一种用于核酸快速提取的装置及一种核酸快速提取方法

摘要

本发明一种用于核酸快速提取的装置及一种核酸快速提取方法，主要用于从各种临床样本中快速提取核酸(包括RNA和DNA)，本装置主要包括注射器、中空的转接器、核酸吸附膜管、加样针四个部分，在经过临床样本裂解处理、注射器抽吸、核酸吸附膜吸附核酸、漂洗液漂洗核酸吸附膜、洗脱液洗脱核酸等步骤后，可以获得纯的核酸溶液用于下游实验。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可以从各种临床样本中快速提取核酸的装置及方法。

背景技术

(一)核酸提取

核酸提取已经成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案非常之多，而且繁简不一。分子诊断、核酸测序、功能基因组等相关实验的完成全部依赖核酸的成功提取，传统的操作流程己经可以实现全部的自动化，但这些昂贵的仪器并不能得到大规模的推广使用，我国目前仍是发展中国家，广大的基层医疗单位并不能配备复杂的仪器，因此，提供一种经济性好的核酸提取装置很有必要。

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：一、裂解细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然，如果是提取RNA和DNA共提取的话，则不需去除任何一种；二、沉淀核酸或者吸附核酸；三、纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质；四、洗脱或溶解核酸，利用洗脱液或者溶解液将核酸洗脱或者溶解。

(二)临床样本前处理

由于样本的处理及保存对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。临床常见的标本有血清(浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理方法各有不同。

1.血清(浆)标本

加适量的红细胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的红细胞；再加适量的细胞核裂液(破核液)，裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来；然后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白；SDS可与蛋白质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过程中必须除去。

2.痰标本

痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4％NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。

3.棉拭子

用PCR方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等)，临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。具体方法：

加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm，离心5分钟

用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物(由医护人员采集)，置无菌试管或EP管内弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟

4.体液

体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：

5.脓液

粘稠脓液：同痰标本处理，先用4％NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。

水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2‐3次后用于DNA提取。

6.组织

组织有新鲜组织和石蜡切片。新鲜组织的处理步骤：先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎(用眼科剪)，加蛋白酶K消化后提取核酸；石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。

(三)核酸提取装置

CN101684463A提出一种微量临床样本核酸快速提取装置，由尖口吸管、带膜的过滤器和抽吸装置(注射器或塑料泡)三部分组成，其通过三次抽吸完成核酸吸附、清洗及洗脱过程，能快速简便从样本中提取核酸，然美中不足的是，尖口吸管、带膜的过滤器和抽吸装置三部分组合方式单一且为固定安装，用塑料泡做抽吸装置时(CN101684463A的图2、图3)第三次抽吸进行核酸洗脱实际不能完成(前两次抽吸的废液无法排出，带核酸的洗脱液混在废液中)，而使用注射器做抽吸装置时，带核酸的洗脱液进入注射器不仅会沾染注射器形成生物垃圾，还会导致微量样本中核酸备注射器沾染而损失致使检测不准确。

发明内容

为克服现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种简单、实用、高效用 于核酸快速提取的装置及一种核酸快速提取方法。

本发明的用于核酸快速提取的装置，包括注射器、吸附膜和加样针，还包括一中空的转接器，所述吸附膜安装在一吸附膜管内的底端，转接器连接在注射器和吸附膜管中间且注射器、转接器和吸附膜管液路连通。

吸附膜管为两端开口的管体，一端为该管体的敞口端，另一端固定一小口连接管，吸附膜安装在该小口连接管一端；吸附膜管敞口端尺寸与转接器的外尺寸匹配。

注射器包括筒体、置于筒体前端的管状连接座以及置于筒体内可推拉的推杆，所述小口连接管的外径与注射器的连接座外径尺寸相等，所述转接器设中间通孔，中间通孔尺寸与注射器的连接座外径尺寸匹配。

