUGCAAAACUGAUUGUGAUGAUGU-3’(SEQ I D6)

本发明所提供的人源miRNA-19b(has-miRNA-19b)，鼠源miRNA-19b(mmu-miR-19b和 rno-miR-19b)的反义寡核苷酸均包含如下序列：

5’-UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA-3’(SEQ ID8)

本发明所提供的人源miRNA-19b的前体hsa-mir-19b-1在人染色体上定位于13q31.3，前体 hsa-mir-19b-2定位于人染色体Xq26.2。

本发明以新生SD大鼠的心肌细胞为材料进行miRNA分子的克隆分析。采用常规分子生物学 技术，从细胞和组织中提取总RNA，经过特意性的引物进行反转录和PCR扩增。荧光实时定量 PCR(qRT-PCR)检测结果表明，miRNA-19b在血管紧张素诱导的心肌纤维化病理状态下其表 达量明显降低；运用特异性合成的miRNA-19b前体RNA增加细胞内miRNA-19b的表达，能有效的 降低结缔组织生长因子(CTGF)在心肌组织结构中表达量。

患有心肌纤维化疾病的病人，由于CTGF在心肌组织结构中表达量增高，心脏组织中胶原 浓度含量极高。在该疾病的早期，左心室舒张功能受损。任其发展将最终使心室收缩功能也 受损，从而导致心功能不全。在血管紧张素诱导的心肌纤维化病理状态下，miRNA-19b在心 肌细胞中的表达量明显降低，用这一特征性的表现可以将其作为诊断心肌纤维化的指征；由 于miRNA-19b对于心肌组织结构中CTGF的表达量有着明显的调节作用，因此能够运用病毒载体 或质粒载体过表达的方法，将病人心肌细胞中的miRNA-19b表达量增加，将能有效的抑制CTGF 在心肌细胞中的表达，进而降低心脏组织中胶原浓度，这将有效的延缓心肌纤维化的病理进 程，控制心肌纤维化病情的发展，从而达到治疗目的。miRNA-19b这一功能的发现对于心肌纤 维化等心血管疾病的诊断和治疗都有着极其重要的意义。

本发明将人源miRNA-19b序列SEQ ID1和SEQ ID2，或非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、 SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6，单独或混合添加于含有血管紧张素(AngII)的心肌细胞 培养液中，本发明的序列能显著抑制结缔组织生长因子(CTGF)在心肌细胞中的表达量，尤 其是将优选将不同人源miRNA-19b序列与非人源miRNA-19b混合应用，更是取得了惊人的效果。

根据本发明，提供了一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，其特征在于，所 述miRNA是miRNA-19b。

如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选所述miRNA的来源于 人、小鼠或大鼠。

如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选所述miRNA序列为SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5或SEQ ID6。

如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选将不同人源miRNA-19b 序列与非人源miRNA-19b混合应用，即将人源miRNA-19b序列SEQ ID1或SEQID2，与非人源 miRNA-19b序列SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种或多种进行混合。

如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，优选在所述的混合 miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA-19b序列SEQ ID1或SEQID2的含有比例为10％～90％。

如上所述的一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，更优选在所述的混合 miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA-19b序列SEQ ID1或SEQ ID2的含有比例为30％～70％。

本发明还提供了一种制备治疗或诊断心肌纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，含有药 学上可接受的载体和有效量的miRNA序列SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQID4、SEQ ID 5以及SEQ ID6中的一种或多种。

一种制备治疗或诊断心肌纤维化疾病的药物组合物，优选将人源miRNA-19b序列SEQ ID1 或SEQ ID2，与非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种 或多种进行混合。

本发明还提供了治疗或诊断心肌纤维化疾病的探针，其特征在于所述探针的序列为SEQ ID 1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5或SEQ ID6的互补序列。

本发明还提供一种治疗或诊断心肌纤维化疾病的试剂盒，其特征在于，其特征在于含有 序列为SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5或SEQ ID6的探针。

附图说明

图1.血管紧张素(AngII)诱导心肌细胞纤维化的过程中，miR-19b的表达明显降低； 血管紧张素抑制剂替米沙坦(Telmisartan)可以阻断AngII作用，维持miR-19b表达水平。 *：p<0.05，与对照组相比有统计学意义

图2.AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的mRNA表达明显增高。AngII抑制剂 Telmisartan可以阻断AngII作用，维持CTGF的mRNA表达水平。A qRT-PCR检测CTGF的mRNA 表达量；B琼脂糖凝胶电泳检测CTGF的mRNA表达量。*：p<0.05，与对照组相比有统计学 意义

图3.AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的蛋白表达水平明显增高。AngII抑制 剂Telmisartan可以阻断AngII作用，维持CTGF的蛋白表达水平。A.Western-blot检测心 肌细胞内CTGF的蛋白表达；B.灰度分析定量Western-blot检测CTGF结果。*：p<0.05， 与对照组相比有统计学意义

