桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用

摘要

本发明一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明利用载体PFGC5941为框架，通过双酶切，在其内含子两边分别插入桔小实蝇细胞色素P450基因的正反向特异性目的片段，构成RNA干扰载体非常重要的区域，构建的RNA干扰表达载体在转化到植株后，在其强启动子CaMV35S的驱动下，在其体细胞内转录形成双链RNA的“发卡结构”，使得桔小实蝇取食植株后体内同源基因片段的正常表达和翻译受到影响，实现干扰昆虫正常生长发育，达到植株抗桔小实蝇的目的，对桔小实蝇的控制发挥重要作用，减少化学农药使用量。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种RNA干扰载体，尤其涉及一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用。

背景技术

桔小实蝇Bactroceradorsalis又名东方果实蝇，是一种世界危险性检疫害虫，广泛分布于中国各大柑橘产区，使中国的柑橘产业面临着严重威胁，每年都对柑橘为害造成巨大经济损失，能危害250多种瓜果蔬菜。桔小实蝇寄主范围广，可危害柑橘、芒果和杨桃等250多种水果蔬菜和作物。随着气候变化、种植结构的调整和国际贸易的增加，其危害面积逐渐扩大，给果蔬业带来严重的经济损失。目前化学防治仍是控制桔小实蝇的重要措施，然而近年来对桔小实蝇种群抗药性监测表明，其抗药性上升非常快。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是指通过双链RNA的介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。细胞色素P450s是一种具有血色素类似结构的多功能氧化酶系，该酶系由数 量众多、功能多样的不同成员构成，形成了一个超家族。一些P450基因通过对内源激素的合成或降解，参与昆虫的生长、发育和生殖等重要的生理代谢过程。目前还没有人将桔小实蝇细胞色素P450基因用于构建RNA干扰载体对桔小实蝇进行控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，该载体含有桔小实蝇细胞色素P450基因目的片段，得到的转基因植株可以使取食该植株的桔小实蝇发生RNA沉默现象，使得转基因植株对桔小实蝇具有一定抗性。

本发明还提供干扰细胞色素P450基因表达载体的构建方法和应用，为利用RNA干扰技术的植物抗虫育种工程提供了一种新的策略和思路。

桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在于：以桔小实蝇细胞色素P450基因部分片段为正或反义链，所述细胞色素P450基因部分片段序列如SEQIDNO.1，所述骨架载体为PFGC5941载体。

所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间，反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间。

桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建方法，包括如下步骤：

1)细胞色素P450基因目的片段与质粒的连接

提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQIDNO.2和SEQIDNO.3为引物对细胞色素P450基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQIDNO.4和SEQIDNO.5为引物对细胞色素P450基因的反向目的片段进行 PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为600bp，回收PCR产物，与载体pMD-19连接，转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述SEQID NO.2～5的序列如下：

SEQIDNO.2：5’-GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.3：5’-CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

SEQIDNO.4：5’-GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.5：5’-CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

2)细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建

将上述测序正确的细胞色素P450基因正向目的片段质粒pMD-19-P1F1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切，将pMD-19-P1F1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-P1F1；将PFGC5941-P1F1和细胞色素P450基因反向目的片段质粒pMD-19-P2F2分别用XbalI和BamHI双酶切，将酶切产物进行连接，即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-P1F1/P2F2，经PCR扩增检测、核苷酸序列分析，目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。

所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物为柑橘属植物。

所述应用为将桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体转化有关受体植物，使之对桔小实蝇产生抗性，所述受体植物为柑桔。

所述转化的方法为农杆菌介导法。

所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。

本发明的有益效果是：本发明构建了含有桔小实蝇细胞色素P450基因正反向目的片段的RNA干扰载体以及该载体的构建方法和应用，本发明利用载体PFGC5941为框架，通过双酶切，在其内含子两边分别插入桔小实蝇细胞色素P450基因的正反向特异性目的片段，构成RNA干扰载体非常重要的区域，为形成“发卡结构”提供结构基础。本发明构建的RNA干扰表达载体在转化到植株后，在其强启动子CaMV35S的驱动下，可以在其体细胞内转录形成双链RNA的“发卡结构”，使得桔小实蝇取食植株后体内同源基因片段的正常表达和翻译受到影响，从而实现干扰昆虫正常生长发育的目的，达到植株抗桔小实蝇的目的，对桔小实蝇的控制发挥重要作用，能够减少化学农药使用量，具有极其广阔的市场前景。载体PFGC5941还携带能抗除草剂的Bar基因，为转基因苗的初步筛选提供标记基因。

