体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法

摘要

本发明公开了一种体外复制的人线粒体DNA重组质粒，该重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。其构建方法包括以下步骤：提取完整的人线粒体DNA；从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得人线粒体DNA重组质粒。本发明一方面可实现人线粒体在原核生物中的复制，另一方面由于插入的为非编码区，不会对人线粒体DNA的编码功能造成影响。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，并涉及真核生物的DNA在原核生物中 的表达。更具体地，本发明涉及一种体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建 方法，该质粒可实现人线粒体DNA（mt-DNA）的完整复制。

背景技术

线粒体是一个对环境变化十分敏感的细胞器。在许多疾病状态下，线粒体 的结构和功能都会发生相应的改变，并成为疾病病理变化的一部分。另一方面， 线粒体的异常也可能成为疾病发生的原因，这种以线粒体结构或功能异常为主 要病因的一大类疾病称为线粒体病。

线粒体病中线粒体DNA（mt-DNA）的缺失、变异以及重复是致病的重要 原因。线粒体基因组是一个环状双DNA，核酸序列和组成比较保守。人类的 线粒体基因组由16569bp组成，其外环为重（H）链，内环为轻（L）链；除 一段非编码区（D-loop区）外均为编码区，共编码l3个多肽、22个tRNA和 2个rRNA。D-loop区是一大小约为1000bp的调控区，其包含有重链复制起 始点、保守序列节段、轻链启动子、重链启动子及终止结合序列等，几乎所有 与mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区。D-loop区为非编 码区，插入该区的外源基因不会对mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列 以及编码功能造成影响，也即不会影响到mt-DNA基因的功能。

通常情况下，基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因 基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。这就需要两方面的技术要求， 一种是针对疾病制备某种外源基因（外源DNA），其二则需要将这种外源DNA 导入靶细胞中，替换异常DNA。随着基因治疗手段的发展，采用该方法治疗 由于DNA缺失、变异或重复等导致的线粒体病也成为本领域的研究热点。但 由于人线粒体DNA是典型的真核基因，现有技术中其功能性研究仍停留在真 核水平，研究复杂程度较高，不利于实现简化的试验操作方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中人线粒体的功能性研究仍 停留在真核水平而导致的研究复杂程度高的缺陷，提供人线粒体DNA重组质 粒及其构建方法，通过该方法实现人线粒体DNA在原核生物内的体外复制， 降低研究复杂度。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种人线粒体 DNA重组质粒，所述重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基 因；所述大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述重组质粒还包含插入到人线粒体 DNA的D-LOOP区、并连接在大肠杆菌复制子基因的C端的抗性筛选基因。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因具有多克隆位点， 所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述大肠杆菌复制子基因的N端和所 述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因为氨苄基因。

根据本发明的另一方面，提供一种人线粒体DNA重组质粒的构建方法， 该方法包括以下步骤：

A、提取完整的人线粒体DNA；

B、从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制 子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及

C、同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外 源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得所述人线粒体DNA重组质粒。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括：

设计一对引物：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物4：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC  ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT-3’；

基于PCR方法，使用引物1和引物2从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复 制子基因和抗性筛选基因。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，扩增出的所述大肠杆菌复 制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点；扩增出的所述 抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和 NotⅠ位点的至少两个。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括：

设计一对引物：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物5：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC  AGA TCA AAG GAT CTT CTT GAG-3’；

基于PCR方法，使用引物3和引物5从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复 制子基因。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，在所述步骤C中，使用限 制性内切酶AleⅠ同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体 DNA和外源基因经去磷酸化处理后用T4连接酶连接在一起。

实施本发明可以获得以下有益效果：本发明在人线粒体DNA的非编码区 D-LOOP区插入大肠杆菌复制子基因，一方面可实现人线粒体在原核生物（例 如大肠杆菌）中的复制，通过体外复制的方法获得外源线粒体DNA，作为获 取人线粒体DNA的源头；另一方面由于插入的为非编码区，因此不会对人线 粒体DNA的编码功能造成影响。本发明的构建方法操作简单、便于实施，由 于构建得到的重组质粒适用于原核表达体系，可进一步降低线粒体的研究复杂 度。

优选地，本发明同时在人线粒体DNA中插入大肠杆菌复制子基因和抗性 筛选基因。抗性筛选基因不仅可以起到初步筛选的作用，而且本发明在抗性筛 选基因中引入了多克隆位点，便于后续通过酶切方式将线粒体中的基因片段克 隆到该质粒中。

附图说明

以下将结合附图和具体实施例对发明做进一步详细说明。附图中：

图1是提取到的完整的人线粒体DNA的电泳图，其中标号1表示λ-Hind ⅢDNA marker，标号2表示完整的人线粒体DNA；

图2是利用引物扩增后的人线粒体DNA片段的PCR鉴定示意图，其中标 号1表示人线粒体DNA片段的PCR，标号3表示DL2000DNA marker；

图3是从pUC19质粒中扩增得到的大肠杆菌复制子基因（oir）和氨苄基 因（amp）的PCR鉴定示意图，其中1表示DL2000DNA marker，标号2和3 分别表示大肠杆菌复制子基因（oir）和氨苄基因（amp）的PCR产物；