所述加样针包括针座和针头，所述小口连接管的外径与所述加样针的针座内径匹配。

转接器一端连通注射器，另一端连通吸附膜管的小口连接管，组成该装置的抽液方式。

或，转接器一端连通注射器，另一端套接在吸附膜管的敞口端内，吸附膜管的小口连接管连通加样针，组成该装置的推液方式。

所述转接器外形为圆台状，圆台状转接器的小头端外径尺寸与吸附膜管的敞口端匹配，该敞口端从圆台状转接器的小头端套接。

本发明另一目的在于提供一种核酸快速提取的方法。

本发明提供的核酸快速提取的方法，使用前述核酸快速提取装置，经过样本裂解处理、吸附膜吸附样本中核酸、漂洗液漂洗吸附膜除杂、以及洗脱液洗脱核酸等步骤后，获得纯的核酸溶液。

该方法可为“两抽一推”法：“一抽”使裂解液中的核酸吸附于滤膜上；“二抽”使漂洗液通过滤膜以清洗杂质；“一推”将吸附在滤膜上的核酸成分洗脱，从而完成了生物样本中核酸成分的提取；具体包括以下步骤:

a)试剂标示分装：

将核酸提取中可能涉及的裂解液、RNA吸附液、RNA酶抑制剂、95％酒精、75％酒精、漂洗液、洗脱液等每一人份分装至1.5EP管，并对每一管进行标示；

b)将临床样本加入裂解液管中(如果涉及RNA提取则再加入RNA吸附液和RNA酶抑制剂)，并混匀；

c)一吸：使用核酸提取装置的抽液形式，用吸附膜管的敞口端从样本裂解混合液中抽吸，利用注射器抽吸产生的吸力，样本中的核酸成分流经吸附膜时因膜的特 异性吸附而吸附在吸附膜上，滤液为有细胞碎屑和蛋白质等杂质的废液，废液进入注射器腔且废液仅经过该吸附膜一次；

d)二吸：使用核酸提取装置的抽液形式，用吸附膜管的敞口端从漂洗液管中抽吸，利用注射器抽吸产生的吸力，用漂洗液清洗吸附膜，清洗残留在吸附膜上的蛋白质或其它成分，滤液进入注射器腔且该滤液仅经过吸附膜一次；

e)一推：更换另一只洁净的注射器，先吸入洗脱液，然后使用核酸提取装置的推液形式(即将吸附膜管反向，使吸附膜在前，吸附膜管的敞口端套接转接器一端，吸附膜管的小口连接管连接加样针的针座)，将注射器腔内的洗脱液加入到吸附膜管里，利用注射器推压产生的压力将洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分洗脱推挤至后续核酸收集容器或检测装置中，完成样本中核酸的提取过程。

该方法还可为“三推”法：“一推”使裂解液中的核酸吸附于滤膜上；“二推”使漂洗液通过滤膜清洗杂质；“三推”将吸附在滤膜上的核酸成分洗脱，从而完成了生物样本中核酸成分的提取；具体包括以下步骤：

a)试剂标示分装：

将核酸提取中可能涉及的裂解液、RNA吸附液、RNA酶抑制剂、95％酒精、75％酒精、漂洗液、洗脱液等每一人份分装至1.5EP管，并对每一管进行标示(使用不同字母和颜色区分)；

b)将临床样本加入裂解液管中(如果涉及RNA提取则再加入RNA吸附液和RNA酶抑制剂)，并混匀。

c)用注射器先吸入样本裂解混合液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，不设加样针)，利用注射器推压产生的压力使裂解混合液流经过滤膜，样本中的核酸成分流经吸附膜时因膜的特异性吸附而吸附在吸附膜上，滤液为有细胞碎屑和蛋白质等杂质的废液，废液被排出且废液仅经过吸附膜一次；

d)用注射器再吸入漂洗液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，不设加样针)，利用注射器推压产生的压力将漂洗液加入到吸附管里清洗吸附膜，清晰残留在吸附膜上的蛋白质或其它成分，滤液被排出且该滤液仅经过吸附膜一次；

e)更换另一只洁净的注射器吸入洗脱液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，加设加样针)，将注射器腔内的洗脱液加入到吸附膜管里，利用注射器推压产生的压力将洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分洗脱推挤至后续核酸收集容器或检测装置中，完成样本中核酸的提取过程。