附图说明

图1为提取的桔小实蝇总RNA的电泳图。M：DL5000Marker。

图2为细胞色素P450基因正向反向目的片段的克隆电泳图。1、2是细胞色素P450基因正向片段电泳图；3、4是细胞色素P450反向片段电泳图；M：DL5000Marker。

图3为细胞色素P450基因正向反向目的片段插入载体PFGC5941位置示意图。

图4为载体PFGC5941经XhoI和NcoI酶切后的电泳图。1、2是载体PFGC5941；3、4是经XhoI和NcoI酶切后的载体PFGC5941；M是DL5000Marker。

图5为细胞色素P450基因正向片段经XhoI和NcoI酶切后的电泳图。1、2 是经XhoI和NcoI酶切后的细胞色素P450基因正向片段；M是DL5000Marker。

图6为重组质粒PFGC5941-P1F1酶切后的电泳图1为重组质粒PFGC5941-P1F1；2为经XbaI和BamHI酶切后的重组质粒PFGC5941-P1F1；M是DL5000Marker。

图7为载体PFGC5941-P1F1/P2F2经XbaI和BamHI酶切后的电泳图。1、2是经XbaI和BamHI酶切后的重组质粒PFGC5941-P1F1/P2F2；M是DL5000Marker。

图8为阳性转基因苗的PCR扩增检测电泳图。1是质粒PFGC-P1F1/P2F2对照；2是清水对照；3-6是阳性扩增产物；M是DL5000Marker。

具体实施方式

大肠杆菌感受态细胞DH5α(北京天根生化科技有限公司，中国)；

农杆菌EHA105(中国农科院柑橘研究所改良中心提供)；

总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，中国)；

PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)；

DNA回收纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司，中国)；

质粒提取试剂盒(TaKaRa公司，日本)；

pMD19-T(TaKaRa公司，日本)；

NcoI、XbaI、XhoI、BamHI(NEB公司，美国)；

LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；

LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract) 5g/L氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L。

SOC培养基：胰蛋白胨20；酵母浸粉5；氯化钠0.5；氯化钾0.186；氯化镁0.95；硫酸镁1.2；葡萄糖3.6；(g/L)pH7.0

载体PFGC5941：本发明的载体PFGC5941由中国农科院柑橘研究所改良中心提供，也可向公众提供。植物干扰表达载体PFGC5941是各研究中使用较多的植物双元表达载体。它含有强启动子CaMV35S可以启动外源基因有效表达；还有一段内含子结构(来源于矮牵牛)作为间隔序列，是构成RNA干扰载体非常重要的区域，为形成“发卡结构”提供结构基础；另外，PFGC5941载体还携带能抗除草剂的Bar基因，为转基因苗的初步筛选提供标记基因。

实施例1细胞色素P450基因的克隆及回收纯化

一、桔小实蝇总RNA的提取及全长cDNA的获得

采用总RNA提取试剂盒提取由西南大学植物保护学院提供的桔小实蝇虫源的总RNA，具体步骤参见总RNA提取试剂盒使用说明。提取的总RNA电泳图如图1所示。

将提取得到的总RNA利用PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser反转录试剂盒反转录为cDNA，具体步骤参见反转录试剂盒使用说明。

二、细胞色素P450基因目的片段的克隆及回收纯化

(1)在NCBI网站上搜索桔小实蝇细胞色素P450基因全长序列，比对保守序列，根据桔小实蝇CYP6EK1序列的保守序列设计目的片段正向和反向特异性引物，引物P1和F1扩增细胞色素P450基因正向目的片段，引物P2和F2扩增反向目的片段，引物名称和序列及对应的酶切位点如表1所示：

表1桔小实蝇细胞色素P450基因扩增引物

(2)利用上述反转录得到的桔小实蝇cDNA和细胞色素P450基因引物，对细胞色素P450基因的正向目的片段和反向目的片段分别进行PCR，利用引物P1和F1扩增-正向目的片段，利用引物P2和F2扩增反向目的片段，反应体系扩增如下：

按照以下扩增程序进行扩增：

PCR程序结束后，分别取出5-8μLPCR扩增产物，在110V1％的琼脂糖凝胶中点样分别对正向目的片段和反向目的片段进行电泳检测，35min后用溴化乙锭染色10min，在凝胶成像系统中的图谱进行拍照分析，如图2所示，扩增出的正/反向目的片段条带大小在600bp左右，与预期结果相同。将剩余的PCR产物在110V1.2％的琼脂糖凝胶中点样进行回收电泳，40min后在切胶仪上将含有目的片段的胶块用刀片切下，放入无菌的1.5mL离心管中，利用DNA回收纯化试剂盒对目的片段进行回收，操作步骤见DNA回收试剂盒使用说明书。 实施例2重组质粒的转化

