抗PML蛋白核定位信号抗体的制备及其在APL诊断中的应用

摘要

本发明涉及一种抗PML蛋白核定位信号（NLS）抗体的制备及其在APL诊断中的应用。该抗体以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作为免疫原制备得到。该抗体可用于区分PML蛋白和缺失核定位信号的PML蛋白，以及应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。另外，本发明还提供一种PML蛋白的定位方法。由此，为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础；同时，区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制，提供了新的依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种抗PML蛋白核定位信号（NLS）抗体的制备及其在APL诊断中的应用。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病（APL）的发生与染色体易位密切相关，95%以上的APL为特征性的染色体t(15,17)易位，形成并表达PML-RARα融合蛋白。研究发现，PML-RARα融合蛋白可以被中性白细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase，NE）切割成约52KDa和61KDa大小的两种变异蛋白。由于NE酶的这一特异性的切割作用，产生了一种缺失核定位信号（nuclear localization signal，NLS）的突变型PML蛋白即PML(NLS-)蛋白和带上核定位信号的NLS-RARα蛋白。

PML蛋白作为一种肿瘤生长抑制因子，对不同组织起源肿瘤的发生发展具有一定抑制作用，PML基因的失活能够明显促进白血病的发生，同时PML蛋白参与多条凋亡途径以及DNA损伤修复。由于PML参与形成PML-RARα融合蛋白在APL的发生发展中扮演着重要的角色，对PML与肿瘤形成方面的研究越来越激烈。在正常细胞中，PML蛋白主要分布于细胞核内呈斑点状，属于核体（nuclear bodies，NBs）亚核区域的成分。只有个别PML蛋白如PML                                                b、PML b，因缺乏NLS而定位于胞浆。PML蛋白具有内在的抗病毒活性，具有抑制肿瘤的生长、参与造血祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等多种生物学功能，所有这些功能的发挥与PML蛋白NBs内定位息息相关。而PML蛋白定位于NBs有赖于其自身的NLS序列，通过NLS介导PML蛋白入核，从而参与NBs的形成发挥其正常生物学功能。

所有PML蛋白的亚型均含有相同N-末端区域，即RBCC(ring finger, B-box, coiled-coil domain, 总称RBCC)结构域，PML(NLS-)蛋白也含有RBCC结构域。目前，国际上普遍采用合成PML蛋白N-末端或者RBCC结构域部分多肽作为免疫原，免疫家兔或小鼠来制备特异性抗体，这样获得的抗体不仅能特异性检测野生型PML蛋白，同时也能检测PML(NLS-)蛋白，不能对二者进行区分。

因此，选择合适的特异性序列多肽作为免疫原，制备能有效区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白的抗体异常重要，可为APL临床诊断提供新的依据。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种能有效区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白的抗体。

为实现上述目的，发明人经反复研究，创造性的发现以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作为免疫原可制备得到抗PML蛋白核定位信号抗体，能区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白。具体地，本发明要求保护：

SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。

SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列与KLH的偶联复合体作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。

上述制备得到的抗体在区分PML蛋白（野生型PML蛋白）和缺失核定位信号的PML蛋白（PML(NLS-)蛋白）中的应用。

一种PML蛋白特异性抗体，所述抗体为抗PML蛋白核定位信号抗体，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列作为免疫原制备得到。

本发明还提供一种PML蛋白特异性抗体的制备方法，该抗体可区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白，可广泛用于APL研究和临床诊断中。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种PML蛋白特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备多肽：合成SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

（2）制备多肽偶联复合体：采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联；

（3）制备抗体血清：以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体。

进一步，所述步骤（3）的免疫由首次免疫和加强免疫组成，首次免疫辅助采用完全福式佐剂，加强免疫辅助采用不完全福式佐剂。

上述制备的PML蛋白特异性抗体可应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。

此外，本发明还提供一种PML蛋白的定位方法，该方法可定位PML蛋白的胞内位置，为PML蛋白的相关研究开辟新的途径。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种PML蛋白的定位方法，包括以下步骤：

（1）制备多肽：合成SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

（2）制备多肽偶联复合体：采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联；

（3）制备抗体血清：以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体；

（4）PML蛋白定位：用上述制备的抗体血清，采用间接免疫荧光检测PML蛋白在胞内定位。

进一步，所述步骤（4）中，间接免疫荧光检测包括以下步骤：取靶细胞，转染前12h，将细胞按⁵/孔铺于24孔板中，转染48h后，弃去培养基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次，再用0.1% Triton透膜处理10 min；然后，用10%山羊血清室温封闭30min，加上抗体血清，4℃过夜，PBS洗3次，加罗丹明标记的山羊抗鼠荧光二抗，37℃孵育1h；再PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min，PBS漂洗3次，用70%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。