图4是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒的PCR鉴定示意图，其中标 号1、2和3分别表示人线粒体DNA重组质粒的PCR产物，标号4表示DL2000 DNA marker；以及

图5是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒经酶切处理后的PCR鉴定示 意图，其中标号1表示λ-HindⅢDNA marker，标号2表示DL2000DNA marker，标号3表示线粒体DNA重组质粒的酶切产物。

图6是从pUC19质粒中扩增得到的大肠杆菌复制子基因（oir）PCR鉴定 示意图，其中1表示DL2000DNA marker，标号2分别表示大肠杆菌复制子基 因（oir）PCR产物；

图7是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒经酶切处理后的PCR鉴定示 意图，其中标号1表示DL2000DNA marker，标号2表示线粒体DNA重组质 粒的酶切产物,标号3表示λ-EcoRⅠ+HindⅢDNA marker。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和效果更清楚明白，以下将结合附图和具体 实施例对本发明做进一步详细说明。应该理解的是，以下实施例仅用以解释本 发明，而不对本发明做任何限制。

本发明提供了一种在体外获得人线粒体DNA重组质粒的构建方法。获得 的重组质粒能在大肠杆菌中复制，并可复制得到完整的人线粒体DNA，不仅 可实现人线粒体DNA的体外量化制备，而且将其研究水平扩展到原核水平， 降低了其研究复杂程度。具体构建过程包括提取完整的人线粒体DNA、通过 引物设计获取后续插入线粒体DNA中的外源基因、以及构建包含以上基因的 重组质粒。

一、提取完整的人线粒体DNA

完整的人线粒体DNA均可在美国国立生物信息中心（NCBI）、欧洲生物 信息中心（EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库查询中 得到。本发明中则按照线粒体DNA的提取方法，从人新鲜血液提取所需的人 线粒体DNA，具体过程如下：

取人新鲜血液，加入4倍体积的细胞裂解液，振荡混匀10分钟，4℃条件 下3000rmp离心10分钟，取上清，4℃条件下15000rmp离心10分钟，去上 清，所得沉淀使用线粒体DNA提取试剂盒提取线粒体DNA。提取得到的线粒 体DNA经DNA电泳显示大小约为16Kb（图1所示）。对提取得到的线粒体 DNA进行进一步鉴定，设计以下引物：

引物1：5’-TTA TGT AGC TTA CCT CCT CAA-3’；

引物2：5’-TGT CAG TTC AGT CTT TTA ATC-3’；

取提取得到的线粒体DNA为模板，以引物1和引物2为上下游引物进行 PCR扩增，反应体系如下：

以上反应体系共50μl，轻轻混匀后分成两管各25μl，置于55℃、58℃温 度的PCR仪反应孔中，PCR反应程序如下：95℃下预变性5min，95℃下变性 处理1min。55℃下退火处理1min，72℃下延伸处理1min；以上循环25次后 在72℃下延伸处理5min，最后在4℃下处理4min，得到一条大小约1.8Kb的 DNA条带（图2所示），与使用以上引物后线粒体DNA片段的理论大小一致， 证实提取得到的为人线粒体DNA。将该线粒体DNA保存于-20℃，备用。

二、获取插入线粒体DNA中的外源基因

这里所说的外源基因指大肠杆菌复制子基因（oir）和抗菌筛选基因。本 发明中尤其采用氨苄基因（amp）作为抗性筛选基因。大肠杆菌复制子基因和 氨苄基因为本领域所公知的基因片段，尽管本发明中未明确示出，但本领域技 术人员也应该了解其具体碱基序列。

本发明通过引物设计从pUC19质粒获取所需的外源基因。在美国国立生 物信息中心（NCBI）、欧洲生物信息中心（EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数 据库（IMGT）等数据库中查询得到大肠杆菌复制子基因和氨苄基因，设计以 下引物从质粒pUC19中扩增出大肠杆菌复制子和氨苄基因，引物两端均引入 了酶切位点AleⅠ。

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物4：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC CAA AAG GCC AGC AAA AGG CCA-3’。

以pUC19质粒为模板，用引物3和引物4扩增出大肠杆菌复制子基因和 氨苄基因（oir-amp基因）。反应体系如下：

以上反应体系共50μl，轻轻混匀后分成两管各25μl，至于55℃、56℃ 温度的PCR仪反应孔中。PCR反应程序如下：95℃下预变性5min，95℃下变 性处理1min。55℃下退火处理1min，72℃下延伸处理1min；以上循环25次 后在72℃下延伸处理5min，最后在4℃下处理4min。扩增得到的oir-amp基 因在上下游（分别为N端和C端）均引入了AleⅠ酶切位点，并在amp基因 的下游（即C端）引入多克隆位点（multi cloning site，MCS）。对该PCR产 物进行电泳检测，得到大小约1.6Kb的基因条带，与目标大小一致，表明成功 扩增出所需的大肠杆菌复制子基因和氨苄基因。采用DNA胶回收试剂盒回收 PCR产物，保存于-20℃。

