用于胆囊癌预后评估的ERBB信号通路突变靶向测序方法

摘要

本发明涉及用于胆囊癌预后评估的ERBB信号通路突变靶向测序方法，并提供了胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂/试剂盒的用途。本发明采用全基因组外显子技术对胆囊癌患者ERBB信号通路进行突变靶向测序，结合胆囊癌患者病理临床资料，Kaplan-Meier生存曲线分析显示患者术后生存期与ERBB信号通路基因突变密切相关，Cox风险回归模型多因素分析显示ERBB信号通路基因突变可作为胆囊癌的独立预后因素。提示通过对胆囊癌患者ERBB信号通路相关基因突变进行筛查，将有助于胆囊癌基因水平的诊断、分型，治疗靶点的确立以及预后的分析等。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及用于胆囊癌预后评估的ERBB信号通路突变靶向测序方法。

背景技术

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，早期诊断困难，恶性程度高，发病的早期即可出现肝脏和周围脏器的浸润与转移，其确诊后仅有15％～47％的切除率，且放化疗效果不确切，5年生存率总体仅为5％，根治性切除术后也只有16.5％左右，预后极差。胆囊癌的发生是一个多基因、多步骤的病变过程，包括遗传学等一系列改变。越来越多的证据表明，体细胞的基因突变造成的癌基因激活与抑癌基因失活在肿瘤的发生发展过程中扮演着至关重要的作用，因此，对于胆囊癌体细胞突变筛查有助于发掘其发病的驱动基因。

由于肿瘤遗传学的复杂性，传统的体细胞突变筛查方法无法对肿瘤有一个整体的认识。而作为一种高效和高灵敏度的技术，全基因外显子组测序能发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异，可检测常见变异和频率<5%的低频突变，通过对外显子区域的基因突变进行测定，一方面有助于确定胆囊癌相关癌基因及抑癌基因，为其早期分子诊断提供依据；另一方面有助于更好地定性肿瘤，揭示相似组织病理类型和不同临床特征的亚临床分类，帮助确定不同亚型胆囊癌的治疗敏感性和判断预后；更为关键的是，外显子组测序技术有助于寻找胆囊癌基因突变相关的最佳药物靶点，从而改变相应分子调控网络和相关代谢途径，使胆囊癌个体化治疗成为可能。

受体酪氨酸激酶超家族(ERBB家族)包括4个成员：EGFR(ERBB/HER1)、ERBB2(HER2/NEU)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)。其中ERBB2没有配体，ERBB3因在酪氨酸激酶域重要氨基酸残基的被取代而缺乏酪氨酸激酶活性。ERBB信号通路激活机制如下，配体结合于受体后，受体二聚化、自我磷酸化，胞内相关蛋白结合于磷酸化的受体之上，介导下游信号传递。ERBB主要介导以下3条信号传导通路：促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)-AKT、信号转导物和转录激活子蛋白3和5通路(STAT3 and 5)，这些信号最终导致细胞增殖、迁移和转移，逃逸凋亡或血管发生，而这些与癌肿瘤的发生发展相关。

胆囊癌预后对于预见患者可能病程和结局、指导进一步治疗有重要意义。然而目前还未见通过ERBB信号通路突变靶向测序进行预后评估的方法。另外，ERBB信号通路突变靶向测序也将有助于胆囊癌相关癌基因及抑癌基因、胆囊癌基因水平的分型等科学研究，并有助于确定可能的胆囊癌治疗靶点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于非治疗目的的胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序方法。

本发明的再一的目的是，提供胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂的用途。

本发明的另一的目的是，提供胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂盒的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于非治疗目的的胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序方法，包括以下步骤：

    a）采集组织样本；

b）抽提基因组DNA；

c）制备模板；

d）通过外显子组捕获获得目标文库；

e）靶向测序及生物信息学分析。

所述的用于非治疗目的是指用于确定胆囊癌相关癌基因及抑癌基因、胆囊癌基因水平的分型和治疗靶点的确定。

所述的制备模板具体是通过固相PCR法。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂的用途，用于制备胆囊癌预后的试剂/试剂盒。