进一步，所述抗体血清和山羊抗鼠荧光二抗均为1:200倍体积稀释。

本发明的有益技术效果是：

本发明通过分析PML蛋白NLS序列免疫原性，合成NLS多肽，以此多肽作为免疫原，制备了抗PML蛋白抗体，为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础；同时，区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制，提供了新的依据。

附图说明

图1为NLS-RARα在宿主菌BL21中表达的检测结果；

图2为ELISA检测抗体效价（初次免疫）结果；

图3为ELISA检测抗体效价（加强免疫）结果；

图4为Western blot验证抗体特异性结果；

图5为间接免疫荧光验证抗体特异性——过表达PML蛋白免疫荧光结果；

图6为间接免疫荧光验证抗体特异性——正常人与M3型病人中性粒细胞免疫荧光结果。

具体实施方式

以下参照附图对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行。

材料

1.1 质粒、菌株和动物  

E. coli BL21菌由重庆医科大学临床诊断实验室保存。

原核表达质粒PET-His-NLS-RARα的构建：以PCMV-HA-NLS-RARα质粒 为模板，分别以p1:5’-TTA GGATCC ACAGTCAGTGCCCGGGC-3’和p2:5’-GCC AAGCTT TCACGGGGAGTGGGTGGC-3’为上下游引物，PCR扩增NLS-RARα基因并在其两端分别引入BamH 和Hind 酶切位点（下划线部分），将其插入原核表达载体pET-his 中，构建原核表达质粒pET-his-NLS-RARα，经酶切和测序验证其构建正确。真核表达质粒PCMV-HA-PML的构建参照文献《人联苯样水解酶(BPHL)在急性早幼粒细胞白血病发生中的分子机制研究》（初晨，重庆医科大学硕士学位论文， 2012年5月）。PCMV-HA-PML(NLS-)的构建参照文献《RANBP9在急性早幼粒细胞白血病发生中的作用研究》（黎亮，重庆医科大学硕士学位论文，2012年5月）。PCMV-HA-NLS-RARα的构建参照文献《带核定位信号的维甲酸受体与Ubiquilin1蛋白相互作用的验证》（朱丹等，中南大学学报(医学版)，2010年07期）。

清洁级健康雄性BLAB/ c小鼠，6～8 周龄，体重18～22 g，购自重庆医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 

匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）和牛血清白蛋白（albumin bovine serum albumin, BSA）完全福氏佐剂及不完全福氏佐剂、辣根酶标记山羊抗大鼠IgG均购自北京鼎国生物公司；NI-NTA spin kits蛋白纯化试剂盒购自Qiagen公司。蛋白Marker购自美国Fermentas公司；红细胞裂解液、人外周血中性粒细胞分离液购自天津灏洋生物；RIPA细胞裂解液、核染料DAPI，均购自碧云天生物技术研究所；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠的IgG、异硫氰酸荧光素 ( F I T C )和标记的羊抗兔IgG和罗丹明（TRITC）标记的羊抗鼠IgG均购自北京中山金桥生物技术有限公司。其它所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买产品。

1.3 标本来源 

急性早幼粒细胞白血病病人血（初诊）及正常人血皆由重庆医科大学附属第一医院提供，病人为18-35岁女性。正常人血来源于24岁男性。

实验步骤及结果

2.1原核表达NLS-RARα蛋白制备

蛋白的诱导表达与纯化：将原核表达质粒PET-His-NLS-RARα转化宿主菌BL21(DE3)，诱导温度为37℃，诱导时间4 h，IPTG 1 mmol/L，超声裂解，离心后分别取沉淀和上清电泳。纯化时采用镍柱亲和层析法进行非变性条件下纯化：溶菌酶+超声裂解法裂解细菌，5mmol/L咪唑浓度挂柱纯化，10mmol/L和20mmol/L洗涤，250mmol/L和300mmol/L洗脱。

Western blot鉴定蛋白：200 ng/孔纯化蛋白，12.5％的分离胶SDS-PAGE电泳，电泳后转至PVDF膜，封闭液封闭1 h（5％脱脂奶粉的TBST液），Anti-His抗体按1:1 000稀释4 ℃孵育过夜，二抗山羊鼠IgG按1:2000稀释，室温孵育1 h，最后应用ECL化学发光法显色。

检测及结果：采用丽春红膜染色和Western blot 对外源蛋白NLS-RARα进行检测，在37℃诱导条件下，转化PET-His-NLS-RARα质粒的菌株内检测到有外源蛋白NLS-RARα的表达，蛋白分子量大小61KDa，与预期分子量大小相符，而未经诱导组则检测不到相应蛋白的表达。检测结果见图1，图中代号为：A：丽春红染色；B：Western blot；M：蛋白marker；1：未诱导上清；2：未诱导沉淀；3：诱导组上清；4：诱导组沉淀；5：阴性对照组；6：阳性对照组。

