一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法

摘要

本发明涉及物种鉴别及鉴定技术，具体说是用于鉴别贝类两种近缘物种或其杂交后代的鉴定方法。利用细胞核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。本方法从样品准备到获得结果只需要半天时间即可，且多数时候是在机器中运行，不需要繁琐的实验操作。由于采用溶解曲线的方法呈现，不同的峰形代表不同的序列特征，因此可以直观的判断结果。采用本发明所获得的结果是通过遗传物质DNA所获得的结果，无论国内国际同行或专家都是认可相关数据的。而采用普通的表型鉴定的方法来确定物种名称以及是否为杂交后代都很难让人信服。

说明书

技术领域

本发明涉及物种鉴别及鉴定技术，具体说是用于鉴别贝类两种近缘物 种或其杂交后代的鉴定方法。

技术背景

中国沿海贝类种类繁多，分类复杂。一些经济贝类的研究已经有了一 定的基础，其中一些通过外部形态难鉴定的贝类也从分子生物学的水平进 行了深入研究。但是由于受到技术手段的限制，这些专业的知识很难应用 到实际生产和研究等实践中。很多近缘物种共同生活在一起，仍然难以通 过外形准确判断和鉴别。近年来，科学家发明了很多新的技术通过遗传物 质对贝类进行物种鉴定。遗传物质包括COI，16S rDNA等线粒体基因，鉴 定技术包括PCR，RFLP等。然而遗传物质分为线粒体和细胞核两部分， COI，16S rDNA等线粒体基因在应用中有一定的限制性，比如无法用于准 确追踪遗传物质是否来源与双亲并鉴定杂交后代等。而传统方法仅通过 PCR产物和琼脂糖凝胶电泳的方法判断结果，通过这些方法获得的不同物 种的结果差异太小，经常需要已知的确切物种作为对照。随着牡蛎基因组 测序的完成，贝类性状的分子解析工作进展迅速，但是对于贝类物种鉴定 技术仍然不能满足严谨的科学实验要求。同时，物种不明确，对于当地渔 民或管理部门充分利用和保护当地生物资源造成障碍，也难以通过确切的 技术手段检测外来入侵生物与本地物种是否存在杂交现象，造成物种资源 的破坏。在此背景下，需要继续开发精确快捷的鉴定技术以满足现在的需 求。

发明内容

本发明旨在提供一种准确、快速、经济、适用范围广泛的鉴别贝类两 种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法。克服现存贝类物种鉴定方法中繁琐、 耗时、花费高以及准确度差的缺点。

为解决以上问题本发明提供以下技术方案：

一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法，利用细胞 核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线（High  Resolution Melting，HRM）方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。

鉴别近缘物种的具体步骤为：

1）根据多个目标个体的表征确定目标个体是否属于待定的两种近缘物 种并确定它们所属近缘物种的种类，

若目标个体表型不同，则直接鉴别为不同物种，若表型相同或相近， 则分析它们所属近缘物种的种类A或B，

2）提取每个目标个体的DNA作为模板；

3）根据核酸数据库中A和B的细胞核DNA条形码基因，进行序列比 对，判断其序列差异,选择存在单核苷酸多态性SNP或插入缺失多态性InDel 的区域，在该区域两侧序列保守的位置设计一对引物；同时预测引物间的 PCR扩增序列信息，并对DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物；

4）根据预测的引物间的PCR扩增序列信息通过公式计算两种近缘物种 扩增序列熔点的高与低：t=2×(A+T)+4×(G+C)；计算得出A和B的t值， 计为t_A和t_B，比较t_A和t_B的大小；

