美国癌症数据库化合物在抗艾滋病毒1型蛋白酶活性上的新用途

摘要

本发明涉及美国癌症数据库NCI(National Cancer Institute)的化合物的新用途，更具体地说，涉及编号NSC111887和NSC121217化合物在抗艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性的新用途。本发明通过整合现有的抗HIV-1蛋白酶药物和抑制剂数据、计算模拟和体外化合物筛选方法，首次找到具有三肽衍生物结构特点的NSC111887和NSC121217化合物分子，具有一定抗HIV-1蛋白酶活性的能力，半抑制浓度分别为62μM和162μM。

说明书

技术领域

本发明涉及美国癌症数据库(NCI)化合物在抗艾滋病毒1蛋白酶(HIV-1Protease)活性上的新用途。 

背景技术

艾滋病极大威胁着人类健康，全球现有200多万年龄在10岁和19岁之间的青少年携带艾滋病病毒，由于缺乏有效的、可接受的支持服务，使青少年群体报告发生的与艾滋病相关的死亡数上升了50％，而且HIV具有高变异性，其耐药性和药物毒副作用等问题日趋严重，抗艾滋病研究在当今生命科学领域具有重大意义。 

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)蛋白酶是HIV-1基因组复制过程中的关键酶之一，因此成为抗HIV-1药物研究的重要靶点。HIV-1蛋白酶作用于未成熟多聚蛋白的gag和gag-pol位点从而将多蛋白加工形成具有侵染性的病毒核心的结构蛋白等成熟蛋白，是病毒成熟过程中所必需的结构和功能蛋白，在病毒生命周期中起关键的作用。HIV-1蛋白酶抑制剂(PI)作用于HIV病毒蛋白酶，使HIV病毒在被感染的细胞中无法生成成熟的具有感染性的病毒颗粒，因而成为AIDS患者中的抗病毒治疗的有希望的治疗目标。 

艾滋病毒1蛋白酶(HIV-1Protease)属于逆转录病毒天冬氨酸蛋白酶(retroviral aspartyl protease)家属成员之一。分子量为10～12KD，由两条均含有99个氨基酸的肽链组成的C2同源二聚体，其活性中心由位于对称亚基间空腔底物两个天冬氨酸催化残基(Asp25/Asp25’)和结合腔顶部的相互靠近的两个柔性挡板上的异亮氨酸残基(Ile50/Ile50’)组成。没有底物与HIV-1蛋白酶结合时，HIV-1蛋白酶是动态的，两个柔性挡板是开放的。当底物与HIV—1蛋白酶结合后，两个柔性挡板闭合，Ile50/Ile50'残基与底物通过水分子介导或直接形成氢键结合。 

HIV-1蛋白酶抑制剂(PIs)是治疗感染有人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者的有效的抗逆转录病毒药。经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的HIV-1蛋白酶抑制剂有9种，沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、胺普那韦、罗匹那韦、阿扎那韦、替拉那韦和达芦那韦。HIV-1蛋白酶抑制剂是目前所报道的最有效的抗AIDS药物，也是高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)的主要成分。临床上抗HIV-1蛋白酶药物(除替拉那韦外)多以HIV—1PR切割HIV前提蛋白上的位点序列为蓝本，根据过渡态模拟概念而被开发，并含有作为模 拟HIV-1蛋白酶底物过渡态的核心支架的多种不可裂解的二肽等排体，设计并合成一系列个别位点突变的拟肽类分子，拟肽类分子可与HIV-1PR结合，但不被蛋白酶水解，从而产生竞争性抑制作用。 

但HIV-1蛋白酶易突变而出现耐药和交叉耐药性问题，是抗病毒治疗失败的主要因素。通常，在药物存在下，靶蛋白中的突变使蛋白保留原有的功能时，就会出现耐药性，当蛋白酶抑制剂存在的情况下，HIV-1蛋白酶至少在9个不同位置上裂解Gal和Pol多肽，使病毒突变从而出现耐药性。在接受治疗的HIV患者中耐药病毒突变体的相对快速的出现可归因于病毒的高速复制，以及HIV逆转录酶的失真导致的高度的内在突变速度。因此发展抗HIV-1蛋白酶耐药株的新型蛋白酶抑制剂，对目前的蛋白酶耐药性HIV-1毒株更有活性的药物成为抗艾滋病药物研究的主要方向。 