2.2  NLS序列分析及免疫原的制备

NLS多肽制备：从Gene Bank中获取PML蛋白全长560个氨基酸，其中NLS序列位于476到490之间，其序列为CKRKCSQTQCPRKVIK。采用Fmoc固相合成法，在ABI-431A多肽合成仪上进行合成，使用HPLC进行纯化。

分析：采用DNAstar 软件对NLS序列进行分析，其中易形成二硫键，因此合成两条多肽，多肽信息见表1。 

表1 合成NLS多肽信息

Peptide1：CKRKCSQTQCPRKVIKPeptide2：CKRKCSQTQCPRKVIK

 注：有下划线的半胱氨酸（C）之间需要形成二硫键

2.3  制备多肽偶联复合体

采用戊二醛连接法将纯化后的多肽分别与KLH和BSA交联（NLS-KLH偶联复合体后续用作抗原，NLS-BSA偶联复合体用于检测）。即将5mg步骤2.2制备的NLS合成多肽分别加入7 mg KLH和BSA中，振荡并缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液（1 ml），室温2 h。以pH8.5 硼酸缓冲液透析过夜。

2.4  免疫小鼠制备抗体血清

以NLS-KLH偶联复合体做抗原，首次免疫用完全福式佐剂，充分乳化后腹腔注射，每只50ug多肽偶联产物，0.2ml/只。2周后加强免疫，采用不完全福式佐剂。分别在初次免疫2周后、末次免疫10天后取小鼠尾血，检测抗体效价。

2.5  ELISA 检测抗体效价

2.5.1  制备血清标本  

末次免疫10天，小鼠剪尾取血。从小鼠尾部吸取20μl 全血，立即加入含980μl PBS（0.01 mol/ L，pH7.4）的小离心管，轻轻混匀，离心1 500 r/min 5 min，收集全部上清，转入另一小试管，此为1:100 血清标本。平行处理阴性血清标本。

2.5.2  包被抗原、封闭、加入一抗二抗、显色

用包被液稀释NLS-BSA多肽偶联复合体1mg/L，100ul每孔加至酶标板，4℃过夜。去包被液，以PBS＋3%BSA封闭，每孔200 ul，37℃放置1.5 h。洗涤3次，500 ul洗液/次，拍干。将小鼠阳性血清做不同梯度稀释，37℃放置1h，洗涤三次，拍干。加入酶标二抗：Goat anti Mouse IgG (Fc 1+2a+2b+3)，以40％小牛血清和60％去离子水1：1000稀释，100 ul每孔，37℃放置1 h。洗涤3次，拍干。加底物TMB显色液，37℃避光显色15 ~20 m in后，加入2 mol/L硫酸终止反应。

2.5.3  酶标仪读数，490 nm波长测定OD值。

2.5.4  抗体效价检测

初次免疫2周后，取小鼠尾血制备抗体血清，运用ELISA方法检测抗体血清效价，NLS-KLH多肽免疫3只小鼠所获得的抗体血清效价均明显高于阴性对照。NLS-1-BSA及NLS-2-BSA都有信号，且NLS-1-BSA信号强于NLS-2-BSA。识别原核表达蛋白3只鼠都有信号，2号小鼠稍强，结果见表2和图2，表中数据与图中样品从左至右、由上往下依次对应。该检测条件为：包被：100ng/孔；一抗：小鼠尾血清；二抗：山羊抗鼠IgG；阴性对照：以5%milk-PBS为一抗；阳性对照：以Anti-His 6E2 为一抗，浓度5ug/ml。

加强免疫10天后，ELISA方法检测抗体血清效价，针对多肽信号明显增强，其中2号小鼠最强，结果见表3和图3，表中数据与图中样品从左至右、由上往下依次对应，检测条件同上。上述结果表明成功制备了针对PML蛋白NLS序列的多克隆抗体，由于2号小鼠的抗体效价最强，因此采用2号抗体血清用于后续检测。

表2 ELISA检测抗体效价（初次免疫）结果

备注：其中的*.***表示数值很高，大大大于其他测试数值。

表3 ELISA检测抗体效价（加强免疫）结果

 2.6  人外周血中性粒细胞的提取  

取2ml新鲜抗凝血，与PBS稀释液1:1混匀后，小心加于一份4ml人血中性粒细胞分离液之液面上，1800r/min，25min。此时离心管中由上至下细胞分四层，弃去第一层和第二层，收集第三层和第四层，放入含10ml的PBS的试管中，充分混匀后，以1800r/min 离心30min洗涤，去上清后加入3-5倍体积的红细胞裂解液，吹打混匀，反应2min后1800r/min 离心3min，然后再用PBS反复洗涤3次，离心后即为所需的中性粒细胞，可用于后续实验。

