一株高耐性酵母菌株及其构建方法

摘要

本发明公开了一种耐高温、耐高糖、耐冷冻的高耐性酵母菌株及其构建方法，所述高耐性酵母菌株通过在亲本酵母菌株中，选用强启动子PGK1过表达H/ACA小核仁RNA(SNR84)全序列，来获得该高耐性酵母菌株。该菌株在高温、高糖和冷冻环境中其细胞活性较亲本菌株均有显著提高。该面包酵母在热激处理中的抗高温能力强，高糖面团中的抗高糖能力强，冷冻面团中的抗冷冻能力强，解决了面包制作过程中的技术障碍和质量缺陷，有广泛的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是一种耐高温、耐高糖、 耐冷冻的高耐性酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

面包酵母是面食制作过程中必不可少的微生物发酵剂和疏松剂，同时酵母也是一种生物 营养剂，可以增加面团的营养成分。随着烘焙产业的发展，各种面团技术应运而生，良好的 酵母品种是面包品质的重要保证。但是，在面包烘培过程中，面包酵母常常处于高温、高糖、 冷冻等环境中，不良的生长环境将导致面包酵母活性的下降，从而导致面包品质的下降。烘 培者一般选取耐高温、耐高糖、耐冷冻的面包酵母投入使用，以期适应各种面团制作技术， 获得较高品质的面包产品。

面包酵母的高温耐受性是面包酵母质量的重要指标之一。酵母的高温耐受性主要指面包 酵母在烘焙过程中对高温(>50℃)的适应性。烘烤面包是面包制作的一个关键环节，主要采 用的设备是远红外烤炉。面团升温至50℃之前有一个旺盛的产气过程，随着温度的继续升高， 气体冲破面筋网络的包围而溢出形成面包最初的疏松结构，面包酵母在此过程中活性逐渐降 低直至死亡。为了获得较高的产气量，必须维持高温下酵母细胞的活性。因此，选育耐热性 酵母菌株可以解决这一烘焙技术问题，推动烘焙产业的发展，为烘培食品行业带来巨大的经 济效益。

面包酵母的高糖耐受性是面包酵母质量的另一重要指标。酵母的高糖耐受性主要指面包 酵母对面团中高浓度的蔗糖的适应性。当蔗糖含量超过6％时，高浓的糖浓度破坏酵母细胞， 抑制酵母菌呼吸作用相关酶的活性，使得葡萄糖的分解受阻，从而影响酵母的产气速率。传 统面包制作一般采用加大酵母用量的方法，但这无疑提高了甜面包的制作成本，同时残留在 面包里的酵母也对面包的风味有一定的影响。因此，为了降低甜面包的制作成本，保持面包 的风味，必须提高酵母对高糖的耐性。耐高糖酵母菌株的选育为甜面包产品的获得和相关食 品产业的发展提供了重要途径。

冷冻面团技术是面包生产的一种新工艺，是将面包制作过程的两个工艺(面团制作、烘 烤)相分离的过程。与传统面包制作法相比，冷冻面团法具有生产效率高、面包质量稳定、 方便快捷等优点，但同时也对面包酵母的耐冷冻性提出了更高的要求。面团冷冻时，温度一 般为-18～-20℃，面团中的酵母在冷冻、冻藏和解冻过程中都会受到严重伤害，尤其是发酵后 的面团经过冷冻工序后，酵母的存活率和产气能力显著下降。普通面包酵母冻存20天后，其 活力下降一半以上，导致解冻后的面团膨胀不足，醒发时间延长，且成品面包体积小、结构 粗糙、口感差，产品质量明显下降。正是这些缺陷的存在，限制了冷冻面团技术的发展。因 此，选育耐冷冻面包酵母可解决冷冻面团技术的发展瓶颈，推动冷冻面团技术在国内的发展。

Nakagawa等利用杂交技术得到发酵性能良好的耐冷冻酵母菌株，其在不加糖面团和甜面 团中均能够保持较高活力。Cakar等通过乙基甲磺酸化学诱变的方法，筛选得到耐高温耐冷冻 酵母菌株，其冷冻耐性和高温耐性较出发菌株分别提高了102倍和89倍。Sasano等通过调节 POG1的表达水平来提高面包酵母细胞在各种环境条件下的耐受性以及发酵性能，但是不能 达到酵母细胞高糖耐性和冷冻耐性同时提高。