NSC111887化合物(methyl N-[(benzyloxy)carbonyl]serylphenylalanylleucinate)来自于美国癌症数据库(National Cancer Institute)，编号NSC111887化合物目前被用来体内抗肿瘤活性筛选，其中用于筛选的肿瘤模型包括rad50strain、mec2—1strain、sgs1mgt1strain、cln2rad14strain、bub3strain、mlh1rad18strain和L1210白血病(B6D2F1(BDF1)老鼠)。并且Pubchem实验数据证实NSC111887化合物对上述几种癌症均无活性抑制作用。本发明通过整合现有抗HIV-1蛋白酶药物和抑制剂数据、计算模型和体外化合物筛选，首次发现NSC111887具有抑制HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制浓度IC50为62μM。 

NSC121217化合物(methyl n-[(benzyloxy)carbonyl]serylleucyltyrosinate)来自于美国癌症数据库(National Cancer Institute)，该化合物目前被用来体内抗肿瘤活性筛选，但没有数据显示该化合物对某类肿瘤具有抑制作用。本发明通过整合现有抗HIV-1蛋白酶药物和抑制剂数据、计算模型和体外化合物筛选，首次发现NSC121217化合物具有一定的抗HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制浓度IC50为162μM。 

发明内容

本发明的目的是提供来自于美国癌症数据库(National Cancer Institute)的NSC111887(methyl N-[(benzyloxy)carbonyl]serylphenylalanylleucinate)，NSC121217(methyl n-[(benzyloxy)carbonyl]serylleucyl tyrosinate)分子具有一定的抑制HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制浓度IC50分别为62μM和162μM。 

本发明的NSC111887(methyl N-[(benzyloxy)carbonyl]serylphenylalanylleucinate)化合物结构如下图1所示： 

NSC111887分子式：C27H35N307。 

NSC111887分子量：514。 

NSC111887化合物是一个三肽衍生物，含有三个肽键，一个自由羟基，分子两端含有疏水性的苄基和异丁基结构，同时分子结构中部含有一个S构型的手性碳，手性碳上连有一个苄基基团。 

NSC111887化合物对HIV-1蛋白酶靶点的不同浓度下的抑制率曲线如下图2所示： 

NSC111887化合物能够与底物分子竞争性结合艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性口袋，从而占据结合位点，但该化合物不被HIV-1蛋白酶水解，进而产生竞争性抑制作用，使得HIV-1蛋白酶无法水解底物物质。 

NSC111887化合物显示出一定的抗HIV-1蛋白酶活性的作用，其抗HIV-1蛋白酶活性的作用是通过自身的分子结构特点决定的。NSC111887结构中羟基基团与HIV-1蛋白酶活性口袋内催化残基Asp25形成氢键作用，是发挥抗HIV-1蛋白酶活性的关键性因素。NSC111887分子骨架上的酰胺键上羰基能够与HIV-1蛋白酶结合腔顶部的Ile50/Ile50’形成分子间氢键作用，两个柔性挡板相互靠近，进而使HIV-1蛋白酶结构呈现闭合状态。苄基基团插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，从而加强了化合物NSC111887与HIV-1蛋白酶间的亲和力。 

本发明的NSC121217(methyl n-[(benzyloxy)carbonyl]serylleucyltyrosinate)化合物结构如下图3所示： 

NSC121217分子式：C27H35N3O8。 

NSC121217分子量：530。 

NSC121217化合物是一个三肽衍生物，含有三个肽键，一个自由羟基，分子两端分别含有疏水性的苄基和一个亲水性的苯酚结构，同时分子结构中部含有一个S构型的手性碳，手性碳上连有一个异丁基。 