5）将扩增产物进行HRM检测，将得到的荧光信号转化成熔解曲线， 以温度作为横坐标，荧光强度的变化率为纵坐标得到熔解曲线；

6）根据得到的曲线表型将多个目标个体分为两类，其熔解曲线最高点 所对应的横坐标即为Tm值，计为T₁和T₂；

7）将Tm值的比较结果同t_A和t_B的比较结果进行对比，若t_A>t_B，则 Tm值较大的样品属于A物种；若t_A<t_B，则Tm值较大的样品属于B物种。

所述序列比对是利用NCBI的在线序列比对服务或者ClustalX软件查 找两物种序列的差异。

所述细胞核内的DNA条形码基因为核糖体基因内转录间隔区ITS基因 序列。

所述用于鉴定贝类两种近缘物种杂交后代的方法

1）将两个近缘物种杂交后所得杂交后代提取目标个体的DNA作为模 板；

2）根据核酸数据库中两个纯种亲代的细胞核DNA条形码基因，进行 序列比对，判断其序列差异,选择存在单核苷酸多态性SNP或插入缺失多态 性InDel的区域，在该区域两侧序列保守的位置设计一对引物，以亲代设计 的一对引物为其后代的引物，进行PCR扩增；

3）将扩增产物进行HRM检测；将得到的荧光信号转化成熔解曲线与 亲代得到的熔解曲线作对比；

4）根据检测得到曲线的Tm峰值为2个，确定其为杂交后代，所得曲 线的Tm与两个亲代的Tm相对应，即确定其为两个亲代物种的杂交后代。

所述目标个体的DNA模板采用水煮法获得后即可使用。

所述水煮法是将目标个体的单个幼虫或小于0.2mm直径的组织样品放 入含有10-20μl灭菌超纯水的PCR管中，在PCR仪（Bioer，日本）上95℃ 加热30min，冷却至室温后即可置于-20℃冰箱中保存待用。

所述近缘物种是指隶属于同一个属，亲缘关系接近，表型相同或相近， 从表型上看容易混淆不易分清，难以通过表型明确鉴别的不同物种。

本发明依靠来源于细胞核的核酸序列在物种间存在稳定的SNP或 InDel差别而进行物种鉴定，并引入高分辨率熔解曲线方法直观的表现出这 一差异，使得检测结果更加准确、易读，并基于父母本双方的核基因可以 同时遗传给杂交后代的原理而建立一套用于鉴定不同物种间杂交后代的技 术平台。

本发明所具有的优点：

1.方法简便：本方法从样品准备到获得结果只需要半天时间即 可，且多数时候是在机器中运行，不需要繁琐的实验操作。

2.结果直观：由于采用溶解曲线的方法呈现，不同的峰形代表 不同的序列特征，因此可以直观的判断结果。

3.灵敏准确：所使用的模板DNA可以不经过氯仿法等传统耗时 的方法，而是采用直接用水煮沸的方法获得微量DNA即可。由于 PCR引物之间的序列存在明显的种间差异，可以准确的获得不同物 种的特征信息。

4.应用广泛：本发明所涉及的近缘物种鉴别的方案适用于所有 物种间具有稳定的DNA序列差异的生物，杂交后代鉴定的方法适用 于所有生殖方式为父母本细胞核融合形式的生物。

5.标准通用：采用本发明所获得的结果是通过遗传物质DNA所 获得的结果，无论国内国际同行或专家都是认可相关数据的。而采 用普通的表型鉴定的方法来确定物种名称以及是否为杂交后代都很 难让人信服。

附图说明

图1采用COI-HRM方法获得的熊本牡蛎C.sikamea（曲线a）和葡萄 牙牡蛎C.angulata（曲线b）特征峰形。

图2采用本案所述的ITS-HRM方法获得的熊本牡蛎C.sikamea（曲线 b）和葡萄牙牡蛎C.angulata（曲线a）特征峰形。

图3熊本牡蛎C.sikamea和葡萄牙牡蛎C.angulata的HRM特征曲线， 以及正向杂交后代（熊本牡蛎的卵子和葡萄牙牡蛎的精子受精）和反向杂 交后代（葡萄牙牡蛎的卵子和熊本牡蛎的精子受精）的HRM曲线特征。杂 交后代同时拥有来自两方的峰。

熊本牡蛎C.sikamea（曲线b）和葡萄牙牡蛎C.angulata（曲线a）的 HRM特征曲线，以及正向杂交后代（熊本牡蛎的卵子和葡萄牙牡蛎的精子 受精，曲线c）和反向杂交后代（葡萄牙牡蛎的卵子和熊本牡蛎的精子受精， 曲线c）的HRM曲线特征。杂交后代同时拥有来自父母本两方的峰形特征。