在另一实施方式中，本发明也能够在不加入抗性筛选基因的情况下直接构 建适用于体外复制的人线粒体DNA重组质粒。此时仅需要通过引物设计从 pUC19质粒获取所需的大肠杆菌复制子基因、并将该外源基因插入到线粒体 DNA中即可。同样在美国国立生物信息中心（NCBI）、欧洲生物信息中心 （EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库中查询得到大肠 杆菌复制子基因，设计以下引物从质粒pUC19中扩增出大肠杆菌复制子，引 物两端均引入了酶切位点AleⅠ，并在下游引入多克隆位点。具体的引物设计 上游引物用引物3，下游引物设计为引物5：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物5：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC  AGA TCA AAG GAT CTT CTT GAG-3’。

采用引物3和引物5如何获取外源基因的具体操作流程如上所示。如图6 所示，对仅使用大肠杆菌复制子基因作为外源基因时的PCR产物进行电泳检 测，得到大小约600bp的基因条带，与目标大小一致，表明成功扩增出所需的 大肠杆菌复制子基因。

三、构建在原核生物中复制的人线粒体DNA重组质粒

分别使用限制性内切酶AleⅠ单酶切完整的人线粒体DNA，双酶切大肠杆 菌复制子基因和氨苄基因（oir-amp-MCS）；在另一实施方式中，分别使用限制 性内切酶AleⅠ单酶切完整的人线粒体DNA，双酶切获取的大肠杆菌复制子基 因。由于仅将大肠杆菌复制子基因用作外源基因和使用oir-amp-MCS具有相同 的酶切处理操作流程，以下仅对使用oir-amp-MCS的具体过程（例如反应体系、 反应条件）做详细说明。

经DNA电泳后分别胶回收酶切后两种DNA片段，并加入碱性磷酸酶进 行去磷酸化反应，反应体系分别如下：

oir-amp-MCS去磷酸化反应体系：

酶切后oir-amp-MCS基因DNA  26μl

10*反应缓冲液             3μl

碱性磷酸酶                1μl

上述反应体系共30μl，轻轻混匀后于65℃下反应30min，经DNA电泳 回收DNA。

线粒体DNA去磷酸化反应体系：

酶切后线粒体DNA             17μl

10*反应缓冲液               2μl

碱性磷酸酶                  1μl

上述反应体系共20μl，轻轻混匀后于65℃下反应30min，经DNA电泳 回收DNA。

随后采用T4连接酶连接两个去磷酸化处理的DNA片段，此时完成人线 粒体DNA重组质粒的构建。该重组质粒不仅包含有完整的人线粒体DNA，而 且包含插入到人线粒体DNAD-LOOP区的大肠杆菌复制子基因和氨苄基因。 大肠杆菌复制子基因可使该质粒在大肠杆菌中复制，氨苄基因起到初步筛选的 作用；两种外源基因由于插入到非编码的D-LOOP区，因此不会影响后续复 制过程中人线粒体的基因表达。人线粒体DNA则可在该质粒的复制过程中产 生大量人线粒体DNA，实现这一真核基因的原核复制。

为鉴定所需的重组质粒是否成功构建，将上述重组质粒转化于大肠杆菌 DH5α中，涂布于氨苄抗性平板上，37℃培养过夜。待生长出单克隆菌落后， 挑菌进行培养。采用以上设计的引物1和2扩增线粒体DNA中的一段，鉴定 是否成功构建包含完整的人线粒体DNA的重组质粒，若鉴定成功即为阳性质 粒。如图4所示，采用引物1和2扩增出的条带分子大小为1.8Kb，与所提取 的人线粒体DNA中扩增出的基因片段具有相同大小，表示该重组质粒已经成 功包含人线粒体DNA。

对该阳性质粒进行进一步的酶切鉴定。以AleⅠ酶切阳性质粒，对酶切产 物进行电泳检测，此时得到两条大小分别为16Kb和1.6Kb的DNA条带，其 分别对应完整的人线粒体DNA（mt-DNA）、以及大肠杆菌复制子基因和氨苄 基因(oir-amp-MCS)。图7是仅使用大肠杆菌复制子基因时对人线粒体DNA 重组质粒进行酶切的PCR鉴定示意图。从图上可知，此时得到两条大小分别 为16Kb和600bp的DNA条带，其分别对应完整的人线粒体DNA和大肠杆菌 复制子基因。

另外，上述重组质粒的氨苄基因的下游引入有多克隆位点。具体地，其可 为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。此时可通过酶切的方式将 线粒体DNA中的一段基因片段克隆到该重组质粒中。

以上所述仅为本发明的优选实施例，其目的并不在于将本发明限制或约束 于上述实现方式。凡在本发明的范围内对本发明所做出的任何修改和替换均应 包含在本发明权利要求所限定的范围内。