采用以上方案，本发明核酸提取装置采用分件方式，通过组装搭配使用，构思 巧妙，结构简单，实用性强。其中，转接器两端可同时连接不同部件，吸附膜管可拆卸而反向装配，与中空且尺寸吻合的转接器配合使用，完成核酸提取从吸附洗涤到洗脱不同阶段的搭配，使核酸提取简单、快速、高效。同时，本发明利用注射器取代了高转速离心机，利用提取装置就可以在液相非均匀体系中达到分离的效果。

本发明可以作为核酸扩增前对生物样本进行核酸提取的一种简捷手段，提取出的样本纯度足够符合下一步核酸扩增的要求，同时不需要任何仪器、操作安全和简单、一次性使用，因而可以被广泛地应用于病原体或宿主核酸提取，用于临床检测和诊断。本发明提取装置成本低廉，操作简单同时又不需要任何特殊仪器，操作时间短，大约只需要10‐15分钟，因而本发明可以被广泛地应用于一些实验条件相对较差的基层医院和经济不发达地区或国家；同时，也可以很好地满足高层次医院的需求，特别是急诊室和床边的核酸快速诊断。

附图说明

图1为本发明用于核酸快速提取的装置分解图；

图2装置行使抽吸功能时的分解和组合图；

图3装置行使推压功能时的分解和组合图；

图4本发明实例1得到的沙门氏菌DNA PCR扩增检测结果；

图5本发明实施例2得到的旋毛虫DNA扩增核酸检测结果；

图6本发明实施例3得到的H1N1RNA RT‐LAMP扩增检测结果。

具体实施方式

本发明提供用于核酸快速提取的装置及核酸提取的方法，用于从各种临床样本中快速提取核酸(包括RNA和DNA)。

本发明提供的用于核酸快速提取的装置参见图1‐图3所示，主要包括注射器1、吸附膜管2、转接器3和加样针4四个部分，其中：

注射器1为普通筒状一次性注射器或者能行使注射器功能的类似装置，其具有筒体11、置于筒体11前端用于连接注射器针头的管状连接座12、以及置于筒体11内可推拉的推杆13；加样针4即为普通的注射针头，包括针座41和针头42。

转接器3为中空的圆柱或圆台，其中间通孔31尺寸与注射器1管状连接座12外径尺寸匹配，使该管状连接座12能插入到转接器3中间通孔31中；另，转接器3外表为圆柱状或圆台状，其外径尺寸与吸附膜管2匹配，以下详述；转接器3可以具有弹性的材料如橡胶、塑料制成。

吸附膜管2为两端开口的管体，可用塑料材料制成，其一端为该管体的敞口端 21，另一端固定一小口连接管22，吸附膜管2内底部(连接管22一端称为底)设吸附膜23(市售商品，如硅胶膜Silica membrane)；吸附膜管2的两端开口均可与转接器3相连，其中敞口端21尺寸与圆柱状转接器3的外径尺寸匹配，或与圆台状转接器的小头端外径尺寸匹配以使转接器3能与敞口端21套接；吸附膜管2的小口连接管22外径与注射器1连接座12相同，既与加样针4的针座41内径匹配，又与转接器3中间通孔31尺寸匹配，使该小口连接管22既能插入到针座41内连接加样针4，又能插入到中间通孔31中连接转接器3。