图4.A.miR-19b与CTGF mRNA的3’非编码区(3’-UTR)结合位点分析。B.转染miR-19b 前体(pre-miR-19b)可以明显增加心肌细胞内miR-19b的表达水平。*：p<0.05，与对照 组相比有统计学意义

图5.转染miR-19b前体(pre-miR-19b)可以明显降低心肌细胞内CTGF mRNA的表达水 平。A.qRT-PCR检测CTGF的mRNA表达量；B.琼脂糖凝胶电泳检测CTGF的mRNA表达量。*： D<0.05，与对照组相比有统计学意义

图6.AngII诱导心肌细胞纤维化过程中，pre-miR-19b可以有效的降低心肌细胞内CTGF 的mRNA表达水平。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义

图7.AngII诱导心肌细胞纤维化过程中，pre-miR-19b可以有效的降低CTGF的蛋白表达 水平。A.Western-blot检测不同状态下心肌细胞内CTGF的蛋白表达量；B.灰度分析定量 Western-biot检测CTGF表达结果。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。

本发明所公开的RNA序列均能够以人工合成的方法或其它生物学方法获得。

实施例1

新生大鼠心肌细胞培养及心肌细胞总RNA和总蛋白抽提

l.原代培养新生大鼠心肌细胞

1.1取新生1-3天的大鼠心脏置于预冷的Hanks平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen)中。

1.2分离心室下端大约1/3位置的心肌组织，将其用手术剪切成小块。

1.3将小块心肌组织放入5mL含有75U/mL col lagenase II(Worthington)的消化溶液 中37℃孵育20分钟后收集消化液并加入新鲜的消化溶液继续消化。该消化过程重复6次。

1.4细胞283g离心5分钟之后用含有10％胎牛血清，1％抗生素的DMEM-F12细胞培 养液(1∶1，Invitrogen)重悬。

1.5在细胞培养盘上培养细胞1小时，运用差速贴壁的方法分离非心肌细胞。没有贴壁 的细胞用DMEM-F12细胞培养液培养在预包被Gelatin(Invitrogen)的培养瓶中。

1.6心肌细胞将在此含有0.1％牛血清白蛋白的DMEM-F12培养液中48小时内贴壁。

2.细胞总RNA提取(TRIzol法)

2.1.收获细胞1-5×10⁷，移入1.5ml离心管中，加入lml Trizol，混匀，室温静置 5min。

2.2.加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2min。

2.3.于预冷的4℃离心机中12000g离心15分钟。取上清。

2.4.加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

2.5.于预冷的4℃离心机中12000g离心10分钟。弃上清。

2.6.加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。于预冷的4℃离心机中7500g离心10分钟， 弃上清。

2.7.晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)。测定0D260和0D280 值，初步断定RNA质量。

2.8.总RNA提取采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详 细操作原理和方法见试剂盒说明书。

3.细胞总蛋白提取(RIPA裂解法)

3.1.从贴壁细胞培养板中小心吸去培养液。

3.2.预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心吸去PBS。

3.3.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA裂解液(1ml裂解液中加入5μl蛋白酶抑 制剂混合液，5μ1PMSF和5μ1磷酸酶抑制剂混合液)。

3.4.细胞培养板中加入预冷的含抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上5分钟。

3.5.用一预冷的细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰 浴下摇动15分钟进行裂解。

3.6.裂解液于预冷的离心机中14000g，4℃离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转 移入新的离心管中保存待用。

实施例2

miR-19b前体(pre-mir-19b)转染心肌细胞及血管紧张素Ang II刺激诱导心肌细胞纤维 化

1.pre-mir-19b转染心肌细胞后总RNA和总蛋白的提取

1.1细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4×10⁴。

1.2将1ul的转染试剂siPORT NeoFX(AM4510，Ambion)和25ul的OPTI-MEM I培养液 (Invitrogen)混合放置于室温孵育10分钟。

1.3将pre-mir-19b(AMl7100，Ambion)用OPTI-MEM I培养液(Invitrogen)稀释，两 者混匀后放置于室温孵育10分钟。运用无功能的miRNA序列pre-miR^TM-Negative Control (AM17110，Ambion)处理细胞作为对照组(Control)。

1.4混匀稀释好的pre-mir-19b和转染试剂，放置于室温孵育10分钟使其形成转染复合 物。

1.5将含有转染复合物的培养液加入细胞培养板，与细胞共同孵育48小时。

1.6收集细胞总RNA，具体方法参照实施例1。

1.7收集细胞总蛋白，具体方法参照实施例1。

2.血管紧张素Ang II刺激诱导心肌细胞纤维化

2.1细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4×10⁴。

2.2细胞用10μm替米沙坦(Telmisartan，Abcam)预处理30分钟后加入含有100nM血 管紧张素AngII(Sigma)的细胞培养液中培养48小时。将未预处理组和常规培养液培养组细 胞作为对照组。