在我国，对于酵母耐高温、耐高糖、耐冷冻机制和菌种选育的研究较少，不仅制约了酵 母工业的发展，同时也制约了相关面团技术等在我国的推广应用。

SNR84基因编码H/ACA snoRNA(小核仁RNA)。大部分H/ACA小核仁RNA参与碱基 修饰，像大亚基rRNA的假尿苷化，指定rRNA中假尿苷的形成位点；小部分H/ACA小核仁 RNA在剪切前体rRNA中也起到重要作用。据推测，SNR84参与到激活大亚基rRNA假尿苷 化的功能，加快大亚基rRNA的成熟速率和提高大亚基rRNA的数量。当成熟的大亚基rRNA 在指数生长期快速形成时，大部分相关酶的产率提高。Lee等以半乳糖为碳源，通过过表达 SNR84基因提高了酿酒酵母在半乳糖中的生长及酒精产量。

同时，目前对于H/ACA小核仁RNA的研究基本上集中在理论研究，关于H/ACA小核 仁RNA的应用仅有少数报道，尤其在选育耐性菌株中的研究更是空白。因此，本发明通过过 表达SNR84基因编码的H/ACA snoRNA，选育耐高温、耐高糖、耐冷冻酵母菌株，在拓宽 H/ACA小核仁RNA的应用的同时满足酵母应用相关领域对酵母的较高要求。

发明内容：

本发明所解决的技术问题之一是提供一株耐高温、耐高糖、耐冷冻的高耐性酵母菌株。

所述高耐性酵母菌株是在出发酵母菌株中过表达由SNR84基因编码的H/ACA小核仁 RNA全序列所得。

所述SNR84基因的Gene ID为：9164879，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示。

优选的，所述出发酵母菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。

本发明所解决的另一个技术问题是提供一种耐高温、耐高糖、耐冷冻的高耐性酵母菌株 的构建方法，包括如下步骤：

(1)以面包酵母CICC31616总DNA为模板，PCR扩增SNR84基因；

(2)将PCR产物连接到含有酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)强启动子的质粒 上，获得重组质粒1；

(3)以重组质粒1为模板，通过PCR扩增获得SNR84基因和强启动子的连接片段；

(4)将步骤(3)获得的片段连接到带有KanMX抗性的载体上，得到重组质粒2；

(5)将步骤(4)获得的重组质粒导入出发酵母菌株中，并通过G418抗性筛选获得重 组菌株。

所述含有PGK1强启动子的质粒优选pUC质粒；

所述带有KanMX抗性的载体优选Yep352载体；

所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616，是一株保存于中国工业微生物 菌种保藏管理中心的菌株，公众可通过购买获得。

所述重组菌株可通过上述方法构建，也可以用其他分子生物学手段获得。这些方法已有 许多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

本发明所述的面包酵母重组菌株，其在高温(52℃)热激2min后的细胞存活率较亲本菌 株提高280％；在高糖(30％蔗糖)面团中培养2h后的细胞存活率较亲本菌株提高29％；在 -20℃冷冻7d后，不加糖面团中细胞存活率和相对发酵力分别较亲本菌株提高107％和38％， 高糖面团中细胞存活率和相对发酵力分别较亲本菌株提高100％和21％。

有益效果：

1、本发明提供一种既适合于高糖面团又适合于冷冻面团发酵且在高温烘焙中保持较高活 性的耐高温、耐高糖、耐冷冻的高耐性酵母菌株，克服了普通面包酵母高温耐性、高糖耐性 和冷冻耐性差的不足。

2、本耐高温、耐高糖、耐冷冻酵母是在保持优良基本发酵性能的前提下，高温热激后， 能够保持较高的细胞存活能力；在面团中拥有良好的抗高糖、抗冷冻能力，解决了高糖面团、 冷冻面团面包制作过程中的技术障碍和质量缺陷，提高了我国烘焙食品工业的生产技术水平， 对促进我国酵母工业的发展和相关面团技术的推广应用具有重要意义。