图4熊本牡蛎C.sikamea（图片中上面两条序列）和葡萄牙牡蛎C. angulata（图片中下面两条序列）扩增产物的序列特征。后者比前者缺失了 CC位点和CCGAGGG位点，且两者之间存在一个SNP位点（C-T）。

图5采用ITS-HRM方法鉴别牡蛎样品A和B，可以得知A样品为葡 萄牙牡蛎C.angulata，而B样品为熊本牡蛎C.sikamea。

具体实施方式

本发明以贝类基因组DNA为模板，根据其来源于细胞核的生物条形码 基因序列的差异设计引物进行PCR扩增，在高分辨率熔解曲线（High  Resolution Melting，HRM）中鉴别目标个体的Tm特征值，如果个体中同 时含有两方的特征Tm值，则为杂交个体。扩增获得40bp-100bp的PCR 产物，添加核酸饱和染料后95℃变性处理10min，冷却至室温进行HRM 分析。其具体步骤为：

a.物种鉴别所依据序列的获得：从核酸数据库中下载能够鉴别目标物种 的细胞核DNA条形码序列（如ITS基因）。下载任何一个物种的序列时， 要尽量下载来自不同研究者，不同样品的尽量多的序列，以保证所寻找的 差异是物种间特异的，而非个体间存在的。

b.引物设计：比较所下载序列在物种之间的差异，寻找能够明显鉴别目 标物种的区域，在该区域周围设计PCR扩增引物，使扩增产物在物种间有 明显的序列差异，主要体现为G、C含量不同或者序列长度不同。所述序列 比对是利用NCBI的在线序列比对服务或者ClustalX软件查找两物种序列 的差异。

c.Tm值差异估算：引物设计完成后，即可获得扩增后将会得到的序列 信息。然后通过公式t=2×(A+T)+4×(G+C)估算两个物种中扩增序列的熔点 温度差异。其中A+T是碱基A和碱基T在扩增片段中的个数之和，G+C 是碱基G和碱基C在扩增片段中的个数之和。该估算结果可以比较出两个 物种扩增产物熔点的高低。

c.PCR扩增：以待鉴定目标个体的基因组DNA为模板，利用上述引物 进行PCR扩增。如果同时以两个物种中已经准确鉴定过的标准个体的基因 组DNA为模板，同时进行PCR扩增和分析会增加鉴别结果的可信度。

d.产物检测及处理：利用1%琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物， 确定扩增产物单一，无非特异性扩增后，每个反应添加1μl核酸饱和染料 LC-green（Idaho，美国），在普通PCR仪（Bioer，日本）上运行95℃变性 10min后冷却至室温。

e.高分辨率熔解曲线（HRM）分析：上述产物在荧光检测系统

Lightscanner96（Idaho，美国）平台上运行HRM，结束后利用平台上的分 析软件获得产物熔解曲线，根据溶解曲线所计算出来的Tm峰值高低，以及 上述通过公式估算得到t值高低来判断目标个体属于哪个物种。

PCR扩增引物退火温度在50℃-60℃之间，PCR产物长度控制在40 bp-100bp之间。PCR产物序列在待鉴定的不同目标物种之间有明显的Tm 值差异。PCR扩增程序为：95℃（预变性10min），95℃（变性30sec），Tm （复性30sec），72℃（延伸30sec）变性、复性、延伸三步共循环55次后 72℃后延伸10min，16℃（降温）结束。

实施例1

葡萄牙牡蛎C.angulata和熊本牡蛎C.sikamea的鉴别：

葡萄牙牡蛎在中国一些地区也称为僧帽牡蛎。这种牡蛎在中国仅分布 在长江以南沿海。是中国南方的主要经济物种，有些地区，如莆田还建立 了僧帽牡蛎（实际为葡萄牙牡蛎C.angulata）原良种场和自然保护区。同 时，熊本牡蛎C.sikamea也是长江口区域及长江以南沿海潮间带分布的主 要物种，且经常与葡萄牙牡蛎同域分布，有人把这种牡蛎也称为僧帽牡蛎。 两种牡蛎都是个体小型，容易混淆。目前常用的分子生物学鉴别方法一般 是采用线粒体COI基因序列。本案在福建莆田和江苏南通分别采集了6个 葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎，通过COI序列差异成功鉴别了两个物种（图1）。 同时设计了来自细胞核的ITS1基因引物，也成功对其实现了鉴别：

a.序列获得：在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得 葡萄牙牡蛎C.angulata和熊本牡蛎C.sikamea的ITS1序列各14条和12 条。通过ClustalX软件进行比对。

b.引物设计：检查比对后的序列，通过两个物种ITS1基因序列特 征，选取两个物种间具有稳定差异的InDel位点（图4），利用Primer  Premier5软件在该位点两侧设计PCR引物。