本发明中，抽取溶液时，用转接器3一端连接注射器1的连接座12，另一端连接吸附膜管2的小口连接管22，使吸附膜23在后(本发明中以注射器使用方向定义前后，即装针头一端定义为“前”，推杆抽取时运动方向定义为“后”)，即组配成核酸快速提取装置的抽液形式(如图2所示)。推出溶液时，用转接器3一端连接注射器1的连接座12，另一端伸入吸附膜管2的敞口端21，而吸附膜管2的小口连接管22再连接加样针4的针座41，即组配成核酸快速提取装置的推液形式(如图3所示)。

使用本发明用于核酸快速提取的装置，经过临床样本裂解处理、注射器抽吸裂解液、核酸吸附膜吸附核酸、漂洗液漂洗核酸吸附膜、洗脱液洗脱核酸等步骤后，可以获得纯的核酸溶液用于下游实验。

本发明核酸提取的基本原理，是吸附管中的吸附膜(也可称为滤膜)对核酸有特异的吸附作用，将样品和裂解混合液中的核酸吸附，然后经过漂洗净化达到提纯的目的，最后再从吸附膜上洗脱出来，以实现核酸与样本的分离保证少量或高价值样本中核酸的最大回收量。通常情况下，裂解后的核酸提取需要在液相非均匀体系中，利用离心机的离心力来达到液液分离，液固分离的效果。但本发明装置只需要“两抽一推”或者“三推”就可以完成所有操作。“两抽一推”为：“一抽”:使裂解液中的核酸吸附于滤膜上；“二抽”:使漂洗液通过滤膜完成清洗杂质的目的；“一推”:将吸附在滤膜上的核酸成分洗脱，从而完成了生物样本中核酸成分的提取。“三推”：“一推”:使裂解液中的核酸吸附于滤膜上；“二推”:使漂洗液通过滤膜完成清洗杂质的目的；“三推”:将吸附在滤膜上的核酸成分洗脱，从而完成了生物样本中核酸成分的提取。

为此，本发明提供的取核酸的方法使用以上的核酸提取装置，一种方法被称为“两抽一推”法，包括以下步骤:

a)试剂标示分装：

将核酸提取中可能涉及的裂解液、RNA吸附液、RNA酶抑制剂、95％酒精、75％酒精、漂洗液、洗脱液等每一人份分装至1.5EP管，并对每一管进行标示(使用不同字母和颜色区分)；

b)将临床样本加入裂解液管中(如果涉及RNA提取则再加入RNA吸附液和RNA酶抑制剂)，并混匀；

c)一吸：使用核酸提取装置的抽液形式，用吸附膜管的敞口端从样本裂解混合液中抽吸，利用注射器抽吸产生的吸力，样本中的核酸成分流经吸附膜时因膜的特异性吸附而吸附在吸附膜上，滤液为有细胞碎屑和蛋白质等杂质的废液，废液进入注射器腔且废液仅经过该吸附膜一次；

d)二吸：使用核酸提取装置的抽液形式，用吸附膜管的敞口端从漂洗液管中抽吸，利用注射器抽吸产生的吸力，用漂洗液清洗吸附膜，清洗残留在吸附膜上的蛋白质或其它成分，滤液进入注射器腔且该滤液仅经过吸附膜一次；

e)一推：更换另一只洁净的注射器，先吸入洗脱液，然后使用核酸提取装置的推液形式(即将吸附膜管反向，使吸附膜在前，吸附膜管的敞口端套接转接器一端，吸附膜管的小口连接管连接加样针的针座)，将注射器腔内的洗脱液加入到吸附膜管里，利用注射器推压产生的压力将洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分洗脱推挤至后续核酸收集容器或检测装置中，完成样本中核酸的提取过程。如此得到的为不含有其他杂质的核酸水溶液，可用于核酸扩增。