3、本发明所述的高耐性酵母菌株是通过过表达由SNR84基因编码的H/ACA小核仁RNA 全序列所得，是对H/ACA小核仁RNA的创造性运用，为其理论研究和应用研究开辟了新的 领域。

4、选育得到的菌株对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用， 因而有广泛的应用前景，必将带动我国焙烤食品行业、馒头产业和零售行业的发展。

附图说明：

图1为Yep-KPS质粒构建过程；

图2重组质粒Yep-KPS的PCR验证

其中：(a)中M为marker；1为以Yep-KPS为模板，PCR扩增SNR84片段

      (b)中M为marker；1为以Yep-KPS为模板，PCR扩增片段PS；

图3过表达SNR84基因的重组菌株的验证

其中：M为marker；1为以重组菌株的酵母质粒为模板，PCR扩增PS片段；2为 以出发菌CICC31616酵母质粒为模板，PCR扩增PS片段。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种耐高温、耐高糖、耐冷冻的高耐性酵母及其 选育方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：耐高温、耐高糖、耐冷冻面包酵母菌株的构建

(1)重组质粒Yep-KPS的构建

重组质粒Yep-KPS的构建流程如图1所示；

以酵母菌株CICC31616总DNA为模板，PCR扩增SNR84基因全序列；

上游引物S1：5’-GGAAGATCTATTGCACAACTTAAGTTTGTCGAGG-3’(SEQ ID NO:2)；

下游引物S2：5’-GGAAGATCTTAATGTGTCTCTTTGAGTCATGTTCCTT-3’(SEQ ID  NO:3)；划线部分为酶切位点；

PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，54℃1min，72℃40s，30个循环；72℃10min， 0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到含有强启动子的pUC-PGK1载体上，得到pUC-PGKS；以pUC-PGKS 为模板，PCR扩增得到插入SNR84基因的PGK_P-SNR84-PGK_T(PS)片段；

上游引物PS1：5’-CCCAAGCTTTCTAACTGATCTATCCAAAACTGA-3’(SEQ ID NO:4)；

下游引物PS2：5’-CCCAAGCTTTAACGAACGCAGAATTTTC-3’(SEQ ID NO:5)；

划线部分为酶切位点；

PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，60℃1min，72℃140s，30个循环；72℃10 min。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

将片段PS连接到带有KanMX抗性的Yep352-K载体上，得到重组质粒Yep-KPS。

PCR验证结果如图2所示。

(2)重组菌株的构建

通过醋酸锂转化的方法将重组质粒Yep-KPS导入面包酵母出发菌株CICC31616，通过 G418抗性筛选重组子进行PCR验证，即以转化子的酵母质粒为模板扩增PS片段，可得到 2200bp左右的条带，而出发菌株则不能扩增得到该片段，PCR验证结果如图3所示。结果表 明，在酵母细胞中实现了强启动子PGK1过表达SNR84基因全序列。

实施例2：耐高温、耐高糖、耐冷冻面包酵母菌株发酵实验

(1)重组菌株与出发菌株的高温耐性实验

挑取一环酵母细胞于YEPD液体培养基中培养至指数期(OD₆₆₀＝1–1.5)；将细胞转接入 5mL新鲜YEPD液体培养基，用YEPD液体培养基调整细胞OD₆₀₀＝1.0后取200μL细胞培 养液至1.5mL离心管内，52℃水浴热激2min，立即冰浴。待细胞冷却后，取50μL细胞培 养物稀释至一定浓度，同时将未热激的酵母细胞稀释相同倍数，分别涂布于YEPD平板中培 养2d，计数单菌落个数，分别记作u₁、u₂。高温下细胞存活率(％)＝(u₁/u₂)×100％。