所述的胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂包含DNA抽提试剂、固相PCR试剂、外显子组捕获试剂和靶向测序试剂。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂盒的用途，用于制备胆囊癌预后的试剂/试剂盒。

所述的胆囊癌患者ERBB信号通路突变靶向测序试剂盒包含DNA抽提试剂、固相PCR试剂、外显子组捕获试剂和靶向测序试剂。

本发明优点在于：本发明采用全基因组外显子技术对胆囊癌患者ERBB信号通路进行突变靶向测序，结合胆囊癌患者病理临床资料，Kaplan-Meier生存曲线分析显示患者术后生存期与ERBB信号通路基因突变密切相关，Cox风险回归模型多因素分析显示ERBB信号通路基因突变可作为胆囊癌的独立预后因素。上述结果提示如发现ERBB信号通路相关的基因发生了突变，则提示该胆囊癌患者预后差，通过对胆囊癌患者ERBB信号通路相关基因突变进行筛查，将有助于胆囊癌基因水平的诊断、分型，治疗靶点的确立以及预后的分析等。

附图说明

图1、胆囊癌高频突变基因示意图。

    图2、ERBB信号通路基因突变情况示意图。

    图3、ERBB2、ERBB3突变位点示意图。

    图4、ERBB信号通路基因突变与胆囊癌患者术后总体生存比较曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  ERBB信号通路突变靶向测序方法

1、采集受检者肿瘤组织样本。

2、基因组DNA抽提

组织块解冻，取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500μl PBS的离心管中（1.5ml），用剪刀剪碎；12000rpm离心8min，取出弃上清。而胆囊癌细胞先处理为细胞悬液，然后10,000 rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

加入0.45ml TES混匀，再加入50μl SDS（10%），20μl蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56℃保温4-6h，每2h摇1次，至体系透亮为好。

放置到室温，加入等体积饱和酚（500μl），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相到一个新的1.5ml离心管。

加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10min，取上层转移到新的1.5ml离心管中。

加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下温柔翻转5min，10000r/m，离心10min，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。

加入1/10体积的NaAc（4℃保存），加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，置于-20℃中保存30min或更久；观察现象。

12000 r/m，离心10min，弃乙醇。

-20℃保存的75%乙醇洗涤，12000 r/m，离心5min，去乙醇，55℃干燥DNA。

加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定）（一般50μl），-20℃保存备用。

3、模板制备

采用的是固相PCR（Illumina的HiSeq）法，即把这个扩增过程放在了玻璃载片上。高密度的正向和反向引物共价连接在这些玻璃载片上，模板和引物的比例决定了扩增簇的密度。固相PCR能够生成一到两亿空间上隔离的模板簇，并提供自由末端给通用的测序引物，用以起始测序反应。

4、外显子组捕获

利用Illumina公司推出的TruSeq外显子建库试剂盒（TruSeq Exome Enrichment Kit），它是基于液相杂交捕获，用95bp长的寡聚DNA序列作为诱饵。设计来自于CCDS、RefSeq、ENCODE以及miRBase等数据库的基因组信息，覆盖包括20794个基因在内的约62Mb的区域。TruSeq的优势在于作为同时生产捕获试剂盒和二代测序仪的公司，这样可以与下游的Illumina HiSeq2000二代测序仪更好的结合。首先将制备的样品文库变性成为单链DNA，然后与目标区域特异的生物素标记探针杂交，随后加入可与生物素化探针结合的链霉亲和素磁珠，富集目标区域。与链霉亲和素磁珠结合的生物素化DNA片段通过磁性从溶液中脱离。富集的DNA片段随后从磁珠上洗脱，并杂交进行第二次富集反应。扩增之后，目标文库即可用于簇生成和后续的测序。