引物序列为：

ITS1-F1：5’-AGCGCCTTGGGCCGTCGAA-3’

ITS1-R1：5’-TGTACTTAAGGCGACGGAGC-3’

该引物在熊本牡蛎C.sikamea中扩增到的序列将是：

AGCGCCTTGGGCCGTCGAAGCCTCCTCCTCCGAGGGGCTCCGTCGCC  TTAAGTACA，在葡萄牙牡蛎C.angulata中扩增到的序列将是：

AGCGCCTTGGGCCGTCGAAGCTTTCCTGCTCCGTCGCCTTAAGTACA。 根据公式t=2×(A+T)+4×(G+C)计算，熊本牡蛎C.sikamea的t值为186， 葡萄牙牡蛎C.angulata的t值为150。因此预测熊本牡蛎C.sikamea的Tm 值会大于葡萄牙牡蛎C.angulata。

c.PCR扩增：用水煮法或者酚氯仿法提取各个个体的基因组DNA 作为模板，利用上述引物进行PCR扩增。扩增程序为：95℃（预变性 10min），55个循环的95℃（变性30sec）、55℃（复性30sec）、72℃（延 伸30sec），然后在72℃下延伸10min，4℃（保存）。

d.分析处理：每个反应添加1μl LC-green，在普通PCR仪上运行95℃ 变性10min后冷却至室温。在Lightscanner96平台上运行HRM，收集55℃ -95℃之间的荧光信号数据。结束后利用自带的分析软件将荧光信号转化 成熔解曲线峰图（图2）；从熔解曲线的峰值可以看出，6个样品（图2 曲线a）的Tm峰值为84.1℃左右，另外6个样品（图2曲线b）的Tm 峰值为87℃左右。因此产生b曲线样品的Tm值大于产生a曲线样品的 Tm值。根据步骤b.预测的结果，熊本牡蛎C.sikamea的Tm值会大于葡 萄牙牡蛎C.angulata，因此，产生b曲线的样品为熊本牡蛎C.sikamea， 而产生a曲线的样品为葡萄牙牡蛎C.angulata。该方法对熊本牡蛎和葡 萄牙牡蛎的鉴别结果与COI-HRM方法的结果完全一致。与熊本牡蛎相 比，葡萄牙牡蛎（图2a）在引物扩增位点中含有一个9bp的缺失片段， 因此其Tm值会远低于熊本牡蛎（图2b）。

本实施案例首先采用较为成熟的COI-HRM技术成功鉴别了葡萄牙 牡蛎和熊本牡蛎两个物种，同时采用本发明的技术，通过ITS1-HRM的 方式同样成功鉴别了两个物种。与COI-HRM的结果相比较，ITS1-HRM 准确率达到100%。

实施例2

两物种杂交后代的鉴定：

葡萄牙牡蛎C.angulata和熊本牡蛎C.sikamea杂交后代的鉴定：

在中国沿海很多海域，经常会出现不同近缘物种的牡蛎共同生活在同 一个海域的情况，同时，由于不同地区间互相引进非本地产的牡蛎物种， 造成大量养殖牡蛎和本地物种同时生活在一起，从而造成互相杂交的可能 性。目前尚没有确切的数据表明杂交种群体的存在，但是为了防止由于生 物入侵危害当地生物资源，物种间杂交检测是当务之急。中国厦门海域， 葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎经常生存在同一个环境下。本案例对两个物种进行 了人工杂交实验，并采用本发明所涉及的技术鉴定了两个物种杂交后代， 确定这些后代确实是融合了两个物种的遗传物质，从而证明两个物种确实 可以发生杂交现象。