一、目的片段与质粒的体外连接

将实施例1中回收的细胞色素P450基因正向目的片段和反向目的片段分别与载体pMD-19进行体外连接，反应体系(10μL)如下：

pMD-19Vector 0.5μL

InsertDNA4.5μL

LigationSolution 5μL

上述操作最好在冰上进行，加完药品后，将混合液放入PCR仪中，16℃连接过夜，即得到细胞色素P450基因正向片段和反向片段的两个重组质粒，将正向片段的重组质粒命名为pMD-19-P1F1，将反向片段的重组质粒命名为pMD-19-P2F2。

二、重组质粒转化大肠杆菌

将细胞色素P450基因正向片段重组质粒pMD-19-P1F1和反向片段重组质粒pMD-19-P2F2分别转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，操作步骤如下：

(1)取出前述步骤中保存在-80℃冰箱的大肠杆菌感受态细胞DH5α，在冰上冻融30min。

(2)取出100μL步骤1中的大肠杆菌感受态细胞DH5α放入1.5mL离心管，加入10μL的前述步骤得到的重组质粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2，冰浴30min。

(3)将步骤2中的离心管在水浴锅中42℃热激45sec后，再冰浴冷激1min。

(4)向步骤3中的离心管中加入890μL的SOC培养基(提前在水浴锅中42℃预热)，然后37℃120rpm震荡培养1小时。

(5)将步骤4中离心管中的菌液涂布在含有氨苄、IPTG和X-Gal的固体LB培养基上，37℃倒置培养过夜。

(6)待步骤5中的培养基上长出蓝色和白色单菌落后，挑取白色单菌落于含有1mLLB液体培养基(含有氨苄、IPTG和X-Gal)中37℃120rpm震荡培养3-6小时。

(7)将步骤6得到的菌液进行PCR检测目的片段后送到华大基因公司测序，将序列正确的菌液用15％的甘油保存，放于-80℃冰箱。

三、重组质粒的提取

对上述转化了重组质粒的大肠杆菌用质粒提取试剂盒进行重组质粒的提取，按照试剂盒说明书操作，所得溶液即为大肠杆菌质粒。

实施例3RNA干扰表达载体的构建

一、目的片段与载体PFGC5941的酶切连接

(1)将实施例2中提取得到的细胞色素P450基因的正向目的片段质粒pMD-19-P1F1和载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI进行双酶切，酶切体系为：Buffer45μL，XhoI1.5μL，NcoI1.5μL，BSA0.5μL，pMD-19-P1F1或者PFGC594120μL，用ddH2O将酶切体系总体积调节至50μL体系，放入离心管中，在水浴锅中37℃水浴4小时。

(2)将步骤1得到的pMD-19-P1F1和载体PFGC5941酶切产物取出3-5μL进行电泳检测，并跑回收胶回收酶切产物。PFGC5941经XhoI和NcoI酶切后的电泳图如图4所示，pMD-19-P1F1经XhoI和NcoI酶切后的电泳图如图5所示。

(3)将步骤2得到的正向目的片段回收产物与载体PFGC5941进行体外连接，连接体系为：正反向目的片段6μL，PFGC59417.5μL，T4ligasebuffer1μL， T4ligase0.5μL；在PCR仪中16℃连接过夜，得到细胞色素P450基因正向目的片段的PFGC5941载体，命名为PFGC5941-P1F1。

(4)将实施例2中提取得到的细胞色素P450基因的反向目的片段质粒pMD-19-P2F2和步骤3得到的载体PFGC5941-P1F1分别用XbalI和BamHI进行双酶切，酶切体系为：Buffer5μL，XbalI1.5μL，BamHI1.5μL，BSA0.5μL，pMD-19-P2F2或者PFGC5941-P1F120μL，用ddH2O将酶切体系总体积调节至50μL体系，放入离心管中，在水浴锅中37℃水浴4小时。

(5)将步骤4中的pMD-19-P2F2和PFGC5941-P1F1酶切产物取出3-5μL进行电泳检测验证，跑回收胶回收酶切产物。PFGC5941-P1F1酶切后的电泳图如图6所示。将回收得到的pMD-19-P2F2和PFGC5941-P1F1酶切产物进行体外连接，连接体系为：pMD-19-P2F26μL，PFGC5941-P1F17.5μL，T4ligasebuffer1μL，T4ligase0.5μL；在PCR仪中16℃连接过夜，得到含细胞色素P450基因正反向目的片段的PFGC5941载体，命名为PFGC5941-P1F1/P2F2。细胞色素P450基因正反向目的片段插入载体位置如图3所示。