5、靶向测序及生物信息学分析

Illumina的HiSeq测序的基本原理是边合成边测序，又称循环可逆终止。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的四种dNTP。由于这些dNTP的3′羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’羟基保护基团，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。这种测序方法的优势是减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到 2×50bp，每次运行后可获得超过20GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。

针对ERBB信号通路的基因进行靶向测序，最后利用BWA和GATK，通过构建高斯混合模型的方法，将得到的短片段序列与参考序列比对（mapping），寻找突变（variant calling），以及对突变的过滤筛选。

实施例2  ERBB信号通路基因突变可作为胆囊癌的独立预后因素

1、实验方法

本课题组利用如实施例1所述的全基因组外显子技术对57对胆囊癌配对组织进行靶向测序，获取基因突变频次，再针对高频突变基因通过KEGG数据库进行通路分析，然后按照患者的性别、年龄、胆囊癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、神经浸润、病变部位、有无黄疸、切缘情况、ERBB信号通路基因突变及有无合并胆囊结石进行分组，比较各组间ERBB信号通路基因突变情况。

应用SPSS 18.0进行数据分析，计数资料采用χ²检验（当样本含量小于40例时采用Fisher确切概率法）；单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，差异的显著性采用Log-rank检验；多因素分析采用Cox比例风险回归模型。均数表达用平均数±标准差（                                                ±SD）。以P＜0.05为有显著性差异，具有统计学意义。

2、实验结果

2.1基因突变频次统计

对57对胆囊癌配对组织进行靶向测序，高频突变基因见图1。针对高频突变基因通过KEGG数据库进行通路分析，发现ERBB信号通路相关基因的突变存在统计学差异，并且突变基因之间存在互相排斥现象（mutually exclusive）（图2）。图3为ERBB3 and ERBB2 非同义突变位点（箭头）示意图， I-IV，胞外区；TKD，激酶区；ERBB3突变位点有6个，其中胞外区104位点是hot spot位点，占据了4/6的突变位点。

2.2 ERBB信号通路基因突变情况与胆囊癌患者临床病理参数的关系

按照患者的性别、年龄、胆囊癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、神经浸润、病变部位、有无黄疸、切缘情况、ERBB信号通路基因突变及有无合并胆囊结石进行分组，比较各组间ERBB信号通路基因突变情况，提示ERBB信号通路基因突变阳性与性别、年龄、胆囊癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、神经浸润、有无黄疸、切缘情况及有无合并胆囊结石（P>0.05），而与病变部位有关（P<0.05）。见表1。

表1 ERBB信号通路基因突变情况与胆囊癌患者临床病理参数的关系

2.3生存分析

2.3.1单因素生存分析

57例胆囊癌患者均有完整的随访材料。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，差异的显著性采用Log-rank检验，结果显示患者生存期与ERBB信号通路基因突变情况（P<0.05）及切缘情况（P<0.05）有关；而与性别、年龄、胆囊癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、神经浸润、有无黄疸及有无合并胆囊结石无关（P>0.05），见表2。ERBB信号通路基因突变阳性组患者中位生存期为13.0个月，阴性组患者中位生存期为8.0个月，两者差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图4。

表2 总生存期的单因素Log-rank分析

2.3.2多因素生存分析

多因素生存分析：应用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，进入模型的因素有性别、年龄、胆囊癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、神经浸润、病变部位、有无黄疸、切缘情况、ERBB信号通路基因突变及有无合并胆囊结石。结果显示ERBB信号通路基因突变及TNM分期是预测胆囊癌患者预后的独立因素（表3）。

表3 总生存期的多因素Cox分析

实施例3  ERBB信号通路基因突变作为胆囊癌的独立预后因素的临床应用

利用如实施例1所述的方法对临床1例胆囊癌患者进行预后，结果发现这位受检者ERBB3基因发生突变，突变部位为V104L，提示该胆囊癌患者预后差。统计该患者实际生存期为7.5个月。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。