2.3收集细胞总RNA，具体方法参照实施例1中第2部分。

2.4收集细胞总蛋白，具体方法参照实施例1中第3部分。

实施例3

分析心肌细胞内miRNA-19b和CTGF的表达量

1.qRT-PCR检测心肌细胞内miRNA-19b和CTGF mRNA的表达量。

1.1以收集的心肌细胞总RNA作为模板，用miR-19b特异性的mirVana qRT-PCR引物 (Ambion)扩增miR-19b基因。使用实时TaqMan miRNA分析检测试剂盒(ABI)进行定量PCR检 测细胞内miR-19b的表达量，运用U6snRNA基因作为检测的内参。详细操作原理和方法见试 剂盒说明书。

1.2以收集的心肌细胞总RNA作为模板，用CTGF基因特异性的PCR引物扩增CTGF的 mRNA，使用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞内CTGF mRNA表达量，运用GAPDH基 因作为检测内参。PCR的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行可视化和定量分析。详细操作原理 和方法见试剂盒说明书。

2.Western-blott ing分析心肌细胞中CTGF蛋白表达水平

2.1以收集心肌细胞总蛋白进行Western-biot检测CTGF蛋白表达量。等量的大约30μg 总蛋白用10％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)进行200伏特，2小时的电泳后电转至PVDF膜上 (Millipore).

2.25％的牛血清白蛋白室温条件下封闭1小时。

2.3加入特异性的CTGF(1∶500稀释，Santa Cruz)and GAPDH(1∶5000稀释，Sigma) 一抗抗体，在4℃条件下孵育过夜。

2.4用含有1％的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。

2.5加入特异性针对一抗的二抗，室温条件下孵育1小时。

2.6用含有1％的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。

2.7加入ECL荧光显影液试剂(Thermo)，用x光胶片感光显影。

2.8运用ImageJ软件进行影像条带的灰度定量分析。

实施例4

MiRNA结合位点分析

运用生物信息学TargetScan程序(http：//www.targetscan.org)分析预测miR-19b与 CTGF mRNA的3’-UTR结合位点。

实施例5

统计学处理

所有数据以均数±标准差表示，两样本之间比较用t检验，以p<0.05具有统 计学意义。每个实验至少重复3次。

实验例

按照实施例2中的实验方法，将本发明的替代pre-mir-19b(AM17100，Ambion)，加入所 培养的心肌细胞中，如表1所示的实验例及对照例，分别测定心肌细胞内CTGF蛋白表达量， 其结果如表1所示，其中，将本发明的各miR-19b序列配制成10ng/ml的溶液，在实验例7 至实验例46中，个混合miR-19b序列溶液的总量为10μ1。

本发明所取得的具体效果：

1.血管紧张素AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，miR-19b的表达明显降低；血管紧 张素抑制剂替米沙坦(Telmisartan)可以部分阻断AngII作用，维持miR-19b表达水平(图 1)。该结果提示：心肌纤维化过程中，miR-19b表达量将发生明显的降低；阻断外界致病因素 作用将能有效的维持miR-19b的表达水平。检测心肌细胞内miR-19b的表达量的方法可以作 为诊断心肌纤维化疾病的指针。

2.血管紧张素AngII诱导心肌细胞纤维化的过程中，CTGF的表达明显增高；用 Telmisartan阻断AngII作用可以维持CTGF的表达水平。CTGF无论是在mRNA水平或者蛋白 质水平均表现出相对一致的变化趋势(图2和图3)。该结果表明：CTGF的表达增高与心肌 纤维化疾病的发生存在一定程度的相关性。

3.生物信息学研究结果显示：CTGF mRNA的3’非编码区(3’-UTR)存在有特异性 miR-19b抑制性结合位点。转染miR-19b前体(pre-miR-19b)可以明显增加心肌细胞内miR-19b 的表达水平。(图4)。该结果表明：有可能通过调控细胞内miR-19b的表达水平来改变CTGF 的表达。

4.通过转染pre-miR-19b增加心肌细胞内miR-19b的表达水平可以明显降低心肌细胞内 CTGF的表达水平。(图5)。

5.无论是在mRNA水平或者蛋白质水平，转染miRNA-19b的前体pre-miR-19b都可以降 低心肌细胞内CTGF的表达水平，有效的抑制由血管紧张素AngII诱导的心肌细胞纤维化，在 一定程度上消除纤维化对心肌细胞功能的影响，达到治疗的作用(图6和图7)。

6.在各种不同条件下培养的心肌细胞中，CTGF蛋白的表达量如表1所示，结果显示本发 明的SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5和SEQ ID6均能抑制CTGF蛋白 质的表达，将人源miRNA-19b序列SEQ ID1或SEQ ID2，与非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、 SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一种(或多种)进行混合，其抑制效果更为明显。

表1.各实验例和对照例中CTGF蛋白的表达量(任意单位)