NSC121217化合物对HIV-1蛋白酶靶点的不同浓度下的抑制率曲线如下图4所示： 

NSC121217化合物能够与底物分子竞争性结合艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性口袋，从而占据结合位点，但该化合物不被HIV-1蛋白酶水解，进而产生竞争性抑制作用，使得HIV-1蛋白酶无法水解底物物质。 

NSC121217化合物显示出一定的抗HIV-1蛋白酶活性的作用，其抗HIV-1蛋白酶活性的作用是通过自身的分子结构特点决定的。NSC121217结构中羟基基团与HIV-1蛋白酶活性口袋内催化残基Asp25形成氢键作用，是发挥抗HIV-1蛋白酶活性的关键性因素。NSC121217分子骨架上的酰胺键上羰基能够与HIV-1蛋白酶结合腔顶部的Ile50形成分子间氢键作用，两 个柔性挡板相互靠近，进而使HIV-1蛋白酶结构呈现闭合状态。另外，NSC121217结构中异丁基插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，从而加强了化合物NSC121217与HIV-1蛋白酶间的亲和力。 

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。 

本研究利用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理，在HIV-1蛋白酶底物两端分别偶联2个荧光探针供体和受体作为FRET对，即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体(donor)到覆盖供体波长的受体(acceptor)，使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭。底物在艾滋病毒1蛋白酶的作用下，在酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)残基处切离，淬灭基团与荧光发光基团分离，释放出强烈荧光的供体，在荧光酶标仪下(激发波长490nm，散发波长530nm)，来定量检测HIV-1蛋白酶的活性。 

FRET多肽底物来源于HIV-1蛋白酶prgag的p17/p24裂解位点，底物浓度为100μM。阳性对照物胃酶抑素A(Pepstatin A)是一个五肽衍生物，分子量为686，IC50值为1.1μM。蛋白酶浓度为0.25mg/ml，蛋白酶溶液成分：20mM acetate，200mM NaCl，1mM EDTA，0.5mM DTT，PH5.0.10％glycerol。 

1.实验前，取出-20℃冰箱里的试剂(HIV-1Protease和HIV-1Substrate)置入冰槽里 

2.荧光酶标仪温度设置为25℃，激发波长为490nm，散发波长530nm。 

3.在黑色96孔板上做好相应标记：零抑制对照、完全抑制对照和待测抑制剂样品NSC111887和NSC121217，并做复孔。 

4.用溶剂DMSO将化合物NSC111887和NSC121217依次稀释成以下浓度：0.1μM，1.0μM，3μM，10μM，30μM，100μM，300μM，1mM。 

5.避光环境下，取1μl HIV-1底物液和0.2μl的HIV-1蛋白酶液和100μl的缓冲液加到步骤3中带有标记的黑色96孔板每孔中。 

6.分别取4μl步骤4中不同浓度的化合物NSC111887和NSC121217相应加到标记为不同浓度待测抑制剂样品的黑色96孔板每孔中，每个浓度做两个复孔。 

7.取4μl阳性对照抑制剂(PepstatinA)加到标记为完全抑制对照的黑色96孔板中，做两个复孔。 

8.取相应剂量4μl的去离子水加到标记为零抑制对照孔的黑色96孔板中，做两个复孔。 

9.轻轻混匀，即刻将96孔板放进荧光酶标仪检测，获得相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit)，每10分钟读数一次，收集60min内的荧光读数。 

10.相对荧光读数RFU值越高，表明酶活性越高；相反，相对荧光读数RFU值越低，表明酶活性被抑制的程度越大。 

11.抑制率计算公式： 

抑制率＝(阴性对照孔信号值-待测样品孔信号值)/(阴性对照孔信号值-阳性样品孔信号值)。 

根据蛋白酶与不同浓度底物反应的荧光强度，计算各浓度的抑制率并绘制出该化合物对蛋白酶活性的抑制率曲线，并计算得到该化合物对蛋白酶的半抑制浓度IC50值。