(2)重组菌株与出发菌株的高糖耐性实验

挑取一环酵母细胞于YEPD培养基中，30℃，静置培养24h；以10％(v/v)的接种量转 入糖蜜培养基(糖度为10～12Brix的糖蜜中添加0.5g/L硫酸铵、5g/L酵母粉)中，30℃， 180r/min，培养24h至稳定期(OD₆₀₀为1.5左右)；静置培养2h，在4000r/min下，离心5min， 无菌水洗涤两次后收集菌体备用。将上述离心收集得到的酵母按1.5％(m/v)的接种量接到 高糖模拟面团培养基(300g/L蔗糖、2.5g/L硫酸铵，5g/L尿素，16g/L磷酸二氢钾，5g/L磷 酸氢二钠，0.6g/L硫酸镁，22.5mg/L烟酸，5.0mg/L泛酸，2.5mg/L维生素B1，1.25mg/L维 生素B6，1.0mg/L维生素B2，0.5mg/L叶酸)，30℃，静置培养2h。取1mL细胞培养液稀 释至一定浓度；同时将接入到高糖模拟面团培养基(30％蔗糖)未经培养的细胞稀释相同倍 数，涂布于YEPD平板中培养2d，计数单菌落个数，分别记作u₃、u₄。高糖下细胞存活率(％) ＝(u₃/u₄)×100％。

(3)重组菌株与出发菌株的冷冻耐性实验

挑取一环酵母细胞于YEPD培养基中，30℃，静置培养24h；以10％(v/v)的接种量转 入糖蜜培养基(糖度为10～12Brix的糖蜜中添加0.5g/L硫酸铵、5g/L酵母粉)中，30℃， 180r/min，培养24h至稳定期(OD₆₀₀为1.5左右)；静置培养2h，在4000r/min下，离心5min， 无菌水洗涤两次后收集菌体备用。

将上述离心收集得到的酵母按1.5％(m/v)的接种量分别接到低糖模拟面团培养基(40％ 葡萄糖)和高糖模拟面团培养基(30％蔗糖)，立即分别取1mL细胞培养液于-20℃冷冻。7d 后，将细胞培养物于30℃解冻30min。取100μL冷冻细胞液稀释至10^-4；同时将未冷冻的细 胞培养物稀释相同倍数，涂布于YEPD平板中培养2d，计数单菌落个数。低糖模拟面团培养 基中冷冻前后单菌落个数分别记作u₅、u₆；高糖模拟面团培养基中冷冻前后单菌落个数分别 记作u₇、u₈。不加糖冷冻细胞存活率(％)＝(u₆/u₅)×100％；高糖冷冻细胞存活率(％)＝ (u₈/u₇)×100％。

称取上述离心收集得到的酵母9.0g，与4.0g Nacl、150mL水、280g标准面粉混合后， 放入预热的发酵仪中进行发酵。30℃下预发酵1h后，称取50g面团于-20℃冷冻7d后，于 30℃解冻30min。将解冻后面团放入发酵仪继续发酵，记录2h CO₂产气量为v₁；同时，记 录相同质量(50g)未经冷冻面团2h CO₂产气量，记作v₂。不加糖冷冻相对发酵力(％)＝ (v₁/v₂)×100％。

称取上述离心收集得到的酵母9.0g，与44.8g蔗糖、2.8g Nacl、130mL水、280g标准 面粉混合后，放入发酵仪中进行发酵。30℃下预发酵2h后，称取50g面团于-20℃冷冻7d 后，于30℃解冻30min。将解冻后面团放入发酵仪继续发酵，记录2h CO₂产气量为v₃；同 时，记录相同质量(50g)未经冷冻面团2h CO₂产气量，记作v₄。高糖冷冻相对发酵力(％) ＝(v₃/v₄)×100％。

(4)重组菌株与出发菌株的耐性实验结果

出发菌株及重组菌株耐性实验结果见表1。结果显示，在不同处理条件下，与出发菌株 相比，重组菌株表现出较强的细胞活性和较高的面团发酵力。重组菌株的高温、高糖、不加 糖冷冻以及高糖冷冻细胞存活率较亲本菌株分别提高了280％、29％、107％、100％。面团冷 冻后，重组菌株的无糖冷冻以及高糖冷冻相对发酵力较亲本菌株分别提高38％、21％。由结 果看出，SNR84基因的过表达可提高酵母细胞在高温、高糖和冷冻处理后的细胞存活能力， 从而提高面团发酵力。

表1亲本菌株及转化子细胞存活率及发酵力

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。