一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法

摘要

本发明涉及一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，属于血管模型技术领域。该方法包括胶原细胞混合液的配制、胶原细胞混合液的交联凝固和三维收缩模型的制备三个步骤，制得的三维收缩模型作为一种改进的收缩模型，选用肌成纤维细胞IMR-90，生长更快，制作模型周期更短；同时，加入辅助收缩因子U0126和TGF-β刺激细胞，使其表达收缩性蛋白，具有更好的收缩性能，进而具有更强的机械强度；本发明制得的三维收缩模型可以为科学研究提供更好更快捷的收缩模型，并可为以后应用于临床提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于血管模型技术领域，具体涉及一种用于构建人工血管模型的三 维收缩模型的制备方法。

背景技术

目前三维收缩模型多被应用在科学研究或者生物工程中的构建人工血管模 型，甚至作为替代血管应用于临床。临床上，虽然对于较大血管已经有较成熟 的生物材料替代，但是对于心脏的冠状动脉等小动脉，却还是找不到理想的替 代制品。尽管自身血管可以作为一种选择，但是许多病患存在血管疾病，如动 脉粥样硬化，这使得寻找合适的生物替代制品成为可能的一种治疗方法。目前 可以利用的科学研究的三维收缩模型制作方法，存在细胞培养时间长，机械强 度不够等缺点，使小型人工血管应用受到限制。所以提供一种科学合理的制作 人工血管相似的三维收缩模型应用于科学研究迫在眉睫。

Small-Diameter Artificial Arteries Engineered In Vitro和Phenotype  Modμlation in Vascμlar Tissue Engineering Using Biochemical and  Mechanical Stimμlation等文献中提到了一种三维收缩模型，即一种圆柱形带内 芯模型，内芯固定于圆柱形的模具中心，将消化悬浮好的血管平滑肌细胞和I 型胶原/纤维蛋白混合注入此的三维中空模型，放入37℃后30分钟到1小时等 待胶原交联。为增加模型的机械力，有的人还做过外加机械力刺激，如加压等， 和生物因子刺激，如TGF-β、PDGF等。但它们都存在细胞培养时间长，增殖 慢，构建好的三维模型机械强度不高等缺点。因此，如何克服现有技术的不足 是目前血管模型技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明针对目前三维收缩模型制作过程存在的细胞增殖慢，机械强度低的 缺点，提供一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将 3.9～4.1g I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.5～10.9μl浓度为1M的氢氧化 钠混合均匀后，同时加入胎牛血清、DMEM培养基和19～21*10⁶个肌成纤维细胞的 混合液至总体积为2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，混合均 匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：圆柱形管内置玻璃管内芯，且上下 两端采用橡胶塞封闭，制得圆柱形模型装置；将步骤(1)得到的胶原细胞混合 液注入圆柱形模型装置或细胞培养板中，然后将其放入37℃孵箱垂直培养半小 时后，得到交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液或交联凝固好的圆盘形胶原细 胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：将步骤(2)得到的交联凝固好的圆柱形 胶原细胞混合液打入离心管中，然后向离心管或含有交联凝固好的圆盘形胶原 细胞混合液的细胞培养板中加入胎牛血清和DMEM培养基按体积比为1∶9混 合的混合液以没过胶原细胞混合液，过夜培养后换DMEM培养基继续培养12 小时，所述的DMEM培养基的加入量以没过胶原细胞混合液为限，接着向DMEM 培养基中加入U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM，30-60min后再加入 TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为200pM-400pM，继续培养96小时，得到 三维收缩圆柱模型或三维收缩圆盘模型。

所述的细胞培养板为低粘附的24孔细胞培养板。

步骤(2)中所述的圆柱形管为塑料管。

所述的塑料管为铁氟龙管。

步骤(2)中所述橡胶塞为注射器中的橡胶塞。

将步骤(2)得到的交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液打入离心管中采用 的方式是用注射器芯杆用力推动橡皮塞将步骤(2)得到的交联凝固好的圆柱形 胶原细胞混合液打入离心管中。

上述用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将467μl 浓度为8.56mg/ml的I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.7μl浓度为1M的 氢氧化钠混合均匀后，同时加入胎牛血清、DMEM培养基和19～21*10⁶个肌成纤维 细胞的混合液至总体积为2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9， 混合均匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：铁氟龙圆柱形管内置玻璃管内芯， 且上下两端采用橡胶塞封闭，制得圆柱形模型装置；将步骤(1)得到的胶原细 胞混合液2ml注入圆柱形模型装置中，然后将其放入37。孵箱垂直培养半小时 后，得到交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：用注射器芯杆用力推动橡皮塞将步骤(2) 得到的交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液打入离心管中，然后向离心管中加 入8ml胎牛血清和DMEM培养基按体积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后 换成9mlDMEM培养基继续培养12小时，接着向DMEM培养基中加入9μl  U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM，45min后，30-60min后再加入 TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为300pM，继续培养96小时，得到三维收缩 圆柱模型。