本发明提供的取核酸的方法使用以上的核酸提取装置，另一种方法被称为“三推”法，包括以下步骤:

a)试剂标示分装：

将核酸提取中可能涉及的裂解液、RNA吸附液、RNA酶抑制剂、95％酒精、75％酒精、漂洗液、洗脱液等每一人份分装至1.5EP管，并对每一管进行标示(使用不同字母和颜色区分)；

b)将临床样本加入裂解液管中(如果涉及RNA提取则再加入RNA吸附液和RNA酶抑制剂)，并混匀。

c)用注射器先吸入样本裂解混合液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，不设加样针)，利用注射器推压产生的压力使裂解混合液流经过滤膜，样本中的核酸成分流经吸附膜时因膜的特异性吸附而吸附在吸附膜上，滤液为有细胞碎屑和蛋白质等杂质的废液，废液被排出且废液仅经过吸附膜一次；

d)用注射器再吸入漂洗液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，不 设加样针)，利用注射器推压产生的压力将漂洗液加入到吸附管里清洗吸附膜，清晰残留在吸附膜上的蛋白质或其它成分，滤液被排出且该滤液仅经过吸附膜一次；

e)更换另一只洁净的注射器吸入洗脱液，使用核酸提取装置的推液形式(吸附膜管反向，加设加样针)，将注射器腔内的洗脱液加入到吸附膜管里，利用注射器推压产生的压力将洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分洗脱推挤至后续核酸收集容器或检测装置中，完成样本中核酸的提取过程。如此得到的为不含有其他杂质的核酸水溶液，可用于核酸扩增。

经过本发明提取的核酸可以应用于微生物检测、基因突变检测、单核苷酸多态性检测等涉及核酸的下游实验。核酸为可为DNA或RNA。

用于本发明中的裂解液是临床上常用的异硫氰酸肌溶液或者Chelex裂解液等可以裂解细胞的溶液；漂洗液是PH<7的清洗液，如70％的酒精；洗脱液是10mM的Tris-HCL或者双蒸水；吸附膜是各种能吸附核酸的膜，如硅胶膜(Silica membrane)。本发明中所用试剂和材料均可商购获得。

以下以实例说明本发明的应用。

实例1:沙门氏菌DNA的提取

本例以沙门氏菌DNA的提取为例，验证本发明核酸提取装置及方法是否有效。本实例提取样本共4份(1为阴性对照，2‐4为沙门氏菌)，分别进行如下操作：

1.裂解

取500微升的沙门氏菌过夜培养的菌液，加入等量的裂解液(组成：NaOH，25mmol；Tris‐Hcl，10mmol；Triton X‐100，1％；NP‐40，1％；EDTA，0.1mMol；Chelex‐100，2％。)；混匀后室温静置5分钟，使用核酸提取装置的抽液形式，将混合液抽吸至吸附膜管，使混合液经过吸附膜，不含核酸的废液进入注射器腔。

2.清洗

使用核酸提取装置的抽液形式，将漂洗液抽吸到吸附膜管里，同上步操作使漂洗液清洗吸附膜上的杂质，废液进入到注射器腔。

3.DNA洗脱

更换一只洁净注射器，将120微升洗脱液吸入至注射器腔，使用核酸提取装置的推液形式，用注射器推压产生的力将洗脱液推至吸附膜管，洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分连同洗脱液通过加样针推挤至一新的离心管中，备用。

4.核酸扩增

应用沙门氏菌PCR扩增试剂(2×Tap MIX试剂盒，天根生化科技(北京)有限 公司)，分别扩增提取出的DNA，具体反应如下:沙门氏菌扩增反应液20微升，离心管中提取的核酸(DNA)溶液5微升，总体积为25微升，反应程序:95℃，5分钟一个循环；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒共35个循环；72℃，7分钟一个循环；4℃保存。

5.结果检测

扩增产物通过电泳进行检测，结果如附图4(其中M为NDA marker，1为阴性对照，2‐4为沙门氏菌)。从图4的结果可以看出，沙门氏菌样本的检测结果均为阳性，表明本发明沙门氏菌DNA提取非常有效。