二、连接产物转化到大肠杆菌

将上述连接产物PFGC5941-P1F1/P2F2转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化方法同实施例2中“三、重组质粒转化大肠杆菌”。

三、PFGC5941-P1F1/P2F2载体的验证

随机挑取前述步骤“二、连接产物转化到大肠杆菌”中的氨苄抗性平板上的大肠杆菌单菌落，在装有1mLLB液体培养基的离心管中，37℃120rpm震荡培养3-6小时。

(1)菌液PCR检测：PCR反应体系和扩增程序参见实施例1中“二、细胞色 素P450基因目的片段的克隆及回收纯化”。

(2)提取质粒，方法参见实施例2中“四、重组质粒的提取”。用XhoI、NcoI、XbalI和BamHI进行双酶切验证，酶切体系和方法见实施例3中“一、目的片段与载体PFGC5941的酶切连接”。

将上述检测方法电泳检测均为阳性的菌落用甘油保存菌种，置于-80℃低温保存。PFGC5941-P1F1/P2F2载体酶切电泳图如图7所示。

四、农杆菌转化

1.农杆菌感受态细胞的制备

(1)从-80℃冰箱取出农杆菌菌株EHA105，在LB培养基上划线培养。

(2)在LB平板上挑取EHA105单菌落到有10mL液体LB培养基的三角瓶里继续培养，200rpm，28℃摇床培养一天。

(3)取上一步所得菌液3-5mL至100mL的LB液体培养基里继续200rpm28℃震荡培养至OD600值为0.5。

(4)将培养好的菌液置于冰上，冰浴30min，然后5000rpm4℃离心10min，弃掉培养液，收集菌体。

(5)用60mL10％的无菌甘油重悬菌体，3000rpm4℃离心10min，弃掉培养液，收集菌体。

(6)用40mL10％的无菌甘油重悬菌体，3000rpm4℃离心10min，弃掉培养液，收集菌体。

(7)在冰上加入0.2mL10％的无菌甘油，每管50μL分装到离心管，液氮速冻后保存在-80℃的超低温冰箱中备用。

2.电击法转化农杆菌

(1)取出浸泡在70％酒精的200mL信号的电击杯，用无菌水润洗3-5次，晾干后置于冰上。

(2)取1-3μL质粒DNA加入到制备好的50μL农杆菌感受态中，轻弹混匀，冰浴5min，转移至电击杯中。

(3)把准备好的电击装置(BioRad)，电压调节至2.5V，将电击杯放入电击槽中，用手按住设备上的电击按钮，当听到啪的一声即为电击完成。

(4)将电击后的农杆菌转移至装有1mLLB培养基的离心管中，200rpm28℃震荡培养2-4小时。

(5)10000rpm离心60ses，收集菌体，用150μLLB液体培养基重悬菌体，用枪头吹打均匀后涂布到含有50g/mLKan的LB固体培养基上继续培养。

(6)随机挑取单菌落，200rpm28℃震荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用目的片段的引物进行质粒PCR验证。质粒提取方法参见质粒提取试剂盒使用说明书。

实施例4PFGC5941-P1F1/P2F2干扰载体的应用

应用上述含有桔小实蝇细胞色素P450基因目的片段的重组农杆菌转化有关受体植物--柑桔锦橙品种：将准备好的锦橙外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接；将不定芽嫁接在柑桔苗上。

本发明已得到以柑桔锦橙品种为受体的柑桔T0代再生植株。

实施例5转基因植株(T0代)的PCR鉴定

对转化了PFGC5941-P1F1/P2F2干扰载体的柑桔植株进行PCR鉴定：

PFGC5941上没有GUS检测基因，在NCBI上搜索载体PFGC5941全序列，根据其BAR基因序列设计合成特异性PCR引物L1/R1，提取转基因苗叶片DNA，PCR检测结果为阳性的即为成功转化的转基因苗。引物序列为：

L1：5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’，

R1：5‘-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’。PCR反应体系如下：

按照上述药品量加好后，放入PCR仪进行扩增反应，反应体系如下：

PCR程序结束后，取出5-8μL的产物，在110V电压下用1％的琼脂糖凝胶中点样对其进行电泳检测，35min后用溴化乙锭染色10min，在凝胶成像系统中呈现的图谱进行拍照分析。电泳结果如图8所示，转化的12株植株中，检测到12株转细胞色素P450基因的转化阳性苗。