上述构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将467μl 浓度为8.56mg/ml的I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.7μl浓度为1M的 氢氧化钠混合均匀后，同时加入胎牛血清、DMEM培养基和20*10⁶个肌成纤维 细胞的混合液至总体积为2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9， 混合均匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：将步骤(1)得到的胶原细胞混合 液0.5ml注入低粘附的24孔细胞培养板中，然后将其放入37℃孵箱垂直培养半 小时后，得到交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：向含有交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合 液的低粘附的24孔细胞培养板中中加入1ml胎牛血清和DMEM培养基按体积 比为1∶9混合的混合液，过夜培养后换成1mlDMEM培养基继续培养12小时， 接着向DMEM培养基中加入1μl U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM， 50min后再加入再加入TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为280pM，继续培养 96小时，得到发明的三维收缩圆盘模型。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：(1)本发明提供的一种用于构建人 工血管模型的三维收缩模型的制备方法制得的三维收缩模型作为一种改进的收 缩模型，选用肌成纤维细胞IMR-90，生长更快，制作模型周期更短；(2)同时， 加入辅助收缩因子U0126和TGF-β刺激细胞，使其表达收缩性蛋白，具有更好 的收缩性能，进而具有更强的机械强度；(3)本发明制得的三维收缩模型可以 为科学研究提供更好更快捷的收缩模型，并可为以后应用于临床提供参考。

附图说明

图1是本发明圆柱形模型装置结构示意图；

1-圆柱形管，2-玻璃管内芯，3-橡胶塞；

图2是本发明圆盘形模型装置结构中加入各种因子的比较示意图；其中，21-培 养半小时；22-未加药培养12小时；23-药物处理3天；

图3是本发明三维收缩模型蛋白免疫印迹检测图谱；

图4是本发明三维收缩模型蛋白免疫印迹检测图谱。

具体实施例

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详细描述。

细胞准备，本发明选用肌成纤维细胞(IMR-90)购自美国菌种保藏中心 (ATCC)。肌成纤维细胞细胞可以表达平滑肌收缩性蛋白平滑肌α-肌动蛋白 (α-actin)，钙调理蛋白(calponin)以及平滑肌22α(SM22α)。同时，IMR-90 细胞生长速度较血管平滑肌细胞更快，培养时间更短。一个圆柱形模型使用细 胞数量大约是20*10⁶个；一个圆盘形模型使用细胞数大约5*10⁶个。

U0126为p-ERK特异性抑制剂。

I型胶原购自BD公司，浓度为8.56mg/ml。

NAC，为N-acetylcysteine，即N-乙酰半胱氨酸，浓度为4mM，

实施例1

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将467μl 浓度为8.56mg/ml的I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.7μl浓度为1M的 氢氧化钠混合均匀后，同时加入胎牛血清、DMEM培养基和20*10⁶个肌成纤维细胞 的混合液至总体积为2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，用移 液枪轻轻吹至混合均匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：如图1所示，铁氟龙圆柱形管内置 玻璃管内芯，且上下两端采用橡胶塞封闭，制得圆柱形模型装置；将步骤(1) 得到的胶原细胞混合液2ml注入圆柱形模型装置中，然后将其放入37℃孵箱垂 直培养半小时后，得到交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：用注射器芯杆用力推动橡皮塞将步骤(2) 得到的交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液打入离心管中，然后向离心管中加 入8ml胎牛血清和DMEM培养基按体积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后 换成9mlDMEM培养基继续培养12小时，接着向DMEM培养基中加入9μl  U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM，45min后再加入TGF-β，使培养 基中TGF-β的浓度为300pM，继续培养96小时，得到本实施例的三维收缩圆 柱模型；其中，步骤(2)中所述铁氟龙圆柱形管高5cm，外直径1.1cm，内直 径0.9cm玻璃管内芯直径0.2cm，长4cm；橡胶塞为注射器中的橡胶塞，其 直径为4cm，长为1cm；步骤(3)中所述的离心管为15mL离心管。

实施例2

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将3.9 I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.5μl浓度为1M的氢氧化钠混合均匀后， 同时加入胎牛血清、DMEM培养基和19*10⁶个肌成纤维细胞的混合液至总体积为 2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，用移液枪轻轻吹至混合均 匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：如图1所示，铁氟龙圆柱形管内置 玻璃管内芯，且上下两端采用橡胶塞封闭，制得圆柱形模型装置；将步骤(1) 得到的胶原细胞混合液2ml注入圆柱形模型装置中，然后将其放入37℃孵箱垂 直培养半小时后，得到交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：用注射器芯杆用力推动橡皮塞将步骤(2) 得到的交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液打入离心管中，然后向离心管中加 入8ml胎牛血清和DMEM培养基按体积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后 换成8mlDMEM培养基继续培养12小时，接着向DMEM培养基中加入8μl  U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM，30min后再加入TGF-β，使培养 基中TGF-β的浓度为200pM，继续培养96小时，得到本实施例的三维收缩圆 柱模型；其中，步骤(2)中所述铁氟龙圆柱形管高5cm，外直径1.1cm，内直 径0.9cm；玻璃管内芯直径0.2cm，长4cm；橡胶塞为注射器中的橡胶塞，其 直径为4cm，长为1cm；步骤(3)中所述的离心管为15mL离心管。