2.7  细胞转染  

按1×10⁶/孔接种293T细胞至六孔板中，待细胞长至80~90%融合时分别转染pCMV-HA-PML，pCMV-HA-PML(NLS-)和pCMV-HA-NLS-RARα。在6ul Lipofectamin 2000介导下转染3ug质粒DNA，6 h后，更换完全DMEM培养基，于37℃，5% CO2孵箱中继续培养48h。

2.8  Western blot验证抗体特异性  

转染48h后，收集细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，用BCA法定量，分别取50μg蛋白，进行10%SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h后，加入抗体血清（1:1000稀释），4℃12h。以购买自Abcam兔抗人PML多抗作为阳性对照，洗膜：用TBST洗2次，每次10min，再用TBS洗10min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：2000稀释），37℃孵育1 h，然后洗膜（步骤同上），于暗室化学发光显影成像。

Western blot结果显示，真核表达质粒PCMV-HA-PML，PCMV-HA-PML(NLS-)和PCMV-HA-NLS-RARα均成功表达，分子量大小分别为70KDa，52KDa和61KDa，应用抗NLS抗体（2号抗体血清）则在转染PCMV-HA-PML组70KDa处有明显的条带，而在转染PCMV-HA-PML(NLS-)和PCMV-HA-NLS-RARα组均未出现相应分子大小的条带；阳性对照组分别在转染PCMV-HA-PML和PCMV-HA-PML(NLS-)组70KDa和52KDa处出现相应的条带，见图4。上述结果表明在真核表达层面，抗NLS抗体能够成功检测PML蛋白，由于PML(NLS-)缺失NLS而无法指示，从而成功将PML和PML(NLS-)区别开来。另外，应用抗NLS抗体能够成功区别检测PML于PML(NLS-)，但是却未能检测NLS-RARα，分析其原因主要是因为用于ELISA分析检测原的NLS-RARα蛋白为原核表达与真核表达的NLS-RARα蛋白结构上存在差异，由于真核表达的NLA-RARα针对NLS的抗原识别位点被覆盖了没有暴露于表面因此不能检测。

2.9  间接免疫荧光验证抗体特异性  

制备细胞爬片：转染前12h，将293T细胞按1×10⁵/孔铺于24孔板中，转染48h后，弃去培养基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次；再用0.1% Triton透膜处理10 min。10%山羊血清室温封闭30 min，加上抗体血清(封闭血清1:200)，4℃过夜，PBS洗3次，加TRITC标记的山羊抗鼠荧光二抗(封闭血清1:200)，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min，PBS漂洗3次，用70%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。以购买自Abcam兔抗人PML多抗作为阳性对照，二抗使用FITC标记的山羊抗鼠荧光二抗。

结果：

过表达PML蛋白免疫荧光结果显示，应用所制备抗NLS抗体检测过表达PML蛋白(红色指示)主要定位于胞核呈斑块状分布，这一结果与阳性对照组（绿色）相同，见图5中A；PML(NLS-)蛋白则主要在胞浆表达而应用抗NLS抗体组则无明显红色荧光，见图5中B。这一结果表明，间接免疫荧光检测PML和PML(NLS-)胞内定位，在过表达PML293t细胞和正常人中性粒细胞中，应用抗NLS抗体和抗PML抗体结果一致，PML蛋白均定位与胞核，呈斑点状分布；而在过表达PML(NLS-)293t细胞中，应用抗PML抗体指示目标蛋白主要定位于胞浆，而抗NLS则不能检测目标蛋白。

同时，比较正常人与M3型病人中性粒细胞免疫荧光结果显示，正常人中性粒细胞核（蓝色）呈明显分叶状，M3型病人由于粒细胞分化阻滞在早幼粒细胞阶段，因此胞核主要呈单个核状。抗NLS抗体检测正常人中性粒细胞中PML蛋白（红色）主要定位与胞核呈斑点状分布，这一结果与阳性对照组（绿色）相同，见图6中A；在APL病人中性粒细胞中，PML蛋白主要定位于胞浆呈弥散状分布，而应用抗NLS抗体则指示胞核有红色荧光，胞浆无明显红色荧光，见图6中B。这一结果表明，在M3型病人中性粒细胞中，应用抗PML抗体指示目标蛋白主要定位于胞浆，而抗NLS抗体则集中定位与胞核。说明抗NLS抗体能够应用于免疫荧光，区别检测PML和PML(NLS-)蛋白，并有效区分正常人和M3型病人外周血中性粒细胞中PML蛋白的定位。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆医科大学附属永川医院

 

<120>抗PML蛋白核定位信号抗体的制备及其在APL诊断中的应用

 

<160> 1

 

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223>NLS序列

 

<400> 1

Cys Lys Arg Lys Cys Ser Gln Thr Gln Cys Pro Arg Lys Val Ile Lys

1                         5                            10                         15