本案例技术流程如下：

a.引物设计：同案例一的a。

b.PCR扩增：纯种个体的的DNA提取同案例一的b。杂交后代的 DNA提取方法为水煮法，即将单个幼虫或小于0.2mm直径的组织样品 放入含有10-20μl灭菌超纯水的PCR管中，在PCR仪（Bioer，日本） 上95℃加热30min，冷却至室温后置于-20℃冰箱中保存待用。所获 得样品DNA的PCR过程同案例一的b。

c.分析处理：在Lightscanner96平台上运行HRM的方法同同案例 一的c。HRM运行结束后利用自带的分析软件将荧光信号转化成熔解曲 线峰图。葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎的鉴别方法同案例一的c。而杂交后代 具有两个Tm峰，分别对应葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎的Tm峰（图3）。

d.通过对该位点扩增产物进行克隆测序，进一步证明，杂交后代同 时存在来自两个物种的特征序列。具体表现为，熊本牡蛎C.sikamea的 扩增条带大于葡萄牙牡蛎C.angulata。后者比前者缺失了CC位点和 CCGAGGG位点（图4），且两者之间存在一个SNP位点（C-T,图4）。

本发明所述实施例是在中国科学院海洋研究所实验室进行的。

实施例3

利用本方法鉴别近缘物种：实验前买到两种物种的牡蛎（葡萄牙牡蛎 C.angulata或熊本牡蛎C.sikamea），为确定其是否为实验所需物种，进行 以下实验，将得到的2个牡蛎分别命名为A牡蛎和B牡蛎，从外观的表征 可知其为葡萄牙牡蛎C.angulata或熊本牡蛎C.sikamea。

a.序列获得：通过在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 获得葡萄牙牡蛎C.angulata和熊本牡蛎C.sikamea的ITS1序列各14条 和12条。通过ClustalX软件进行比对。

b.引物设计：检查比对后的序列，通过两个物种ITS1基因序列特 征，选取两个物种间具有稳定差异的InDel位点（图4），利用Primer  Premier5软件在该位点两侧设计PCR引物。

引物序列为：

ITS1-F1：5’-AGCGCCTTGGGCCGTCGAA-3’

ITS1-R1：5’-TGTACTTAAGGCGACGGAGC-3’

该引物在熊本牡蛎C.sikamea中扩增到的序列将是：

AGCGCCTTGGGCCGTCGAAGCCTCCTCCTCCGAGGGGCTCCGTCGCC  TTAAGTACA，在葡萄牙牡蛎C.angulata中扩增到的序列将是：

AGCGCCTTGGGCCGTCGAAGCTTTCCTGCTCCGTCGCCTTAAGTACA。 根据公式t=2×(A+T)+4×(G+C)计算，熊本牡蛎C.sikamea的t值为186， 葡萄牙牡蛎C.angulata的t值为150。因此可知熊本牡蛎C.sikamea的Tm 值会大于葡萄牙牡蛎C.angulata。

c.PCR扩增：用水煮法或者酚氯仿法提取各个个体的基因组DNA 作为模板，利用上述引物进行PCR扩增。扩增程序为：95℃（预变性 10min），55个循环的95℃（变性30sec）、55℃（复性30sec）、72℃（延 伸30sec），然后在72℃下延伸10min，4℃（保存）。

d.分析处理：每个反应添加1μl LC-green，在普通PCR仪上运行95℃ 变性10min后冷却至室温。在Lightscanner96平台上运行HRM，收集55℃ -95℃之间的荧光信号数据。结束后利用自带的分析软件将荧光信号转化 成熔解曲线峰图（图5）；从熔解曲线的峰值可以看出，A牡蛎的曲线Tm 峰值为84.1℃左右，而B牡蛎曲线Tm峰值为87℃左右。因此可知B牡 蛎样品的Tm值大于A牡蛎样品的Tm值。根据步骤b结果可知熊本牡蛎 的Tm值大于葡萄牙牡蛎，因此，产生B牡蛎为熊本牡蛎C.sikamea，而 A牡蛎为葡萄牙牡蛎C.angulata。

结果与分析：与熊本牡蛎相比，葡萄牙牡蛎（图2a）在引物扩增位 点中含有一个9bp的缺失片段，因此其Tm值会远低于熊本牡蛎（图 2b）。