实施例3

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将4.1g  I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.9μl浓度为1M的氢氧化钠混合均匀后， 同时加入胎牛血清、DMEM培养基和21*10⁶个肌成纤维细胞的混合液至总体积为 2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，用移液枪轻轻吹至混合均 匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：如图1所示，铁氟龙圆柱形管内置 玻璃管内芯，且上下两端采用橡胶塞封闭，制得圆柱形模型装置；将步骤(1) 得到的胶原细胞混合液2ml注入圆柱形模型装置中，然后将其放入37℃孵箱垂 直培养半小时后，得到交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：用注射器芯杆用力推动橡皮塞将步骤(2) 得到的交联凝固好的圆柱形胶原细胞混合液打入离心管中，然后向离心管中加 入8ml胎牛血清和DMEM培养基按体积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后 换成10mlDMEM培养基继续培养12小时，接着向DMEM培养基中加入10μl  U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM，60min后再加入TGF-β，使培养 基中TGF-β的浓度为400pM，继续培养96小时，得到本实施例的三维收缩圆 柱模型；其中，步骤(2)中所述铁氟龙圆柱形管高5cm，外直径1.1cm，内直 径0.9cm玻璃管内芯直径0.2cm，长4cm；橡胶塞为注射器中的橡胶塞，其 直径为4cm，长为1cm；步骤(3)中所述的离心管为15mL离心管。

实施例4

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将 467μl浓度为8.56mg/ml的I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.7μl浓度为 1M的氢氧化钠混合均匀后，同时加入胎牛血清、DMEM培养基和20*10⁶个肌成纤 维细胞的混合液至总体积为2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9， 用移液枪轻轻吹至混合均匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：将步骤(1)得到的胶原细胞混合 液0.5ml注入低粘附的24孔细胞培养板中，然后将其放入37℃孵箱垂直培养半 小时后，得到交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：向含有交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合 液的低粘附的24孔细胞培养板中中加入1ml胎牛血清和DMEM培养基按体积 比为1∶9混合的混合液，过夜培养后换成1mlDMEM培养基继续培养12小时， 接着向DMEM培养基中加入1μl U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM， 50min后再加入TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为280pM，继续培养96小 时，得到本实施例的三维收缩圆盘模型。

实施例5

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将3.9 I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.5μl浓度为1M的氢氧化钠混合均匀后， 同时加入胎牛血清、DMEM培养基和19*10⁶个肌成纤维细胞的混合液至总体积为 2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，用移液枪轻轻吹至混合均 匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：将步骤(1)得到的胶原细胞混合 液0.5ml注入低粘附的24孔细胞培养板中，然后将其放入37℃孵箱垂直培养半 小时后，得到交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：向含有交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合 液的低粘附的24孔细胞培养板中中加入0.8ml胎牛血清和DMEM培养基按体 积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后换成0.8mlDMEM培养基继续培养12 小时，接着向DMEM培养基中加入U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM， 30min后再加入再加入TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为200pM，继续培养 96小时，得到本实施例的三维收缩圆盘模型。

实施例6

一种用于构建人工血管模型的三维收缩模型的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，胶原细胞混合液的配制：2ml胶原细胞混合液的配制方法是将4.1g  I型胶原、200μl10×磷酸盐缓冲液、10.9μl浓度为1M的氢氧化钠混合均匀后， 同时加入胎牛血清、DMEM培养基和21*10⁶个肌成纤维细胞的混合液至总体积为 2ml，所述的胎牛血清、DMEM培养基的体积比为1∶9，用移液枪轻轻吹至混合均 匀，即得；

步骤(2)，胶原细胞混合液的交联凝固：将步骤(1)得到的胶原细胞混合 液注入低粘附的24孔细胞培养板中，然后将其放入37℃孵箱垂直培养半小时 后，得到交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合液；

步骤(3)，三维收缩模型的制备：向含有交联凝固好的圆盘形胶原细胞混合 液的低粘附的24孔细胞培养板中中加入1.2ml胎牛血清和DMEM培养基按体 积比为1∶9混合的混合液，过夜培养后换成1.2mlDMEM培养基继续培养12 小时，接着向DMEM培养基中加入U0126，使培养基中U0126的浓度为10μM， 60min后再加入TGF-β，使培养基中TGF-β的浓度为400pM，继续培养96小 时，得到本实施例的三维收缩圆盘模型。

实施例1～6制得的三维收缩模型都具有一定的收缩强度和机械强度。通过蛋 白免疫印迹检测发现TGF-β刺激三种收缩性蛋白表达都增加，在第三天最明显， 如图3所示；加U0126后三种蛋白表达增加更加明显，如图4所示，间接说明 IMR-90细胞向平滑肌细胞方向分化，具有更强大的收缩能力。其中，图2是本 发明圆盘形模型装置结构中加入各种因子的比较示意图；图3是本发明三维收 缩模型蛋白免疫印迹检测图谱，用来说明胶原培养三天时收缩蛋白表达量最高； 图4是用来说明加入U0126预处理后再加TGF-β比单纯加TGF-β收缩蛋白表达 更明显。