实例2:环介导恒温扩增法检测血液中的旋毛虫

本例以环介导恒温扩增法检测血液中的旋毛虫为例，说明本发明核酸提取装置及方法的应用。检测样本共8份(1‐6样本为阳性感染血样，7‐8样本为阴性对照)，分别进行如下检测操作：

1.裂解

取500微升的血液样本，加入等量的裂解液(组成：NaOH，25mmol；Tris‐Hcl，10mmol；Triton X‐100，1％；NP‐40，1％；EDTA，0.1mMol；Chelex‐100，2％。)；混匀后室温静置5分钟，使用核酸提取装置的抽液形式，将混合液抽吸至吸附膜管，使混合液经吸附膜，不含核酸的废液进入注射器腔。

2.清洗

使用核酸提取装置的抽液形式，将漂洗液抽吸到吸附膜管里，同上步操作使漂洗液清洗吸附膜上的杂质，废液进入到注射器腔。

3.DNA洗脱

更换一只洁净注射器，将120微升洗脱液吸入至注射器腔，使用核酸提取装置的推液形式，用注射器推压产生的力将洗脱液推至吸附膜管，洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分连同洗脱液通过加样针推挤至一新的离心管中，备用。

4.核酸扩增

应用旋毛虫环介导恒温扩增试剂(LAMP法DNA扩增试剂盒(DNA Amplification Kit)，日本荣研化学株式会社(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan))，扩增提取出的旋毛虫DNA。具体反应如下:旋毛虫扩增反应液20微升，离心管中提取的核酸(DNA)溶液5微升，总体积为25微升，反应温度及时间:65°，反应60分钟。

5.结果检测

用实时浊度仪对扩增产物进行检测。结果如图5。图5的结果显示，阳性感染的血样(样本1‐6)经扩增后核酸检测结果均为阳性。表明本例提取血样中旋毛虫DNA可用于检测中。

实例3:咽拭子中甲型流感病毒H1N1RNA的提取及检测

本例以咽拭子中甲型流感病毒H1N1RNA的提取及检测为例，说明本发明核酸提取装置及方法也适于提取RNA。检测样本共8份(1为阴性对照，2‐8均为阳性样本)，分别进行如下提取与检测操作：

1.裂解

取咽拭子样本200u1，加入适量裂解液(组成：NaOH，25mmol；Tris‐Hcl，10mmol；Triton X‐100，1％；NP‐40，1％；EDTA，0.1mMol；Chelex‐100，2％。)、RNA吸附液(组成：裂解液中加入等量99％乙醇)和RNA酶抑制剂(组成：Carrier RNA)，充分混匀，室温静置5分钟；使用核酸提取装置的抽液形式，将混合液抽吸至吸附膜管，使混合液经吸附膜，不含核酸的废液进入注射器腔。

2.清洗

使用核酸提取装置的抽液形式，将漂洗液抽吸到吸附膜管里，同上步操作使漂洗液清洗吸附膜上的杂质，废液进入到注射器腔。

3.RNA洗脱

更换一只洁净注射器，将120微升洗脱液吸入至注射器腔，使用核酸提取装置的推液形式，用注射器推压产生的力将洗脱液推至吸附膜管，洗脱液流经吸附膜，并将吸附在膜上的核酸成分连同洗脱液通过加样针推挤至一新的离心管中，备用。

4.核酸扩增

应用RT‐LAMP恒温扩增试剂(LAMP法RNA扩增试剂盒(RNA Amplification Kit)，日本荣研化学株式会社(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan))，扩增提取出的H1N1RNA。具体反应如下:RT‐LAMP扩增反应液20微升，离心管中提取的核酸(RNA)溶液5微升，总体积为25微升，反应温度及时间:60°，60分钟。

5.结果检测

扩增结果用实时浊度仪进行检测，结果如图6(1为阴性对照，2‐8均为阳性样本)。图6的结果可以看出，所有阳性样本的检测结果均为阳性。表明本例可以提取H1N1RNA并用于检测中。